The uptake of nutrients and their subsequent chemical conversion by reactions which provide energy and building blocks for growth and propagation is a fundamental property of life. This property is termed metabolism. In the course of evolution life has been dependent on chemical reactions which generate molecules that are common and indispensable to all life forms. These molecules are the so-called primary metabolites. In addition, life has evolved highly diverse biochemical reactions. These reactions allow organisms to produce unique molecules, the so-called secondary metabolites, which provide a competitive advantage for survival. The sum of all metabolites produced by the complex network of reactions within an organism has since 1998 been called the metabolome. The size of the metabolome can only be estimated and may range from less than 1,000 metabolites in unicellular organisms to approximately 200,000 in the whole plant kingdom. In current biology, three additional types of molecules are thought to be important to the understanding of the phenomena of life: (1) the proteins, in other words the proteome, including enzymes which perform the metabolic reactions, (2) the ribonucleic acids (RNAs) which constitute the so-called transcriptome, and (3) all genes of the genome which are encoded within the double strands of desoxyribonucleic acid (DNA). Investigations of each of these molecular levels of life require analytical technologies which should best enable the comprehensive analysis of all proteins, RNAs, et cetera. At the beginning of this thesis such analytical technologies were available for DNA, RNA and proteins, but not for metabolites. Therefore, this thesis was dedicated to the implementation of the gas chromatography – mass spectrometry technology, in short GC-MS, for the in-parallel analysis of as many metabolites as possible. Today GC-MS is one of the most widely applied technologies and indispensable for the efficient profiling of primary metabolites. The main achievements and research topics of this work can be divided into technological advances and novel insights into the metabolic mechanisms which allow plants to cope with environmental stresses. Firstly, the GC-MS profiling technology has been highly automated and standardized. The major technological achievements were (1) substantial contributions to the development of automated and, within the limits of GC-MS, comprehensive chemical analysis, (2) contributions to the implementation of time of flight mass spectrometry for GC-MS based metabolite profiling, (3) the creation of a software platform for reproducible GC-MS data processing, named TagFinder, and (4) the establishment of an internationally coordinated library of mass spectra which allows the identification of metabolites in diverse and complex biological samples. In addition, the Golm Metabolome Database (GMD) has been initiated to harbor this library and to cope with the increasing amount of generated profiling data. This database makes publicly available all chemical information essential for GC-MS profiling and has been extended to a global resource of GC-MS based metabolite profiles. Querying the concentration changes of hundreds of known and yet non-identified metabolites has recently been enabled by uploading standardized, TagFinder-processed data. Long-term technological aims have been pursued with the central aims (1) to enhance the precision of absolute and relative quantification and (2) to enable the combined analysis of metabolite concentrations and metabolic flux. In contrast to concentrations which provide information on metabolite amounts, flux analysis provides information on the speed of biochemical reactions or reaction sequences, for example on the rate of CO2 conversion into metabolites. This conversion is an essential function of plants which is the basis of life on earth. Secondly, GC-MS based metabolite profiling technology has been continuously applied to advance plant stress physiology. These efforts have yielded a detailed description of and new functional insights into metabolic changes in response to high and low temperatures as well as common and divergent responses to salt stress among higher plants, such as Arabidopsis thaliana, Lotus japonicus and rice (Oryza sativa). Time course analysis after temperature stress and investigations into salt dosage responses indicated that metabolism changed in a gradual manner rather than by stepwise transitions between fixed states. In agreement with these observations, metabolite profiles of the model plant Lotus japonicus, when exposed to increased soil salinity, were demonstrated to have a highly predictive power for both NaCl accumulation