Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-11T17:34:07Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 611214 bytes, checksum: b81dc7c3b36f033c49e0b05184ac1749 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-11T17:34:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 611214 bytes, checksum: b81dc7c3b36f033c49e0b05184ac1749 (MD5) Previous issue date: 2005-09-02 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Neste trabalho, foram feitos dois experimentos, conduzidos separadamente e analisados como tal, para investigar (i) os efeitos da restrição do volume radicular no crescimento e aclimatação fotossintética em Coffea arabica e (ii) os efeitos de taxas de imposição e severidade do déficit hídrico sobre a fotossíntese e metabolismo de carboidratos em C. canephora. No primeiro, plantas de C. arabica cv Catuaí Vermelho IAC 44, cultivadas em vasos de diferentes volumes (3 L - pequeno, 10 L - médio e 24 L - grande), foram avaliadas em duas épocas, aos 115 e 165 dias após o transplantio (DAT), de modo a obterem- se diferentes graus de restrição radicular. Os efeitos da alteração na relação fonte:dreno foram estudados, procurando-se investigar os possíveis mecanismos, estomáticos e não-estomáticos, de aclimatação fotossintética. O aumento da restrição radicular causou forte redução no crescimento da planta, associada ao aumento na razão raiz:parte aérea. Os tratamentos não afetaram o potencial hídrico foliar, tampouco os teores foliares de nutrientes, com exceção da concentração de N, que se reduziu fortemente com o incremento da restrição radicular, apesar da disponibilidade adequada no substrato. As taxas fotossintéticas foram severamente reduzidas pelo cultivo das plantas nos vasos de pequeno volume, devido, principalmente, a limitações não-estomáticas, e.g., redução na atividade da Rubisco. Aos 165 DAT, os teores de hexoses, sacarose e aminoácidos diminuíram, enquanto os de amido e hexoses-P aumentaram, com a redução do tamanho do vaso. As taxas fotossintéticas correlacionaram-se significativa e negativamente com a razão hexose:aminoácidos, mas não com os níveis de hexoses per se. As atividades de invertase ácida, sintase da sacarose (SuSy), sintase da sacarose-fosfato (SPS), bisfosfatase da frutose-1,6-bisfosfato (FBPase), pirofosforilase da ADP-glicose (AGPase), fosforilase do amido (SPase), desidrogenase do gliceraldeído-3-P (G3PDH), fosfofrutocinase dependente de PPi (PPi-PFK) e desidrogenase do NADP:gliceraldeído-3-P (NADP-GAPDH), e as razões 3-PGA:Pi e glicose-6-P:frutose-6-P decresceram, particularmente nas plantas sob restrição radicular severa. A aclimatação da maquinaria fotossintética não esteve relacionada a limitações diretas pela redução da síntese de produtos finais da fotossíntese, mas sim a reduções na atividade da Rubisco. Aparentemente, a aclimatação fotossintética foi reflexo do status deficiente de nitrogênio, em função do aumento da restrição radicular. No segundo experimento, plantas de C. canephora (clone 109A) também foram cultivadas em vasos de volumes contrastantes (6 L - pequeno e 24 L - grande), durante 11 meses. Em seguida, foram submetidas ao déficit hídrico, via suspensão da irrigação, aplicando-se, neste caso, duas taxas de imposição (rápida, nos vasos pequenos, e lenta, nos vasos grandes), e dois níveis de déficit hídrico: potencial hídrico na antemanhã (Ψ am ) equivalente a -2,0 MPa (déficit moderado) e - 4,0 MPa (déficit severo). Foram estudadas as respostas da maquinaria fotossintética e do metabolismo de carboidratos à seca, em função tanto da taxa de imposição como da severidade do déficit hídrico. Após suspender-se a irrigação, os níveis de déficit moderado e severo foram atingidos aos quatro e seis dias nas plantas dos vasos de 6 L, e aos 12 e 17 dias naquelas dos vasos de 24 L, respectivamente. Os tratamentos aplicados não afetaram as concentrações de clorofilas e carotenóides. Pequenas alterações nos parâmetros de fluorescência foram observadas, mas apenas nas plantas sob déficit severo, imposto lentamente. Sob déficit severo, os níveis de prolina aumentaram 31 e 212% nas plantas dos vasos pequenos e grandes, respectivamente, em relação aos das plantas-controle. A seca (Ψ am = -4,0 MPa) aumentou o extravazamento de eletrólitos em 183%, independentemente do tamanho do vaso. A taxa fotossintética reduziu-se em 44 e 96%, a Ψ w de -2,0 e -4,0 MPa, respectivamente, em relação às plantas-controle, sem, contudo, observarem-se alterações expressivas nesses parâmetros, em função das diferentes taxas de imposição do déficit hídrico. O déficit hídrico reduziu