Im Rahmen des BioPara Netzwerkes: „Gesamterfassung von biochemischen und metagenomischen Parametern in Biogasanlagen und deren Korrelation zur Produkteffizienz“ erfolgte die in dieser Arbeit durchgeführte Isolierung und Charakterisierung von prozessrelevanten methanogenen Archaeen aus frischen Schlammproben einer kommerziellen Biogasanlage. Insgesamt wurden sechs verschiedene Arten der Gattungen Methanobacterium, Methanoculleus sowie Methanosarcina isoliert und als Reinkultur kultiviert. Darunter wurden mit Methanobacterium aggregans und Methanosarcina flavescens bis dahin unbekannte Spezies identifiziert und umfassend charakterisiert. Außerdem erfolgte mit Methanoculleus bourgensis und M. flavescens die Anreicherung der beiden abundantesten methanoarchaealen Mikroorganismen des beprobten Biogasreaktors. Weiterführend wurde ein anaerobes Testsystem etabliert, um die Methanproduktivität der analysierten Biogasanlagen im Labormaßstab abzubilden. Mit diesem Testsystem wurden die hydrogenotrophen und methylotrophen Wege der Methanogenese als potentiell raten-limitierende Schritte des Biogasprozesses in NawaRo-Anlagen analysiert. Die hydrogenotrophe Methanogenese verlief in allen beprobten Biogasreaktoren nicht an der maximalen Kapazitätsgrenze und stellte daher keinen raten-limitierenden Schritt dar. Weiterführend wurde die methylotrophe Methanogenese bei hohen Methanosarcina-Abundanzen als nicht-ratenlimitierender Prozess identifiziert und durch die Zugabe von Isolat E03.2 zu inaktivierten Schlammproben der untersuchten Biogasanlagen, ergaben sich Hinweise auf die Anwesenheit von Methoxygruppen. Aufgrund der fundamentalen Bedeutung des Wasserstoff-Stoffwechsels in NawaRo-Biogasanlagen, wurden u.a. Wasserstoff-abhängige Gesamt- sowie methanoarchaeale Enzymreaktionen aus frischen Schlammproben quantifiziert und als mögliche Parameter zur Prozessüberwachung analysiert. Dabei konnte eine positive Korrelation der Gesamt-Hydrogenaseaktivität mit der Methanproduktivität in den untersuchten Biogasanlagen gezeigt werden. Die Gesamt-Hydrogenaseaktivität ist somit einen aussagekräftiger Parameter zur Prozesskontrolle.

Cette étude a porté sur le lagunage anaérobie, de manière générale, une synthèse bibliographique a permis de montrer son fonctionnement, son dimensionnement et ses performances. Un cas détude des performances de la station de Sidi Bou Ali localisé en Tunisie a permis de mettre en exergue de bons rendements épuratoires avec 72,21% MES, 70,86% DCO et 87,43% DBO5. Elle a permis entre autre de développer un modèle de décantation qui a été appliqué avec succès aussi bien aux données des matières en suspension de la station pilote de traitement des eaux usées du CERTE de Tunis quaux données sur les oeufs dhelminthes de la station dOujda au Maroc. Nous obtenons en moyenne des temps de décantation correspondant à 50% délimination compris entre 60 à 120 minutes pour les MES des différents bassins et de 1,97 heures pour les oeufs dhelminthes. Au cours des travaux, il a été également proposé une méthodologie qui a permis de mesurer les cinétiques des activités dacidogenèse et de méthanogenèse sur une installation de type lagunage anaérobie en vraie grandeur localisée en Tunisie. Par ailleurs, une stoechiométrie des processus dhydrolyse et dacidogenèse sur les composés retenus à savoir le glucose, les protéines et les lipides (tous les trois regroupés sous forme dun substrat combiné), concernant les eaux usées domestiques a été mis en place. Cette démarche intègre la production de biomasse, de manière à pouvoir coupler la cinétique des mesures avec la stoechiométrie. En effet lensemble de cette approche a été rassemblé et a permis via le logiciel WEST davoir des résultats satisfaisants des rendements mesurés sur station et calculés par le logiciel sur le modèle du lagunage anaérobie portant sur la combinaison de la décantation primaire et la dégradation anaérobie. Cette modélisation conduit à la réduction de la complexité du modèle ADM1 et à une simulation pratique des activités dacidogenèse et de méthanogenèse. Enfin, la réalisation de ce travail a engendré le développement de la mise en place de deux bases de données : lune bibliographique et lautre sur le lagunage en générale appelée Waste Stabilisation Pond (WSP) data base. Les données de cette dernière ont été analysées statistiquement pour illustrer les performances épuratoires de cinq stations de type lagunage, localisées en Tunisie.