and plant biomass. Thus, it may be possible to use GC-MS based metabolite profiling as a breeding tool to support the selection of individual plants that cope best with salt stress or other environmental challenges. / Die Aufnahme von Nährstoffen und ihre chemische Umwandlung mittels Reaktionen, die Energie und Baustoffe für Wachstum und Vermehrung bereitstellen, ist eine grundlegende Eigenschaft des Lebens. Diese Eigenschaft wird Stoffwechsel oder, wie im Folgenden, Metabolismus genannt. Im Verlauf der Evolution war alles Leben abhängig von solchen Reaktionen, die essentielle und allen Lebensformen gemeinsame Moleküle erzeugen. Über diese sogenannten Primärmetabolite hinaus sind hochdiverse Reaktionen entstanden. Diese erlauben Organismen, einzigartige sogenannte Sekundärmetabolite zu produzieren, die in der Regel einen zusätzlichen Überlebensvorteil vermitteln. Die Gesamtheit aller Metabolite, die von dem komplexen Reaktionsnetzwerk in Organismen erzeugt werden, nennt man seit 1998 das Metabolom. Die Größe des Metaboloms kann nur geschätzt werden. Neben der Gesamtheit aller Metabolite werden heute drei weitere Arten an Molekülen als wesentlich betrachtet, um die Phänomene des Lebens zu verstehen: erstens die Proteine, deren Summe, das Proteom, auch die Enzyme einschließt, die die obigen metabolischen Reaktionen durchführen, zweitens die Ribonukleinsäuren (RNS), deren Gesamtheit als Transkriptom bezeichnet wird, und drittens die doppelsträngige Desoxyribonukleinsäure (DNS), die das Genom, die Summe aller Gene eines Organismus, ausmacht. Die Untersuchung aller dieser vier molekularen Ebenen des Lebens erfordert Technologien, die idealerweise die vollständige Analyse der Gesamtheit aller DNS-, RNS-, Protein-Moleküle, bzw. Metabolite erlauben. Zu Beginn meiner Arbeiten waren solche Technologien für DNS, RNS, und Proteine verfügbar, aber nicht für Metabolite. Aus diesem Grund habe ich meine Forschungstätigkeit auf das Ziel ausgerichtet, so viele Metabolite wie irgend möglich in einer gemeinsamen Analyse zu erfassen. Zu diesem Zweck habe ich mich auf eine einzelne Technik, nämlich die gekoppelte Gaschromatographie und Massenspektrometrie, kurz GC-MS, konzentriert. Nicht zuletzt durch meine Arbeiten ist GC-MS heute eine der am häufigsten angewandten Technologien und unverzichtbar für das breite Durchmustern der Metabolite. Neben der Etablierung der grundlegenden GC-MS-Profilanalyse-Technologie liegen die Haupterrungenschaften meiner Arbeiten sowohl in den technischen Neuerungen als auch in den Einsichten in metabolische Mechanismen, die es Pflanzen erlauben, erfolgreich auf Umwelteinflüsse zu reagieren. Die technologischen Errungenschaften waren erstens wesentliche Beiträge zur Labor-Automatisierung und zur Auswertung von modernen, auf Flugzeitmassenspektrometrie beruhenden, GC-MS-Profilanalysen, zweitens die Entwicklung einer entsprechenden Prozessierungs-Software, genannt TagFinder, und drittens die Etablierung einer internationalen Datensammlung zur Metabolitidentifizierung aus komplexen Mischungen. Diese massenspektralen und gaschromatographischen Daten haben seit 2005 Eingang in die von mir initiierte Entwicklung der Golm Metabolom Datenbank (GMD) gefunden, die die zunehmend wachsenden GC-MS-Referenzdaten wie auch die Metabolitprofildaten verwaltet und öffentlich zugänglich macht. Darüber hinaus wurden die langfristigen Ziele einer verbesserten Präzision für relative und absolute Quantifizierung wie auch einer Kopplung von Konzentrationsbestimmung und metabolischen Flussanalysen mittels GC-MS verfolgt. Sowohl die Stoffmengen als auch die Geschwindigkeit der Stoffaufnahme und der chemischen Umsetzung, d.h. der metabolische Fluss, sind wesentlich für neue biologische Einsichten. In diesem Zusammenhang wurde von mir die Aufnahme von CO2 durch Pflanzen, der Basis allen Lebens auf der Erde, untersucht. Angewandt auf das Temperaturstress- und Salzstressverhalten von Modell- und Kulturpflanzen, nämlich des Ackerschmalwands (Arabidopsis thaliana), des Hornklees (Lotus japonicus) und der global bedeutendsten Nutzpflanze Reis (Oryza sativa), wurden detaillierte und vergleichende neue metabolische Einsichten in den Zeitverlauf der Temperaturanpassung und die Anpassung an zunehmend salzhaltige Böden erzielt. Metabolismus verändert sich unter diesen Bedingungen allmählich fortschreitend und nicht in plötzlichen Übergängen. Am Beispiel des Hornklees konnte gezeigt werden, dass Metabolitprofilanalysen eine hohe Vorhersagekraft für die Biomasseerzeugung unter Salzeinfluss wie auch für die Aufnahme von Salz durch die Pflanze haben. So mag es in Zukunft möglich werden, GC-MS-Profilanaysen anzuwenden, um den Züchtungsprozess von Kulturpflanzen zu beschleunigen.