a condutância estomática e a transpiração, mas apenas quando foi severo. De modo geral, o metabolismo de carboidratos, em resposta à seca, foi afetado pela taxa de imposição do déficit hídrico. Não obstante, as atividades de enzimas- chave do metabolismo do carbono (AGPase, invertase ácida, SuSy, SPS, FBPase, G3PDH, SPase, PPi-PFK) foram pouco ou nada afetadas pelas taxas de imposição e severidade do déficit. / This work consisted of two separate experiments, and was so analysed to investigate (ii) the effects of rooting volume restriction on the growth and photosynthetic acclimation in Coffea arabica and (ii) the effect of the rate of imposition and severity of water deficit on photosynthesis and carbohydrate metabolism in C. canephora. In the first experiment, plants of C. arabica cv Red Catuaí IAC 44 were grown in small (3 L), medium (10 L) and large (24 L) pots during 115 or 165 days after transplanting (DAT), which allowed different degrees of root restriction. The effects of increasing souce:sink ratio were evaluated in order to explore possible stomatal and non-stomatal mechanisms of photosynthetic down-regulation. Increasing root restriction brought about general and great reductions in plant growth associated with a rising root:shoot ratio. Treatments did not affect leaf water potential or leaf nutrient status, with the exception of N content, which drastically dropped with increasing root restriction even though an adequate supply was available. Coffee photosynthesis was severely reduced by growing plants in small pots, what was largely associated with non- stomatal factors, e.g., decreased Rubisco activity. At 165 DAT, contents of hexose, sucrose and amino acids decreased, whereas those of starch and hexose-P increased, with smaller pots. Photosynthetic rates were negatively and significantly correlated with hexose:free amino acids ratio, but not with hexose content per se. Activities of acid invertase, sucrose synthase (SuSy), sucrose-P synthase (SPS), fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase), ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase), starch phosphorylase (SPase), glyceraldehyde-3-P dehydrogenase (G3PDH), PPi: fructose-6-P 1-phophotransferase (PPi-PFK) and NADP: glyceraldehyde-3-P dehydrogenase (NADP-GAPDH), and glycerate-3-P:Pi and glucose-6- P:fructose-6-P ratios all decreased with severe root restriction. Photosynthetic down- regulation was unlikely associated with a direct end-product limitation, but rather with decreases in Rubisco activity. Such a down-regulation was largely an expression of deficient N status triggered by growing coffee plants in small pots. In the second experiment, plants of C. canephora (clone 109A) were grown in pots of different volumes (6 L – small and 24 L – large) during 11 months, after which a drought treatment was applied. Two rates of water deficit imposition (fast in small pots, and slow in large ones), and two levels of water deficit [predawn leaf water potential, Ψ pd , of -2,0 MPa (mild) and -4,0 MPa (severe)] were considered. Responses of photosynthetic apparatus and carbohydrate metabolism to drought, as affected by both water deficit progression and severity, were investigated. Mild and severe water deficit levels were achieved at 4 and 6 days, or at 12 and 17 days, after suspending irrigation, respectively in plants grown in small and large pots. Total chlorophyll and carotenoid contents were not affected by treatments. Small changes in chlorophyll a fluorescence parameters were observed, but only in plants submitted to severe, slowly- imposed water deficit. Under severe water deficit, proline content increased both in small-pot- (31%) and large-pot-grown-plants (212%), as compared with irrigated ones. Drought (Ψ pd = - 4,0 MPa) led to increased electrolyte leakage (~183%), irrespective of pot size. Photosynthetic rates decreased by about 44 and 96%, at Ψ pd of -2,0 and -4,0 MPa, respectively, in comparison with control plants. However, only minor changes were detected in those parameters in response to the rates of water deficit progression. Stomatal conductance and leaf transpiration were significantly affected by water deficit, but only when it was severe. In general, changes in carbohydrate metabolism depended on the rate of imposition of water deficit. However, the activities of key enzymes of carbon metabolism (AGPase, acid invertase, SuSy, SPS, FBPase, G3PDH, SPase, PPi-PFK) were little affected by both the progression and severity of water deficit. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Aelson Maciera (aelsoncm@terra.com.br) on 2017-06-23T18:11:28Z No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-06-28T08:18:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ronisp@ufscar.br) on 2017-06-28T08:18:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-28T08:24:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJRFN.pdf: 1477527 bytes, checksum: cb09da4bfdd14f1e2c076f57d365b7a1 (MD5) Previous issue date: 2017-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / In recent years, the application of attenuated Salmonella spp. has been investigated for development of several biotechnological products, mainly vaccines. However, the implementation of industrial processes to obtain these products depends on the development of strategies for this microorganism high-cell density cultures (HCDC). One of the HCDC’s greatest challenges is overcoming Salmonella’s metabolic limitations, as it presents a high organic acids production (mainly acetic acid) that inhibits biomass formation. In this context, this work proposes two approaches to deal with this problem and implement Salmonella’s HCDC: studying the cultivation of S. typhimurium using glycerol as carbon source to reduce the generation of organic acids; studying the cultivation of a recombinant strain of S. typhimurium expressing the enzyme acetyl-CoA synthetase (ACS) from E. coli, for improved acetate assimilation). Initially, cultures were grown in agitated flasks in minimal media for two carbon sources (glucose or glycerol) for the wild-type and the recombinant strain. After the preliminary experiments, the recombinant strain was cultivated in bioreactor operated in batch mode with minimal medium formulated with glycerol, glucose or acetic acid as carbon source, to evaluate acetate production and assimilation. The wild-type strain was cultivated in a continuous-mode bioreactor on minimal medium with glycerol at D=0.10; 0.17 and 0.22 h-1 to evaluate the S. typhimurium glycerol metabolism. During the cultivations, samples were collected and analyzed by high-performance liquid chromatography to quantify the production of organic acids and substrate consumption. To quantify the concentration of biomass, optical density (600 nm) readings of culture broth and dry cell weight measurements were performed. Agitated flasks and batch cultivations results indicated that the acetate production is reduced in medium with glycerol for both strains, and that the genetically modified cells present a lower acetate accumulation phenotype compared to the wild-type. Continuous cultures of the wild-type strain showed no acetate accumulation for a 0.1 h-1 dilution rate. At rates of 0.17 h-1 and 0.22 h-1 acetate accumulation was observed, but acetate flux was 2-fold lower than the flux reached in chemostat with glucose-formulated medium. Simulations were performed with the STM_v1.0 model using as input data the glycerol and oxygen fluxes estimated from the experimental results. Good predictions were obtained for the biomass, CO2 and acetate fluxes at the higher dilution rates. The results suggest that fed-batch culture using glycerol as carbon source along with an exponential feed to maintain a 0.1 h-1 specific growth rate as a promising strategy to obtain high cellular concentrations of wild-type S. typhimurium. The efficient acetate uptake observed for the recombinant S. typhimurium cells may allow higher values of specific growth rate to be used for this strain, resulting in a higher productivity of biomass. / Nos últimos anos, a aplicação de linhagens atenuadas de Salmonella spp. vem sendo amplamente investigada para o desenvolvimento de diversos produtos biotecnológicos, principalmente vacinas. No entanto, a implementação de processos industriais para a obtenção destes produtos depende do desenvolvimento de estratégias para o cultivo em alta densidade celular (CADC) deste microrganismo. Para isso, um dos grandes desafios a ser superado se refere às limitações metabólicas da Salmonella, uma vez que esta apresenta elevada produção de ácidos orgânicos (principalmente ácido acético) que inibem a formação de biomassa. Neste contexto, este trabalho propõe duas abordagens para lidar com este problema e implementar CADC de Salmonella: estudar o crescimento de Salmonella typhimurium em glicerol avaliando seu metabolismo como uma fonte de carbono menos propensa à geração de ácidos orgânicos; e estudar a produção destes ácidos por uma cepa de S. typhimurium geneticamente modificada para diminuir o acúmulo de acetato (super-expressão do gene acs, de Escherichia coli, que codifica a enzima