Das Wachstum von M. acetivorans mit Kohlenmonoxid (CO) als Energiesubstrat unterscheidet sich deutlich von dem anderer methanogener Archaeen. M. acetivorans kann während des Wachstums auf CO zwischen Methanogenese und Azetogenese wechseln. Ein wichtiges Enzym, welches den Kohlenstoff-Fluss im Energiestoffwechsel von M. acetivorans reguliert, ist die N5-Methyl-H4SPT:HS-CoM-Methyltransferase Mtr. Durch die Deletion dieses Enzyms konnte ein Stamm, MKOmtr3, erhalten werden, welcher prinzipiell azetogen auf CO wächst, aber geringe Mengen an zusätzlichen Methylgruppen benötigt. Es zeigte sich, dass das bei der Methylgruppen-Reduktion gebildete Heterodisulfid aus HS-CoB und HS-CoM höchstwahrscheinlich für (eine) essentielle anabole Reaktion(en) benötigt wird. In Zellsuspensionen mit MKOmtr3 wurde festgestellt, dass M. acetivorans aus CO kein Methan bildet, d.h. die Mtr-Reaktion nicht umgangen werden kann. Demgegenüber wurde bei Supplementation mit einem Methylgruppen-Donor CO2 gebildet. Mit Hilfe von [13C]-Markierung konnte gezeigt werden, dass das CO2 nicht aus dem Methylgruppen-Donor, sondern aus intrazellulären Speicherstoffen gebildet wird und die Methylgruppen als Elektronenakzeptor fungieren. Somit konnte in dieser Arbeit die von anderer Seite aufgestellte Hypothese, dass es einen cytoplasmatischen Mtr-Bypass gibt, widerlegt werden. Durch Selektion konnten mehrere Suppressoren von MKOmtr3 erhalten werden, welche in der Lage waren mit CO ohne zusätzliche Methylgruppen zu wachsen. Dabei wurde festgestellt, dass diese Stämme nur noch Spuren von Methan bildeten und somit ausschließlich azetogen wuchsen. Dem Suppressor MKOmtrSF fehlte HdrD, das aktive Zentrum der membranständigen Heterodisulfid-Reduktase (HdrED). Das Fehlen der bisher als essentiell bezeichneten HdrED konnte durch Quantifizierung der Enzymaktivität und gezielter Deletion der codierenden Gene bestätigt werden. Trotz der azetogenen Lebensweise von MKOmtrSF und MKOmtrhdr blieb Mcr essentiell, da es weder gelang das Enzym zu inhibieren, ohne die Lebensfähigkeit des Stammes zu verlieren, noch die codierenden Gene zu deletieren. Um einen maximalen Fluss der geringen Mengen an Heterodisulfid, welche von Mcr noch produziert wird, zum Anabolismus zu gewährleisten, wird anscheinend der Haupt-“Verbraucher“, HdrED, ausgeschaltet. In dieser Arbeit wurde somit erstmals gezeigt, dass die Methanogenese nicht zwangsläufig essentiell in methanogenen Archaeen ist, sondern durch eine Variante des reduktiven Azetyl-CoA-Weges ersetzt werden kann.:Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung 7 1.1 Methan 7 1.2 Methanogene und Methanogenese 7 1.2.1 Hydrogenotrophe Methanogenese 9 1.2.2 Methylotrophe Methanogenese 12 1.2.3 Azetiklastische Methanogenese 14 1.2.4 Carboxidotrophe Methanogenese 16 1.3 M. acetivorans als Modellorganismus 20 1.4 Ziele dieser Arbeit 23 2. Material und Methoden 25 2.1 Chemikalien 25 2.2 Anaerobes Arbeiten 25 