Background: Tumor cells are highly dependent on glucose even in the presence of oxygen. This concept called the Warburg effect is a hallmark of cancer and strategies are considered to therapeutically exploit the phenomenon such as ketogenic diets. The success of such strategies is dependent on a profound understanding of tumor cell metabolism. With new techniques it is now possible to thoroughly analyze the metabolic responses to the withdrawal of substrates and their substitution by others. In the present study we used gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to analyze how glioblastoma brain tumor cells respond metabolically when glucose is withdrawn and substituted by pyruvate. Methods: Glioblastoma brain tumor cells were cultivated in medium with high (25 mM), medium (11 mM) or low (5.5 mM) glucose concentration or with pyruvate (5 mM). After 24 h GC-MS metabolite profiling was performed. Results: The abundances of most metabolites were dependent on the supply of glucose in tendency but not in a linear manner indicating saturation at high glucose. Noteworthy, a high level of sorbitol production and release was observed at high concentrations of glucose and high release of alanine, aspartate and citrate were observed when glucose was substituted by pyruvate. Intermediates of the TCA cycle were present under all nutritional conditions and evidence was found that cells may perform gluconeogenesis from pyruvate. Conclusions: Our experiments reveal a high plasticity of glioblastoma cells to changes in nutritional supply which has to be taken into account in clinical trials in which specific diets are considered for therapy.

Background: Tumor cells are highly dependent on glucose even in the presence of oxygen. This concept called the Warburg effect is a hallmark of cancer and strategies are considered to therapeutically exploit the phenomenon such as ketogenic diets. The success of such strategies is dependent on a profound understanding of tumor cell metabolism. With new techniques it is now possible to thoroughly analyze the metabolic responses to the withdrawal of substrates and their substitution by others. In the present study we used gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) to analyze how glioblastoma brain tumor cells respond metabolically when glucose is withdrawn and substituted by pyruvate. Methods: Glioblastoma brain tumor cells were cultivated in medium with high (25 mM), medium (11 mM) or low (5.5 mM) glucose concentration or with pyruvate (5 mM). After 24 h GC-MS metabolite profiling was performed. Results: The abundances of most metabolites were dependent on the supply of glucose in tendency but not in a linear manner indicating saturation at high glucose. Noteworthy, a high level of sorbitol production and release was observed at high concentrations of glucose and high release of alanine, aspartate and citrate were observed when glucose was substituted by pyruvate. Intermediates of the TCA cycle were present under all nutritional conditions and evidence was found that cells may perform gluconeogenesis from pyruvate. Conclusions: Our experiments reveal a high plasticity of glioblastoma cells to changes in nutritional supply which has to be taken into account in clinical trials in which specific diets are considered for therapy.