acetil-CoA sintetase (ACS) responsável pela assimilação de acetato). Inicialmente foram realizados cultivos em frascos agitados em meio mínimo para duas fontes de carbono (glicose ou glicerol), para a cepa selvagem e para a cepa recombinante. Após os experimentos preliminares, foram realizados cultivos em biorreator operado em modo batelada com a cepa modificada em meio mínimo formulado com glicerol, glicose ou ácido acético, como fonte de carbono, a fim de avaliar a produção e a assimilação de acetato. Foram realizados cultivos em biorreator em modo contínuo com a cepa selvagem em meio mínimo com glicerol com D=0,10; 0,17 e 0,22 h-1 para avaliar o metabolismo do glicerol pela S. typhimurium. Ao longo dos cultivos foram coletadas amostras do caldo e analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência para quantificar a produção de ácidos orgânicos e o consumo de substrato. Para quantificar a biomassa produzida, foram realizadas medidas de densidade ótica (600 nm) e de massa seca. Os resultados dos cultivos em frascos agitados e das bateladas indicam que, para ambas as cepas, a produção de acetato é reduzida em meio formulado com glicerol, e que as células modificadas geneticamente apresentam um fenótipo de menor acúmulo de acetato comparadas à linhagem selvagem. Os cultivos contínuos realizados com a cepa selvagem mostraram que não houve acúmulo de acetato para a taxa de diluição de 0,1 h-1. Já nas taxas de 0,17 h-1 e 0,22 h-1, apesar de haver acúmulo, o fluxo de produção de acetato foi cerca de 2 vezes menor que o observado em quimiostato em meio formulado com glicose. Foram realizadas simulações com o modelo STM_v1.0, tendo como dados de entrada os fluxos de glicerol e de oxigênio estimados a partir dos dados experimentais. O modelo descreveu bem os fluxos de biomassa, CO2 e acetato para as taxas de diluição mais altas. Os resultados obtidos sugerem o cultivo em batelada alimentada com glicerol como fonte de carbono, e alimentação exponencial definida para manter a velocidade específica de crescimento em 0,1 h-1, como uma estratégia promissora para obter altas concentrações celulares de S. typhimurium selvagem. Para a S. typhimurium recombinante, devido à sua eficiente assimilação de acetato, valores ainda maiores de velocidade específica de crescimento poderiam ser impostos, com elevado aumento de produtividade em biomassa.

Made available in DSpace on 2017-07-10T17:40:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane_Claudia_Meinerz.pdf: 1140657 bytes, checksum: 515f23cafb30196ea1e4641ed2debc7d (MD5) Previous issue date: 2013-08-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Induced resistance involves the activation of latent defense mechanisms existing in plants in response to treatment with biotic or abiotic agents. The use of plant extracts in order to induce resistance mechanisms is an attractive alternative to chemical control, however, these extracts may occur the presence of inducer, as well ass the presence of suppressor. This study aimed to evaluate biochemical, physiological and growth of sorghum (Sorghum bicolor L.) treated with extracts of Rosmarinus officinalis, Curcuma longa and Pycnoporus sanguineus. It was evaluated the induction of phytoalexins deoxiantocianidinas, peroxidase, polyphenol oxidase, phenylalanine ammonia lyase, β-1,3 glucanase and chitinase, carbon metabolism (photosynthesis and respiration) and growth of sorghum plants. Mesocotyls sorghum were treated with the fungal and plant extracts, and acibenzolar-S-methyl (ASM) (125 mg L-1 elicitor would like reference) and distilled water. Sorghum seedlings were treated with the inducers and at 24, 48, 96 and 144 hours samples were taken for analyzes of defense enzymes. Evaluations of gas exchange were conducted periodically over 7 days with three days interval of application of foliar treatments. Were determined rate of net CO2 assimilation (A, CO2 mol m-2s-1), stomatal conductance (gs mmol H2O m-2s-1), sweating (E, H2O mmol m-2s-1) efficiency Water use (U.S. mol m-2s-1) and intrinsic efficiency of the use of water (EIUA, mol m-2s-1). For growth analysis, carried out 120 days after sowing, the parameters evaluated were: fresh leaves and roots, dry weight of leaves and roots and root volume. The parameters for production analysis were the number of panicle, seed number, mean grain mass and total production. Biotic inducers rosemary, turmeric and Pycnoporus sanguineus induced phytoalexins in mesocotyls and biochemical activities in different cultivars of sorghum, may note that the results reveal an important target