2.3 Verwendete Mikroorganismen 26 2.4 Mikrobiologische Methoden 27 2.4.1 Kultivierung von E. coli 27 2.4.2 Kultivierung von M. acetivorans 28 2.4.3 Bestimmung der Zellausbeute 31 2.4.4 Herstellung von Zellsuspensionen von M. acetivorans 32 2.4.5 Herstellung elektroporationskompetenter E. coli-Zellen 33 2.4.6 Transformation von E. coli 33 2.4.7 Polyethylenglykol-vermittelte Transformation von M. acetivorans 34 2.4.8 Liposomen-vermittelte Transformation von M. acetivorans 35 2.5 Molekularbiologische Methoden 36 2.5.1 Plasmide 36 2.5.2 Oligonukleotide 38 2.5.3 Isolierung von Plasmiden 43 2.5.4 Isolierung von genomischer DNA 43 2.5.5 Restriktionsverdau 44 2.5.6 Ligation mehrerer DNA-Fragmente 44 2.5.7 Cointegration von pAMG40 in pDN201-Derivate 45 2.5.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 45 2.5.9 Agarose-Gelelektrophorese 46 2.5.10 Sequenzierung von DNA 47 2.6 Analyse von Proteinen 47 2.6.1 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 47 2.6.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 48 2.6.3 Proteomanalyse 49 2.6.4 Bestimmung der Fumarat-Reduktase-Aktivität 51 2.6.5 Bestimmung der Heterodisulfid-Reduktase-Aktivität 52 2.7 Quantifizierung von Metaboliten 53 2.7.1 Quantifizierung gasförmiger Metabolite 53 2.7.2 Quantifizierung gelöster Metabolite 55 3. Ergebnisse 57 3.1 Wachstum von M. acetivorans M42 57 3.2 Deletion der Molybdän-abhängigen Formylmethanofuran-Dehydrogenasen 61 3.2.1 Deletion von Fmd1 61 3.2.2 Phänotypische Analyse von MKOfmd1 62 3.2.3 Deletion von Fmd2 64 3.3 Deletion der Formyltransferase Ftr 64 3.4 Deletion der Methyltransferase Mtr 67 3.4.1 Wachstum von MKOmtr3 mit Azetat + MeOH 67 3.4.2 Wachstum von MKOmtr3 mit CO + MeOH 70 3.5 Analyse von möglichen Mtr-Bypässen 74 3.5.1 Metabolitenbildung in Zellsuspensionen aus CO, MeOH und Trimethylamin 74 3.5.2 Deletion von Mtr in DmtsDFH 77 3.5.3 Markierung mit [13C]-MeOH 79 3.6 Überwindung der Methylgruppen-Abhängigkeit von MKOmtr3 82 3.6.1 Ersatz von MeOH bei Wachstum auf CO 82 3.6.2 Genom-Analyse von ausgewählten Suppressoren 85 3.6.3 Proteom-Analyse von ausgewählten Suppressoren 91 3.6.4 Physiologie von MKOmtrSF 96 3.6.5 Komplementation von MKOmtrSF mit MA2238 100 3.6.6 Fumarat-Reduktase-Aktivität in M. acetivorans? 101 3.6.7 Abhängigkeit der Azetogenese vom Elektronentransport über die Zellmembran 101 3.7 Deletion der Heterodisulfid-Reduktase HdrED1 in MKOmtrSF 103 3.7.1 Anpassung der PEG-Transformationsmethode für MKOmtrSF 103 3.7.2 Konstruktion des Stammes MKOmtrhdr und dessen Wachstum 104 3.7.3 Heterodisulfid-Reduktase-Aktivität in M. acetivorans 105 3.8 Untersuchung der Essentialität von Mcr in MKOmtrSF 107 3.8.1 Inhibierung mit Bromethansulfonat und 3-Nitrooxy-Propanol 107 3.8.2 Deletion der Methyl-S-CoM Reduktase Mcr 109 4. Diskussion 113 4.1 Die Formiatbildung von M. acetivorans beim Wachstum auf CO 113 4.2 Methanogenese oder Azetogenese – die Rolle von Mtr als „Schalter“ 116 4.3 In M. acetivorans gibt es keinen cytoplasmatischen Mtr-Bypass 117 4.4 Die Abhängigkeit von MKOmtr3 von Methylgruppen und wie diese umgangen werden konnte 118 4.4.1 Der Verlust von MA2238 118 4.4.2 Der Verlust von MA2285 in MKOmtrSF 119 4.5 Katabole Methyl-Reduktion von MKOmtr3 120 4.6 Eine anabole Rolle von CoB-S-S-CoM in M. acetivorans? 