Die Behandlung von Fettleibigkeit mittels Ernährungsumstellung und Änderung des Lebensstils zeigt keinen großen Erfolg bei der Eindämmung der Adipositas-Epidemie. Weitere Untersuchungen von Adipositas und der damit verbundenen Prozesse eröffnen die Möglichkeit, die Pathophysiologie der Fettleibigkeit besser zu verstehen und so neue therapeutische Ansätze und neue metabolische Regulatoren entwickeln zu können. Da Adipositas eine metabolische Erkrankung ist, wurde in dieser Arbeit untersucht, ob und wie sich die Veränderungen, die mit Adipositas assoziiert sind und während dieser Erkrankung nicht nur im Fettgewebe, sondern in dem gesamten Organismus entstehen, auf den Metabolismus der Monozyten und auf ihre Funktionen auswirken. Mit den beschriebenen Methoden wurden Unterschiede im Metabolismus und in der ROS-Produktion zwischen den Monozyten von normalgewichtigen Kontrollen und Adipositas-Patienten nachgewiesen, während sich die anderen untersuchten Zellfunktionen, wie Phagozytose und Zytokinproduktion (angesehen von IL-8) nicht voneinander unterschieden. Die Resultate zeigten, dass Adipositas und die damit einhergehende chronische Entzündung zu einer Veränderung des Metabolismus der peripheren Monozyten führt. In Monozyten von Adipositas-Patienten konnten ein verändertes Proteinexpressionsmuster, eine erhöhte Glykolyse und ATP-Produktion sowie daraus resultierend eine gesteigerte Bildung von Lipidtropfen festgestellt werden. Abgesehen von Hexokinase I zeigten die Monozyten von Adipositas-Patienten eine niedrige Proteinexpression der glykolytischen Enzyme und der Enzyme des Pentosephosphatweges sowie des Citratzyklus und sie erreichten trotzdem eine hohe Konzentration von intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsel und eine erhöhte Glykolyse, was sicherlich auf das erhöhte Glukose-Angebot zurückzuführen ist. Der verstärkte Pentosephosphatweg steigert die NADPH-Konzentration, die mit Diabetes assoziiert ist und zur Zunahme der Fettsäuresynthese und der ROS-Produktion führen kann. Die exzessive Lipidakkumulation ist ein mit der Fettleibigkeit assoziiertes Merkmal, welches nicht nur im Fettgewebe, sondern auch in nicht-adipösen Geweben beobachtet wird. Die erhöhte Lipidtropfenanzahl, die in Monozyten von Adipositas-Patienten nachgewiesen wurde, kann zu dem aus einer verstärkten Fettsäuresynthese resultieren, die vor allem dann aktiviert wird, wenn der Zelle genügend Energie und Kohlenhydrate zur Verfügung stehen. Diese Fettsäurereserven werden dann von Zellen unter glukosearmen Bedingungen für die Energiegewinnung verwendet. In aktivierten Monozyten von Adipositas-Patienten konnte unter glukosearmen Bedingungen trotz des verringerten Kohlenhydratstoffwechsels eine erhöhte ATP-Produktion im Vergleich zu den gesunden, normalgewichtigen Kontrollen nachgewiesen werden, was darauf schließen lässt, dass vorhandene Lipidtropfen für die Energiegewinnung verwendet wurden. Die bei Adipositas-Patienten beobachteten metabolischen Veränderungen in den Energiegewinnungsprozessen bzw. Stoffwechselprozessen zeigten keine Wirkung auf die funktionellen Fähigkeiten der Monozyten wie phagozytische Aktivität oder auf die Zellviabilität. Ein funktioneller Unterschied wurde lediglich im oxidativen Burst bzw. in der Produktion von ROS, die als Signalmoleküle wirken, detektiert. Da Adipositas mit erhöhten Entzündungswerten sowie gesteigerter Produktion von proinflammatorischen Zytokinen assoziiert ist, wurde vermutet, dass Monozyten von Adipositas-Patienten eine