for the action of elicitors in these extracts. Overall, rosemary extract caused increase in peroxidase, polyphenol oxidase and phenylalanine ammonia lyase activities, the turmeric extract induced phenylalanine ammonia-lyase activity and the extract of P. sanguineus polyphenol oxidase and β-1,3 glucanase activities. ASM interfere with the metabolism of BRS 610 sorghum in relation to the efficiency of water use (U.S.) and intrinsic efficiency of water use (EIUA), without interfering with productivity, improving the quality of production and improving markedly the number of panicle, panicle, grain number and grain weight. The fungal and plant extracts did not affect these parameters. It was possible to induce defense mechanisms in sorghum by application of extracts of rosemary, turmeric and P. sanguineus, which may allow the obtention of new molecules, and the development of alternative methods for controlling plant diseases / A indução de resistência envolve a ativação de mecanismos de defesa latentes existentes nas plantas em resposta ao tratamento com agentes bióticos ou abióticos. A aplicação de extratos vegetais visando à indução de mecanismos de resistência é uma alternativa interessante ao controle químico, entretanto, nestes extratos pode ocorrer além da presença de indutores, a presença de supressores. Este trabalho teve por objetivo avaliar aspectos bioquímicos, fisiológico e de crescimento de sorgo (Sorghum bicolor L.) tratado com extratos de Rosmarinus officinalis, Curcuma longa e Pycnoporus sanguineus. Foram avaliados a indução de fitoalexinas deoxiantocianidinas, enzimas peroxidase, polifenoloxidase, fenilalanina amônia-liase, β-1,3 glucanase e quitinase, metabolismo de carbono (fotossíntese e respiração) e crescimento de plantas de sorgo. Mesocótilos de sorgo foram tratados com os extratos vegetais e fúngico, além de acibenzolar-S-metil (ASM) (125 mg L-1 do i.a. como elicitor de referência) e água destilada. Plântulas de sorgo foram tratadas com os indutores e às 24, 48, 96 e 144 horas foram retiradas amostras para as análises das enzimas de defesa. As avaliações de trocas gasosas foram realizadas periodicamente no período de 7 dias, com três dias de intervalo da aplicação dos tratamentos via foliar. Foram determinados: taxas de assimilação líquida de CO2 (A, μmol CO2 m-2s-1), condutância estomática (gs, mmol H2O m-2s-1), transpiração (E, mmol H2O m-2s-1), eficiência do uso de água (EUA, mol m-2s-1) e eficiência intrínseca do uso de água (EIUA, mol m-2s-1). Para análise de crescimento, realizada 120 dias após a semeadura, os parâmetros avaliados foram: massa fresca das folhas e raízes; massa seca das folhas e raízes e volume de raiz. Os parâmetros avaliados na análise de produção foram: número de panícula, número de sementes; massa média de grão e produção total. Os indutores bióticos alecrim, cúrcuma e Pycnoporus sanguineus induziram fitoalexinas em mesocótilos e atividades bioquímicas nas diferentes cultivares de sorgo, podendo ressaltar que os resultados revelam um importante alvo de ação de elicitores presentes nesses extratos. De forma geral, o extrato de alecrim causou incremento na atididade de peroxidase, polifenoloxidase e fenilalanina amônia-liase; o extrato de cúrcuma induziu a atividade de fenilalanina amônia-liase e o extrato de P. sanguineus as atividades de polifenoloxidase e β-1,3 glucanase. O indutor ASM interferiu no metabolismo da cultivar BRS 610 de sorgo em relação à eficiência do uso da água (EUA) e eficiência intrínseca do uso da água (EIUA), sem interferir na produtividade, melhorando a qualidade da produção e melhorando acentuadamente o número de panícula, massa de panículas, número de grãos e massa de grãos. Os extratos vegetais e fúngico não interferiram nesses parâmetros. Foi possível induzir mecanismos de defesa em sorgo pela aplicação dos extratos de alecrim, cúrcuma e P. sanguineus, o que pode permitir a obtenção de novas moléculas e o desenvolvimento de métodos alternativos para controle de doenças em plantas