120 4.7 Woher kommt CH3-S-CoM in MKOmtrSF? 122 4.8 Benötigt M. acetivorans für die Azetogenese Elektronentransport über die Membran? 123 4.9 Nichtmethanogenes Wachstum von M. acetivorans 127 4.10 Warum findet sich bisher kein ausschließlich mit Azetogenese wachsendes Archaeon? 128 4.11 Anwendungsmöglichkeiten für ein azetogenes Archaeon 132 Kurzfassung 137 Literaturverzeichnis 138 Anhang 154 Lebenslauf & Publikationen 163 Danksagung 164 Erklärung 165

Im Rahmen des BioPara Netzwerkes: „Gesamterfassung von biochemischen und metagenomischen Parametern in Biogasanlagen und deren Korrelation zur Produkteffizienz“ erfolgte die in dieser Arbeit durchgeführte Isolierung und Charakterisierung von prozessrelevanten methanogenen Archaeen aus frischen Schlammproben einer kommerziellen Biogasanlage. Insgesamt wurden sechs verschiedene Arten der Gattungen Methanobacterium, Methanoculleus sowie Methanosarcina isoliert und als Reinkultur kultiviert. Darunter wurden mit Methanobacterium aggregans und Methanosarcina flavescens bis dahin unbekannte Spezies identifiziert und umfassend charakterisiert. Außerdem erfolgte mit Methanoculleus bourgensis und M. flavescens die Anreicherung der beiden abundantesten methanoarchaealen Mikroorganismen des beprobten Biogasreaktors. Weiterführend wurde ein anaerobes Testsystem etabliert, um die Methanproduktivität der analysierten Biogasanlagen im Labormaßstab abzubilden. Mit diesem Testsystem wurden die hydrogenotrophen und methylotrophen Wege der Methanogenese als potentiell raten-limitierende Schritte des Biogasprozesses in NawaRo-Anlagen analysiert. Die hydrogenotrophe Methanogenese verlief in allen beprobten Biogasreaktoren nicht an der maximalen Kapazitätsgrenze und stellte daher keinen raten-limitierenden Schritt dar. Weiterführend wurde die methylotrophe Methanogenese bei hohen Methanosarcina-Abundanzen als nicht-ratenlimitierender Prozess identifiziert und durch die Zugabe von Isolat E03.2 zu inaktivierten Schlammproben der untersuchten Biogasanlagen, ergaben sich Hinweise auf die Anwesenheit von Methoxygruppen. Aufgrund der fundamentalen Bedeutung des Wasserstoff-Stoffwechsels in NawaRo-Biogasanlagen, wurden u.a. Wasserstoff-abhängige Gesamt- sowie methanoarchaeale Enzymreaktionen aus frischen Schlammproben quantifiziert und als mögliche Parameter zur Prozessüberwachung analysiert. Dabei konnte eine positive Korrelation der Gesamt-Hydrogenaseaktivität mit der Methanproduktivität in den untersuchten Biogasanlagen gezeigt werden. Die Gesamt-Hydrogenaseaktivität ist somit einen aussagekräftiger Parameter zur Prozesskontrolle.