veränderte Zytokinfreisetzung im Vergleich zu gesunden, normalgewichtigen Kontrollen aufweisen. Dies konnte in Rahmen dieser Arbeit jedoch nicht bestätigt werden. Da im adipösen Fettgewebe die meisten proinflammatorischen Zytokinen produziert werden, könnte sich die weitere Forschung auf anderen Immunzellen wie T-Zellen oder M1-Makrophagen, die einen großen Anteil aller Immunzellen des Fettgewebes ausmachen, fokussieren, um den Effekt von Immunzellen auf den Verlauf der Fettleibigkeit sowie die immunmetabolischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen infolge der chronischen Entzündung gezielter zu untersuchen. Dazu könnten Monozyten vor ihrer Differenzierung zu Makrophagen oder dendritischen Zellen aus dem Fettgewebe isoliert und näher untersucht werden, um immunmetabolische Veränderungen im Vergleich zu primären Monozyten aufzudecken. Die durch diese Arbeit gewonnenen Ergebnisse zeigen, dass die metabolische sowie chronische Erkrankung Adipositas beträchtliche Auswirkungen auf Immunzellen und eine Bedeutung für ihren Immunmetabolismus sowie für die angeborene und adaptive Immunität hat. Der Immunmetabolismus, der eine aktive Rolle bei der Entwicklung und Funktion der Immunzellen sowie bei der Regulierung der Immunantwort spielt, stellt einen wichtigen Aspekt der pathologischen Veränderungen bei dieser Erkrankung dar. Durch therapeutische Regulierung des Immunmetabolismus könnten proinflammatorische Effektormechanismen des Immunsystems, welche zum Pathomechanismus der Adipositas beitragen, besser kontrolliert werden. Ein Beispiel dafür ist die signifikant erhöhte TNF-α-Produktion bei einem reduzierenden Kohlenhydratstoffwechsel unter glukosearmen Bedingungen. Die Resultate zeigen auch, dass die Energiegewinnungs- und Stoffwechselprozesse als therapeutische Targets bei Adipositas darstellen können. Ein Beispiel könnte die Regulierung der erhöhten Glykolyse, ATP-Synthese und ROS-Produktion durch die Inhibierung des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels sein, wodurch die Aktivierung der proinflammatorischen M1-Makrophagen und das Fortschreiten des Diabetes bei Adipositas, günstig beeinflusst werden könnten. Außerdem könnten sich zukünftige Experimente auf die Fettsäuresynthese und der Lipidakkumulation in den Lipidtropfen fokussieren, die mit einer erhöhten Lagerung von Entzündungsmediatoren, erhöhten Infektionsrate und somit auch erhöhter Mortalität verbunden sind.:INHALTSVERZEICHNIS Abbildungsverzeichnis………………………………………………………………………. i Tabellenverzeichnis…………………………………………………………………………vii Abkürzungsverzeichnis………………………………………………………………........viii 1. EINLEITUNG 1 1.1. Adipositas – eine chronische Erkrankung 1 1.2. Das adipöse Fettgewebe und das Immunsystem 3 1.3. Monozyten 5 1.3.1. Monozyten – „Schlüsselakteure“ der angeborenen Immunität 5 1.3.2. Aktivierung von Monozyten während Entzündungsprozessen 6 1.4. Das NLRP3-Inflammasom 8 1.5. Immunmetabolismus und metabolische Veränderungen in aktivierten Immunzellen 9 1.6. Zielstellung 12 2. MATERIAL UND METHODEN 14 2.1. Materialien 14 2.2. Methoden 22 2.2.1. Spender und Adipositas-Patienten 22 2.2.2. Isolierung von mononukleären Zellen (PBMCs) aus dem peripheren Blut mittels Ficoll-Dichtegradientenzentrifugation 22 2.2.3. Bestimmung der Zellzahl 23 2.2.4. Negative Separation von Monozyten über magnetische MACS-Separation 24 2.2.5. Zelllyse 25 2.2.6. Proteinbestimmung 25 2.2.7. Proteomik 26 2.2.9. Seahorse-Analyse der Glykolyse und oxidativen Phosphorylierung 31 2.2.10. Bestimmung