Submitted by Maria Beatriz Vieira (mbeatriz.vieira@gmail.com) on 2017-06-22T16:51:34Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_junior_borella.pdf: 3753354 bytes, checksum: 6f336478c32b30a019b543871b0367e6 (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-22T20:38:33Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_junior_borella.pdf: 3753354 bytes, checksum: 6f336478c32b30a019b543871b0367e6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-22T20:38:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) tese_junior_borella.pdf: 3753354 bytes, checksum: 6f336478c32b30a019b543871b0367e6 (MD5) Previous issue date: 2015-05-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / O alagamento é um fator ambiental comum que causa deficiência de oxigênio às plantas, levando a uma inibição da respiração e redução do status energético celular, desencadeando uma série de mudanças no metabolismo do carbono e do nitrogênio. Além disso, alterações no fluxo de elétrons da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial e cloroplastídica levam a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) que podem ocasionar vários danos ao metabolismo celular. No entanto, a aplicação exógena de nitrato tem sido reportada por promover efeitos benéficos em muitas espécies de plantas sob condições de hipóxia. Embora muitos estudos tenham sido envidados com soja, pouco se sabe a respeito das alterações metabólicas primárias do carbono e do nitrogênio que permitem diferenciar genótipos contrastantes ao alagamento e os efeitos no sistema antioxidante pela aplicação exógena de nitrato nas plantas. Considerando o exposto, os objetivos deste trabalho foram: I – avaliar mudanças no metabolismo do carbono e do nitrogênio e sua relação com a enzima alanina aminotransferase (AlaAT) em genótipos de soja nodulada; II – verificar possíveis efeitos benéficos no metabolismo antioxidante em plantas cultivadas na presença de nitrato (plantas não-noduladas) e na ausência de nitrato (plantas noduladas). Para isso, dois experimentos foram conduzidos em casa de vegetação com plantas de soja (Glycine max (L.) Merril) sob condições naturais de luz e temperatura. Experimento I: plantas noduladas de soja, nutridas na ausência de N mineral (Fundacep 53 RR – tolerante e BRS Macota – sensível) foram cultivadas em vermiculita e transferidas para sistema hidropônico, no estádio reprodutivo R2. O sistema radicular das plantas foi submetido à hipóxia pelo borbulhamento de nitrogênio gasoso na solução nutritiva diluída 1/3 da concentração normal, por 24 e 72 h. Para recuperação, após 72 h de hipóxia as plantas retornaram para vermiculita por 24 e 72 h. Foram avaliados, em raízes e nódulos, metabólitos fermentativos e ácidos orgânicos (GC-MS), aminoácidos (HPLC), expressão relativa dos genes (RT-PCR) e atividade da enzima AlaAT. Fundacep 53 RR acumulou mais teores de piruvato e lactato que BRS Macota e embora a composição de aminoácidos não tenha diferido entre os genótipos, foi observado uma ligação entre a glicólise e o ciclo dos ácidos tricarboxílicos via indução dos genes e atividade da AlaAT, que, posteriormente, levou ao acúmulo de succinato em raízes de Fundacep 53 RR, podendo aumentar o ganho energético em relação à BRS Macota sob hipóxia. Experimento II: A condução experimental adotada foi semelhante ao experimento I, no entanto conduzido com plantas noduladas e não-noduladas (nutridas com nitrato) de soja, de ambos os genótipos. Foi avaliado o sistema antioxidante em raízes e folhas através da atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT), glutationa redutase (GR), guaiacol peroxidase (GPOD) e glutationa S-transferase (GST), o conteúdo de ascorbato reduzido e ascorbato total, bem como conteúdo de superóxido (O2), peróxido de hidrogênio (H2O2) e peroxidação de lipídeos. O sistema antioxidante foi fortemente induzido nas raízes das plantas nutridas com nitrato de ambos os genótipos, com elevada atividade de SOD, APX, CAT, GR e GPOD, bem como o aumento do conteúdo de ascorbado reduzido e total e diminuição da produção de EROs em condições de hipóxia e de recuperação, enquanto que nas folhas de plantas noduladas e não-noduladas foi observado um ligeiro aumento nos componentes enzimáticos e não enzimáticos antioxidantes. O nitrato exerce efeitos benéficos em plantas de soja em condições de hipóxia e consequentemente na recuperação por induzir o sistema antioxidante nas raízes, permitindo modular os possíveis danos oxidativos causados pela produção de EROs, além de poder prolongar a tolerância dessas plantas. / Waterlogging is a common environmental stress which causes oxygen deprivation in plants leading to an inhibition of the mitochondrial respiration. It leads to a reduction of cellular energy status triggering changes at different levels of carbon and nitrogen metabolism. In addition, it leads to electron scape from the mitochondrial and chloroplast electron transport chain, producing reactive oxygen species (ROS) which cause severe oxidative damage to cells. However, exogenous nitrate supply has been reported to promoting beneficial effects in several plant species under hypoxic