O estudo sobre a comunidade microbiana de um sistema de tratamento biológico de águas residuárias é de particular interesse, uma vez que o conhecimento da microbiologia do processo pode levar ao aperfeiçoamento de projetos e ao aumento da eficiência dos sistemas. Este trabalho avaliou a atividade microbiana, particularmente a metanogênica, na lagoa de estabilização anaeróbia da estação de tratamento de esgotos sanitários do município de Cajati - SP. Para isso adotou a taxonomia polifásica na caracterização dos microrganismos e de seus aspectos funcionais, buscando o conhecimento da diversidade dos microrganismos e suas relações nesse tipo de sistema anaeróbio. Objetivou também contribuir para o estabelecimento de um protocolo seguro na realização dos ensaios de atividade metanogênica específica (AME). Os estudos foram realizados com amostras dos sedimento da lagoa coletadas em três períodos diferentes, a saber: outubro/2003, outubro/2004 e dezembro/2004. Durante as amostragens foram determinadas variáveis abióticas como temperatura, condutividade, pH, potencial de óxido-redução e teor de oxigênio dissolvido. Medidas do conteúdo de sólidos totais e voláteis (SV) foram também realizadas. A avaliação da atividade microbiana foi feita por exames microscópicos de contraste de fase e fluorescência, AME, determinação do DNAtotal, FISH - hibridização in-situ com sondas fluorescentes e DGGE - eletroforese em gel com gradiente linear de agentes desnaturantes. Também procedeu-se a contagem de protozoários e análise da presença de algas e cianobactérias. Os resultados revelaram que ocorreu variação nas condições do processo biológico nos períodos amostrados, sendo que em outubro/2004, durante período de fortes chuvas e ventos, a eficiência na redução da DBO foi apenas 18,2%. Nesse período, constatou-se organismos como algas do gênero Chorella sp e cianobactérias do gênero Merismopedia sp. Nas demais coletas a remoção da matéria orgânica medida em DBO foi superior a 80%, com boa atividade anaeróbia. Os resultados mostraram que a relação So/Xo de 0,25 gDQO/g SV foi a mais adequada para determinar o valor de AME, e os ensaios com as amostras de outubro/2003 e dezembro/2004 revelaram valores de AME na faixa de 0,85 a 0,21 mg\'CH IND.4\'/gSV.d. Constatou-se a ocorrência de alterações na estrutura da comunidade microbiana inicial em relação à final do experimento de AME, por meio do DGGE. Verifcou-se também nesses ensaios, que o conteúdo de SV inicial variou entre amostras e substratos, conferindo alta variabilidade ao teste. Os perfís de DGGE das amostras coletadas revelaram variação na estrutura das comunidades microbianas no sedimento, e maior diversidade de bactérias e arquéias quando a lagoa anaeróbia apresentava boa eficiência na redução da DBO. A técnica FISH como adotada não foi eficaz para quantificar e identificar os microrganismos devido ao excesso de hibridizações inespecíficas. Mesmo com suas limitações, a técnica FISH revelou a presença de microrganismos dos Domínios Bacteria e Archaea. Nesse caso, a Família Methanobacteriaceae, a ordem Methanomicrobiales e o gênero Methanosaeta sp. foram confirmados. Nas diferentes coletas, foram identificados protozoários dos gêneros Paramecium sp. e Vorticella sp., e rotíferos dos gêneros Brachionus sp., Trichocerca sp., Synchaeta sp. e Keratella sp. / Microbial diversity studies have remarkable relevance since the knowledge about the microbiology of process can improve plants and system efficiency. This work assessed microbial activity, specially methanogenic, at anaerobic pond for domestic wastewater treatment in the city of Cajati, São Paulo State, Brazil. Poliphasic taxonomy was adopted in onder to contribute to the understanding of microbial community diversity and functionality. As well as to contribute for the establishment of a protocol to the specific methanogenic activity test (SMA). Three periods of sampling were done at the sediment of the anaerobic pond (october 2003, october 2004 and december 2004). Abiotic variables as temperature, conductivity, pH, dissolved oxygen and redox potential were measured at sampling time. TS and VS contents were