Guzmania monostachia é uma bromélia-tanque epífita que apresenta uma alta plasticidade fotossintética, sendo capaz de regular positivamente o metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) em resposta ao déficit hídrico. Também foi visto para essa espécie que o incremento do CAM se dá de forma diferente ao longo do comprimento da folha, sendo mais intenso na região apical do que na basal. Trabalhos anteriores indicaram que o óxido nítrico (NO) parece estar envolvido na regulação do CAM, mas nada se sabe dos mecanismos pelos quais isso ocorre. Uma vez que parecem não existir receptores específicos de NO, acredita-se que ele seja capaz de se ligar diretamente às proteínas, através de um processo conhecido como nitrosilação. O presente trabalho visou determinar se o NO estaria atuando na regulação do CAM em G. monostachia através da nitrosilação de proteínas relacionadas a esse metabolismo. Para tanto, foram feitos três desenhos experimentais. No primeiro, folhas destacadas de G. monostachia foram mantidas por 7 dias em água (controle) ou em uma solução contendo 30% de PEG (déficit hídrico). Durante esse período, foram monitorados parâmetros indicativos de estresse (porcentagem de água, potencial hídrico, além dos teores de clorofilas, carotenoides e proteínas), CAM (atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase - PEPC - e acúmulo noturno de malato e citrato) e emissão de NO. Todas as análises foram feitas nas porções basal e apical das folhas. Ao final dos 7 dias de escassez hídrica, também foram feitas dosagens de nitrosotióis totais e a visualização em gel de proteínas nitrosiladas na porção apical. O segundo experimento visou verificar a modulação da atividade de enzimas pela nitrosilação. Para tanto, extratos proteicos de folhas de G. monostachia foram incubados com glutationa reduzida (GSH) ou S-nitrosoglutationa (GSNO) para, em seguida,verificar diferenças nas atividades das enzimas PEPC, malato desidrogenase (MDH), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e isocitrato desidrogenase dependente de NADP+ (NADP-ICDH). No terceiro experimento foi feita a aplicação do sequestrador de NO 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) ou de NO gasoso em folhas destacadas mantidas em PEG ou água, respectivamente. Os resultados mostraram que o aumento do CAM se dá seis dias após o início do tratamento de déficit hídrico, concomitantemente com o aumento na produção de NO. Esses dois fenômenos ocorreram somente na porção apical da folha. A quantidade de proteínas nitrosiladas, no entanto, diminuiu em resposta ao déficit hídrico nesta porção, indicando que o aumento na emissão de NO pode ser oriundo de uma desnitrosilação de proteínas. De fato, a atividade de três (PEPC, APX e NADP-ICDH) das cinco enzimas analisadas mostraram uma diminuição em resposta ao tratamento com GSNO. Dessa forma, o NO parece não se ligar diretamente às enzimas do CAM para regular sua atividade. Mesmo assim, a aplicação de NO gasoso causou um aumento em todos os parâmetros relacionados ao CAM após 5 dias, sugerindo algum tipo de controle transcricional sobre genes relacionados a esse tipo de fotossíntese / Guzmania monstachia is an epiphytic tank-bromeliad capable of up-regulating CAM under water deficit. Moreover, the increase in CAM is stronger in the apical portion of the leaf, when compared to the base. Nitric oxide (NO) is a signaling molecule involved in the regulation of CAM, but the mechanisms underlying this phenomenon are still largely unknown. NO is capable of interacting with proteins through a process known as nitrosylation. Here, we investigated whether NO could regulate CAM by protein nitrosylation. In order to do so, we performed three experiments. In the first one, detached leaves were maintained for 7 days in water or in a solution containing 30% of poliethylene glycol 6000 (PEG). During this period, the water percentage, water potential, contents of chlorophylls and carotenoids, phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) activity, nocturnal malate and citrate accumulation, and NO emission were monitored daily in the basal and apical portions of the leaf. At the seventh day of the water shortage, quantification of total nitrosothiols and in-gel visualization of nitrosylated proteins were also performed in the apical portion. The second experiment consisted in incubating proteic extracts of G. monostachia with reducedglutathione (GSH) or S-nitrosoglutathione (GSNO) to assess the impact of nitrosylation in enzymatic activity. The enzymes selected to this step were PEPC, malate dehydrogenase (MDH), ascorbate peroxydase (APX), catalase (CAT) and NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP-ICDH). The third experiment consisted in the application of the NO scavenger 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) or gaseous NO to leaves maintained in water or in PEG 30%, respectively. The results show that there was an increase of both CAM and NO in the leaf apex at the sixth day of water deficit. The level of nitrosylated proteins, however, decreased in this portion, indicating that the emission of NO may be the result of a de-nitrosylation process. In fact, the activity of three (PEPC, APX and NADP-ICDH) out of five enzymes analyzed decreased with nitrosylation. Therefore, NO does not regulate directly the activity of CAM enzymes. Nevertheless, exogenous NO increased all of the assayed CAM parameters after 5 days, indicating transcriptional control of CAM-related genes