conditions. Although many studies have been carried out with soybean, a little is known about the primary metabolic changes in carbon and nitrogen metabolism, which may differ between tolerant and sensitive plant genotypes in response to waterlogging and the effects on antioxidant system in nitrate-supplied plants in comparison to non-nitrate-supplied plants. Thus, the aims of this study were: I – to evaluate the hypoxia-induced alterations of carbon and nitrogen metabolism and its relation with alanine aminotransferase (AlaAT) enzyme in nodulated soybean genotypes; II – to verify possible beneficial effects on antioxidant metabolism in nitrate-supplied plants (non-nodulated plants) in comparison to plants growing in absence of nitrate (nodulated plants). For that, two experiments were carried out in greenhouse under natural light and temperature conditions. Experiment I: Nodulated soybean plants (Fundacep 53 RR – tolerant and BRS Macota – sensitive) were grown in vermiculite and transferred to hydroponic system at reproductive stage. Root system was subjected to hypoxia by flushing N2 gas into the solution for 24 or 72 h. For the recovery, after 72 h in hypoxia, plants returned to normoxic conditions by transferring back to vermiculite for 24 and 72 h. Root and nodule organic acids and amino acids were analysed by gas chromatography-mass spectrometry and high-performance liquid chromatography, respectively. Relative expression of AlaAT (qRT-PCR) and AlaAT activity were also verified in both genotypes. Plants of Fundacep 53 RR and BRS Macota genotypes responded distinctly upon hypoxia. Fundacep 53 RR presented higher pyruvate and lactate accumulation than BRS Macota, which is indicative of higher glycolytic and fermentation rates in root tissues. Furthermore, Fundacep 53 RR responds more effectively to the recovery by restoring pre-hypoxic levels of the metabolites. Although the amino acid composition did not differ between the genotypes, there was a clear link between glycolysis and the TCA via increase of gene expression and activity of AlaAT enzyme by leading a succinate accumulation in Fundacep 53 RR, wich represents a metabolic advantage compared to BRS Macota under hypoxic stress. Experiment II: was carried out in a similar way of Experiment I, however with plants growing in presence (non-nodulated) and absence (nodulated) of nitrate, for both soybean genotypes. Superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT), glutathione reductase (GR), guayacol peroxidase (GPOD) and glutathione S-transferase (GST) enzymes; reduced ascorbate and ascorbate redox state; superoxide content (O2•-), hydrogen peroxide (H2O2) and lipid peroxidation were analysed in roots and leaves of both soybean genotypes. Antioxidative system was strongly induced in roots of nitrate-supplied plants of both genotypes, with high activity of superoxide dismutase (SOD), ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT), glutathione reductase (GR) and guayacol peroxidase (GPOD), as well as increased ascorbate reduced and ascorbate redox state and decreased ROS production under hypoxia and recovery, while in leaves of nodulated and non-nodulated plants a slight increase on antioxidant system was observed. Furthermore, the results did not show tolerance differences between the genotypes. Nitrate exerts beneficial effects in soybean plants under hypoxic conditions and consequent recovery by inducing the antioxidant system manly in roots, to cope possible oxidative damage caused by ROS production and also can postpone the effects of hypoxia in both genotypes.

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No. of bitstreams: 1 TeseCRS.pdf: 3506039 bytes, checksum: 68f4c5fe1c6ae3672adcedf3450e2f31 (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / The genus Salmonella spp. has been extensively investigated because these bacteria are important pathogens that frequently cause severe diseases and gastrointestinal infections in humans and animals. Moreover, in recent years, Salmonella has called attention due to the excellent results in the production and in vivo delivery of various substances with potential application in Vaccinology. However, there is still little information available concerning aspects of its metabolism, which hampers both the development of new attenuated strains and the large-scale production of live cells and cellular components. Thus, this work aimed to study the S. typhimurium LT2 metabolism, using traditional and innovative approaches to investigate different carbon sources as well as different bioreactor