determined in the samples. Microbial studies were done by observation on optical and fluorescent microscopy, analyse of SMA, totalDNA quantitation, counting of protozoa, analyze of algal and cyanobacteria presence, as well as application of two molecular techniques: Fluorescent in-situ Hybridization (FISH) and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Results showed that general conditions of the anaerobic pond changed among samplings. On October 2004, when the rain and wind were very strong, the organic matter removal efficiency (BOD basis) in the anaerobic pond was low (18.2%) and predominant microorganisms were of aerobic algae, as Chorella sp, and the blue-green algae Merismopedia sp. On the other hand, the removal of organics at other two samplings was more than 80% and the anaerobic microbial activity was verified in the sample. SMA tests showed the food/microorganism rate (F/M) of 0.25 gDQO/g VS was the most suitable to the samples. The results showed SMA values between 0.85 and 0.21 mg\'CH IND.4\'/gVS.d for samples of October 2003 and October 2004. SMA test induced modifications in the structure of the microbial community according to DGGE-profile. In addition, VS content, which was used in the SMA tests as biomass measurement, displayed variable behavior making test results difficult to interpret in some situations. DGGE-profile showed variation in the sediment community structure. Higher bacterial and archaeal diversity was observed when anaerobic pond showed 80%, or more, of DBO removal. FISH technique was not a suitable method to secure quantification and identification of the microorganisms from in excess. In spite of the technique limitations, it was possible to identify microorganisms of Bacteria Domain, Archaea Domain, Methanobacteriaceae Family, Methanomicrobiales Order, and microorganisms belonging to Methanosaeta genus. Paramecium and Vorticella were the protozoans identified in all samplings. Rotifers belonging to genders Brachionus, Trichocerca, Synchaeta and Keratella were also observed.

O estudo sobre a comunidade microbiana de um sistema de tratamento biológico de águas residuárias é de particular interesse, uma vez que o conhecimento da microbiologia do processo pode levar ao aperfeiçoamento de projetos e ao aumento da eficiência dos sistemas. Este trabalho avaliou a atividade microbiana, particularmente a metanogênica, na lagoa de estabilização anaeróbia da estação de tratamento de esgotos sanitários do município de Cajati - SP. Para isso adotou a taxonomia polifásica na caracterização dos microrganismos e de seus aspectos funcionais, buscando o conhecimento da diversidade dos microrganismos e suas relações nesse tipo de sistema anaeróbio. Objetivou também contribuir para o estabelecimento de um protocolo seguro na realização dos ensaios de atividade metanogênica específica (AME). Os estudos foram realizados com amostras dos sedimento da lagoa coletadas em três períodos diferentes, a saber: outubro/2003, outubro/2004 e dezembro/2004. Durante as amostragens foram determinadas variáveis abióticas como temperatura, condutividade, pH, potencial de óxido-redução e teor de oxigênio dissolvido. Medidas do conteúdo de sólidos totais e voláteis (SV) foram também realizadas. A avaliação da atividade microbiana foi feita por exames microscópicos de contraste de fase e fluorescência, AME, determinação do DNAtotal, FISH - hibridização in-situ com sondas fluorescentes e DGGE - eletroforese em gel com gradiente linear de agentes desnaturantes. Também procedeu-se a contagem de protozoários e análise da presença de algas e cianobactérias. Os resultados revelaram que ocorreu variação nas condições do processo biológico nos períodos amostrados, sendo que em outubro/2004, durante período de fortes chuvas e ventos, a eficiência na redução da DBO foi apenas 18,2%. Nesse período, constatou-se organismos como algas do gênero Chorella sp e cianobactérias do gênero Merismopedia sp. Nas demais coletas a remoção da matéria orgânica medida em DBO foi superior a 80%, com boa atividade anaeróbia. Os resultados mostraram que a relação So/Xo de 0,25 gDQO/g SV foi a mais adequada para