intrazellulärer polarer Metaboliten mittels Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) 35 2.2.11. Bestimmung der extrazellulären Glukose- und Laktatkonzentration mittels Blutgasanalysator 37 2.2.12. Bestimmung des intrazellulären ATP- und AMP-Gehalts 38 2.2.13. Bestimmung der intrazellulären NADH- und NADPH-Konzentration 39 2.2.14. Lipidtropfenbestimmung und Untersuchung der Phagozytose mittels ImageStream 40 2.2.15. Durchflusszytometrische Analyse der Latexbeads-Phagozytose und der Zellvitalität 42 2.2.16. Nachweis des oxidativen Bursts mittels Luminol 43 2.2.17. Zytokinbestimmung mittels ELISA 44 2.2.18. Statistische Auswertung und Software zur Datenanalyse 45 3. ERGEBNISSE 46 3.1. Verändertes Proteinexpressionsmuster in Monozyten von adipösen und übergewichtigen Probanden 46 3.1.1. Glykolyse und Pentosephosphatweg 49 3.1.2. Oxidative Phosphorylierung, Citratzyklus, ß-Oxidation 51 3.1.3. Weitere Signalwege und Stoffwechselprozesse 55 3.1.4. Untersuchung des Expressionsmusters von Hexokinase I und Hexokinase II mittels Western Blot 57 3.2. Veränderter Metabolismus der Monozyten von Adipositas-Patienten: Veränderung in den Energiegewinnungsprozessen 60 3.2.1. Erhöhte glykolytische und veränderte mitochondriale Aktivität der Monozyten von Adipositas-Patienten 61 3.2.2. Erhöhung der intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffmetabolismus in Monozyten von Adipositas-Patienten 67 3.2.3. Keine Unterschiede in der extrazellulären Glukose- und Laktatkonzentration…. 74 3.2.4. Monozyten von Adipositas-Patienten zeigten erhöhten ATP-Gehalt bzw. niedriges AMP/ATP-Verhältnis 76 3.2.5. Veränderter NADH- und NADPH-Gehalt in Monozyten von Adipositas-Patienten 77 3.2.6. Steigende Lipidtropfenbildung in Monozyten von Adipositas-Patienten 80 3.3. Funktionelle Veränderungen der Monozyten von Adipositas-Patienten 84 3.3.1. Unveränderte phagozytische Aktivität der Monozyten von Adipositas-Patienten… 84 3.3.2. Erhöhter oxidativer Burst als Reaktion auf LPS bei Monozyten von Adipositas-Patienten 88 3.3.3. Freisetzung von Zytokinen unter glukosearmen und glukosereichen Bedingungen 90 3.3.4. Kein Unterschied in der Zellvitalität zwischen Monozyten von normalgewichtigen Kontrollen und Adipositas-Patienten 93 4. DISKUSSION 96 4.1. Verändertes Proteinexpressionsmuster in Monozyten von Adipositas-Patienten im Vergleich zu denen von gesunden, normalgewichtigen Kontrollen 97 4.1.1. Glykolytische Enzyme und andere Stoffwechsel-Enzyme 98 4.1.2. Hexokinase I spielt eine zentrale Rolle in Monozyten von Adipositas-Patienten 99 4.1.3. Histonexpression und -modifikation 100 4.1.4. mTOR-Signalweg 101 4.1.5. Immunologisch relevante Proteine 101 4.2. Veränderter Metabolismus in Monozyten von Adipositas-Patienten 102 4.2.1. Monozyten von Adipositas-Patienten weisen eine verstärkte Glykolyse und veränderte oxidative Phosphorylierung auf 103 4.2.2. ATP-Produktion 107 4.2.3. Konzentrationserhöhung der intrazellulären Metaboliten des zentralen Kohlenhydratstoffwechsels in Monozyten von Adipositas-Patienten 108 4.2.4. NADH- und NADPH-Konzentration 111 4.2.5. Lipidtropfen (LD) – ein relevanter Unterschied zwischen Monozyten von Adipositas-Patienten und normalgewichtigen Kontrollen 113 4.3 Funktionelle Veränderungen in Monozyten von Adipositas-Patienten 117 4.3.1. Phagozytose 117 4.3.2. Oxidativer Burst 117 4.3.3. Zytokinproduktion 119 4.3.4. Zellvitalität 121 4.4. Fazit 122 5. ZUSAMMENFASSUNG 125 6. LITERATURVERZEICHNIS 134 7. ANHANG 163 SELBSTSTÄNDIGKEITSERKLÄRUNG I DANKSAGUNG II