operation modes and aeration conditions (aerobic and anaerobic). Results obtained in batch and chemostat cultivations indicated that S. typhimurium metabolism differs significantly from E. coli metabolism, closely related bacteria species with regard to the central carbon metabolism. The main difference observed between these bacteria was the high level of acetate production exhibited by S. typhimurium LT2 cells, which, differently from E. coli, occurred even at the lowest dilution rate evaluated. Currently, genome scale metabolic models are important tools for better understanding the phenotypic behavior of many organisms. Therefore the model STM_v1.0 reconstructed for S. typhimurium LT2 was evaluated, comparing experimental data, obtained in chemostat cultivations, with model predictions. Since this model was derived from E. coli model, the simulated results for biomass formation were overestimated and, consequently, predicted acetate fluxes were lower than those obtained experimentally. Therefore, to obtain experimental data useful to improve the model and to reach a better comprehension of S. typhimurium metabolism, the technique of metabolic flux analysis using isotopic labeled substrate was adopted, allowing determination of the fluxes for the main pathways of central carbon metabolism of Salmonella. This analysis revealed different preferred metabolic pathways depending on the specific growth rate. At the lowest dilution rate evaluated, D = 0.24 h-1, glucose was catabolized predominantly by the pentose phosphate and glycolysis pathways, while at the dilution rate of 0.48 h-1, the major pathway of glucose oxidation was Entner-Doudoroff. In addition, a relatively high flux through the citric acid cycle at the higher dilution rate studied was observed. / Bactérias do gênero Salmonella spp. são extensivamente estudadas por serem importantes patógenos, causando frequentemente graves doenças e infecções gastrointestinais em humanos e animais. Além disso, nos últimos anos, estas bactérias vêm ganhando um destaque ainda maior na área da biotecnologia por apresentarem ótimos resultados na produção e veiculação in vivo de diversas substâncias com fins vacinais. No entanto, ainda há poucas informações a respeito de seu metabolismo, dificultando tanto o desenvolvimento de novas linhagens atenuadas, como também a produção em larga escala de células vivas e de componentes celulares. Neste sentido, este trabalho se propôs a estudar o metabolismo de S. typhimurium LT2, utilizando inicialmente abordagens tradicionais para investigar seu comportamento na presença de diferentes fontes de carbono, em diferentes modos de operação de biorreator e de aeração (aeróbias e anaeróbias). Os resultados obtidos em cultivos em batelada e em quimiostatos evidenciaram que o metabolismo da S. typhimurium difere bastante do metabolismo da E. coli, espécies consideradas semelhantes com relação ao metabolismo do carbono central. A principal diferença observada entre essas duas bactérias foi a elevada produção de acetato pelas células de S. typhimurium LT2, mesmo em baixas velocidades de crescimento nas quais este metabólito não é produzido por diversas estirpes de E. coli. Atualmente, modelos metabólicos em escala genômica são ferramentas importantes para que o comportamento do fenótipo de diversos organismos sejam melhor compreendidos. Assim, avaliou-se o modelo STM_v1.0 reconstruído para S. typhimurium LT2, comparando-se dados obtidos experimentalmente, em quimiostatos, e os preditos pelo modelo. No entanto, como este modelo foi baseado no modelo da E. coli, os resultados simulados para produção de biomassa foram superestimados e, consequentemente, os fluxos de acetato foram inferiores aos obtidos experimentalmente. Sendo assim, para se obter dados experimentais úteis para aprimorar o modelo e para uma compreensão maior do metabolismo de S. typhimurium, utilizou-se a técnica de análise dos fluxos metabólicos com substrato isotopicamente marcado, permitindo a determinação dos fluxos das principais vias do metabolismo do carbono central da bactéria em estudo. Essa análise revelou diferenças na utilização das vias metabólicas em função da velocidade específica de crescimento, sendo que na menor taxa de diluição avaliada, D = 0,24 h-1, a glicose foi predominantemente catabolizada pelas vias pentose fosfato e glicólise, enquanto na taxa de diluição de 0,48 h-1, a via principal de oxidação da glicose foi a Entner- Doudoroff. Além disso, também observou-se um fluxo relativamente maior na via do ciclo do ácido cítrico na maior taxa de diluição estudada.