determinar o valor de AME, e os ensaios com as amostras de outubro/2003 e dezembro/2004 revelaram valores de AME na faixa de 0,85 a 0,21 mg\'CH IND.4\'/gSV.d. Constatou-se a ocorrência de alterações na estrutura da comunidade microbiana inicial em relação à final do experimento de AME, por meio do DGGE. Verifcou-se também nesses ensaios, que o conteúdo de SV inicial variou entre amostras e substratos, conferindo alta variabilidade ao teste. Os perfís de DGGE das amostras coletadas revelaram variação na estrutura das comunidades microbianas no sedimento, e maior diversidade de bactérias e arquéias quando a lagoa anaeróbia apresentava boa eficiência na redução da DBO. A técnica FISH como adotada não foi eficaz para quantificar e identificar os microrganismos devido ao excesso de hibridizações inespecíficas. Mesmo com suas limitações, a técnica FISH revelou a presença de microrganismos dos Domínios Bacteria e Archaea. Nesse caso, a Família Methanobacteriaceae, a ordem Methanomicrobiales e o gênero Methanosaeta sp. foram confirmados. Nas diferentes coletas, foram identificados protozoários dos gêneros Paramecium sp. e Vorticella sp., e rotíferos dos gêneros Brachionus sp., Trichocerca sp., Synchaeta sp. e Keratella sp. / Microbial diversity studies have remarkable relevance since the knowledge about the microbiology of process can improve plants and system efficiency. This work assessed microbial activity, specially methanogenic, at anaerobic pond for domestic wastewater treatment in the city of Cajati, São Paulo State, Brazil. Poliphasic taxonomy was adopted in onder to contribute to the understanding of microbial community diversity and functionality. As well as to contribute for the establishment of a protocol to the specific methanogenic activity test (SMA). Three periods of sampling were done at the sediment of the anaerobic pond (october 2003, october 2004 and december 2004). Abiotic variables as temperature, conductivity, pH, dissolved oxygen and redox potential were measured at sampling time. TS and VS contents were determined in the samples. Microbial studies were done by observation on optical and fluorescent microscopy, analyse of SMA, totalDNA quantitation, counting of protozoa, analyze of algal and cyanobacteria presence, as well as application of two molecular techniques: Fluorescent in-situ Hybridization (FISH) and Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE). Results showed that general conditions of the anaerobic pond changed among samplings. On October 2004, when the rain and wind were very strong, the organic matter removal efficiency (BOD basis) in the anaerobic pond was low (18.2%) and predominant microorganisms were of aerobic algae, as Chorella sp, and the blue-green algae Merismopedia sp. On the other hand, the removal of organics at other two samplings was more than 80% and the anaerobic microbial activity was verified in the sample. SMA tests showed the food/microorganism rate (F/M) of 0.25 gDQO/g VS was the most suitable to the samples. The results showed SMA values between 0.85 and 0.21 mg\'CH IND.4\'/gVS.d for samples of October 2003 and October 2004. SMA test induced modifications in the structure of the microbial community according to DGGE-profile. In addition, VS content, which was used in the SMA tests as biomass measurement, displayed variable behavior making test results difficult to interpret in some situations. DGGE-profile showed variation in the sediment community structure. Higher bacterial and archaeal diversity was observed when anaerobic pond showed 80%, or more, of DBO removal. FISH technique was not a suitable method to secure quantification and identification of the microorganisms from in excess. In spite of the technique limitations, it was possible to identify microorganisms of Bacteria Domain, Archaea Domain, Methanobacteriaceae Family, Methanomicrobiales Order, and microorganisms belonging to Methanosaeta genus. Paramecium and Vorticella were the protozoans identified in all samplings. Rotifers belonging to genders Brachionus, Trichocerca, Synchaeta and Keratella were also observed.

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