Guzmania monostachia é uma bromélia-tanque epífita que apresenta uma alta plasticidade fotossintética, sendo capaz de regular positivamente o metabolismo ácido das crassuláceas (CAM) em resposta ao déficit hídrico. Também foi visto para essa espécie que o incremento do CAM se dá de forma diferente ao longo do comprimento da folha, sendo mais intenso na região apical do que na basal. Trabalhos anteriores indicaram que o óxido nítrico (NO) parece estar envolvido na regulação do CAM, mas nada se sabe dos mecanismos pelos quais isso ocorre. Uma vez que parecem não existir receptores específicos de NO, acredita-se que ele seja capaz de se ligar diretamente às proteínas, através de um processo conhecido como nitrosilação. O presente trabalho visou determinar se o NO estaria atuando na regulação do CAM em G. monostachia através da nitrosilação de proteínas relacionadas a esse metabolismo. Para tanto, foram feitos três desenhos experimentais. No primeiro, folhas destacadas de G. monostachia foram mantidas por 7 dias em água (controle) ou em uma solução contendo 30% de PEG (déficit hídrico). Durante esse período, foram monitorados parâmetros indicativos de estresse (porcentagem de água, potencial hídrico, além dos teores de clorofilas, carotenoides e proteínas), CAM (atividade da fosfoenolpiruvato carboxilase - PEPC - e acúmulo noturno de malato e citrato) e emissão de NO. Todas as análises foram feitas nas porções basal e apical das folhas. Ao final dos 7 dias de escassez hídrica, também foram feitas dosagens de nitrosotióis totais e a visualização em gel de proteínas nitrosiladas na porção apical. O segundo experimento visou verificar a modulação da atividade de enzimas pela nitrosilação. Para tanto, extratos proteicos de folhas de G. monostachia foram incubados com glutationa reduzida (GSH) ou S-nitrosoglutationa (GSNO) para, em seguida,verificar diferenças nas atividades das enzimas PEPC, malato desidrogenase (MDH), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e isocitrato desidrogenase dependente de NADP+ (NADP-ICDH). No terceiro experimento foi feita a aplicação do sequestrador de NO 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) ou de NO gasoso em folhas destacadas mantidas em PEG ou água, respectivamente. Os resultados mostraram que o aumento do CAM se dá seis dias após o início do tratamento de déficit hídrico, concomitantemente com o aumento na produção de NO. Esses dois fenômenos ocorreram somente na porção apical da folha. A quantidade de proteínas nitrosiladas, no entanto, diminuiu em resposta ao déficit hídrico nesta porção, indicando que o aumento na emissão de NO pode ser oriundo de uma desnitrosilação de proteínas. De fato, a atividade de três (PEPC, APX e NADP-ICDH) das cinco enzimas analisadas mostraram uma diminuição em resposta ao tratamento com GSNO. Dessa forma, o NO parece não se ligar diretamente às enzimas do CAM para regular sua atividade. Mesmo assim, a aplicação de NO gasoso causou um aumento em todos os parâmetros relacionados ao CAM após 5 dias, sugerindo algum tipo de controle transcricional sobre genes relacionados a esse tipo de fotossíntese / Guzmania monstachia is an epiphytic tank-bromeliad capable of up-regulating CAM under water deficit. Moreover, the increase in CAM is stronger in the apical portion of the leaf, when compared to the base. Nitric oxide (NO) is a signaling molecule involved in the regulation of CAM, but the mechanisms underlying this phenomenon are still largely unknown. NO is capable of interacting with proteins through a process known as nitrosylation. Here, we investigated whether NO could regulate CAM by protein nitrosylation. In order to do so, we performed three experiments. In the first one, detached leaves were maintained for 7 days in water or in a solution containing 30% of poliethylene glycol 6000 (PEG). During this period, the water percentage, water potential, contents of chlorophylls and carotenoids, phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) activity, nocturnal malate and citrate accumulation, and NO emission were monitored daily in the basal and apical portions of the leaf. At the seventh day of the water shortage, quantification of total nitrosothiols and in-gel visualization of nitrosylated proteins were also performed in the apical portion. The second experiment consisted in incubating proteic extracts of G. monostachia with reducedglutathione (GSH) or S-nitrosoglutathione (GSNO) to assess the impact of nitrosylation in enzymatic activity. The enzymes selected to this step were PEPC, malate dehydrogenase (MDH), ascorbate peroxydase (APX), catalase (CAT) and NADP+-dependent isocitrate dehydrogenase (NADP-ICDH). The third experiment consisted in the application of the NO scavenger 2-(4-carboxifenil)-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido (cPTIO) or gaseous NO to leaves maintained in water or in PEG 30%, respectively. The results show that there was an increase of both CAM and NO in the leaf apex at the sixth day of water deficit. The level of nitrosylated proteins, however, decreased in this portion, indicating that the emission of NO may be the result of a de-nitrosylation process. In fact, the activity of three (PEPC, APX and NADP-ICDH) out of five enzymes analyzed decreased with nitrosylation. Therefore, NO does not regulate directly the activity of CAM enzymes. Nevertheless, exogenous NO increased all of the assayed CAM parameters after 5 days, indicating transcriptional control of CAM-related genes