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Trotz der zunehmenden Bedeutung, die der Biogasprozess in der Reihe der regenerativen Energiequellen seit einigen Jahren einnimmt, sind dessen mikrobiologische Prozesse häufig nur zum Teil verstanden und die Zusammensetzung der mikrobiellen Biozönose oft unbekannt. Um jedoch die Biogasgewinnung möglichst effektiv zu gestalten, ist es essentiell, die physikochemischen Bedingungen im Reaktor an die Mikroorganismen anzupassen. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit, die mikrobielle Gemeinschaft in verschiedenen Biogasanlagen abhängig vom eingesetzten Substrat zu charakterisieren. Dabei zeigte sich, dass insbesondere die archaeelle Diversität in NawaRo-Anlagen sehr limitiert ist und die Organismen in den einzelnen Anlagen nah verwandt sind. Von großer Bedeutung waren dabei die Genera Methanoculleus und Methanosarcina (bei hoher Acetatkonzentration) bzw. Methanothrix (bei geringer Acetatkonzentration). Deren genaues Verhältnis in den verschiedenen Anlagen hing wesentlich von den zugesetzten Co-Substraten ab und vor allem in Anlage A konnte eine Abhängigkeit der Abundanz von Methanosarcina je nach Zusatz von Hühnertrockenkot bzw. Rindermist beobachtet werden. Im Gegensatz dazu spielten die untersuchten chemischen Parameter eine geringere Rolle und es konnten kaum Korrelationen zwischen der Abundanz einzelner archaeeller Genera und physikochemischen Parametern beobachtet werden. In der mit Klärschlamm betriebenen Anlage KA waren außerdem verschiedene Methanobacteriales und Organismen der WCHA1-57-Klade von Bedeutung. Neben methanogenen Archaea konnten in den Anlagen C, KA und KL außerdem Crenarchaeota nachgewiesen werden, die wahrscheinlich in das erst kürzlich neu postulierte Phylum der „Bathyarchaeota“ einzuordnen sind. Deren genaue physiologische Funktion im Biogasprozess ist jedoch noch ungeklärt. Zusätzlich zu den Archaea wurden exemplarisch auch Proben aus den einzelnen Anlagen hinsichtlich ihrer bakteriellen Population untersucht. Dabei waren in den NawaRo-Anlagen A, B, C und KL vor allem Firmicutes und Cloacimonetes zu finden. Letztere stellen dabei eine bisher nur wenig charakterisierte Gruppe dar, die wahrscheinlich im hydrolytischen Abbau von Cellulose und/oder Aminosäuren eine entscheidende Rolle spielen. Innerhalb der Firmicutes übten insbesondere die Clostridiales vielseitige physiologische Funktionen innerhalb der anaeroben Fermentation aus. Überraschend gering war jedoch der Anteil der syntrophen Organismen. Es ist möglich, dass einige der nicht näher klassifizierbaren OTUs dieser Gruppe angehören, da der syntrophe Abbau verschiedener Säuren von essentieller Bedeutung für den Biogasprozess ist. In der mit kommunalem Abwasserschlamm betriebenen Anlage KA war der Anteil der Firmicutes und Cloacimonetes deutlich geringer. Abundantestes Phylum waren hier die Proteobacteria, unter denen zusätzlich Syntrophe zu finden sind. Zusätzlich zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft während des Normalbetriebes von Biogasanlagen wurden außerdem häufige Prozessstörungen simuliert. Dabei zeigte sich, dass es trotz rückläufiger Methanbildung häufig nicht zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Mikroorganismen kommt und stattdessen deren Aktivität sinkt. Erst bei dramatischer Veränderung der physikochemischen Parameter, wie es im Rahmen des ersten Versuchs zur Ammonium-Intoxiaktion der Fall war, wurden deutliche Veränderungen in der archaeellen Biozönose detektiert. Die bakterielle Gemeinschaft blieb dabei kaum verändert. Bei geringerer Ammoniumkonzentration hingegen konnte eine gute Anpassungsfähigkeit der Archaea gezeigt werden. Dennoch war es nicht möglich, anhand dieser Versuche einen allgemein gültigen Grenzwert der Ammoniumkonzentration, ab der inhibitorische Effekte auftreten, festzulegen, da in Anlage A bei ähnlichen Konzentrationen die archaeelle Abundanz durchaus zurückging. Auch im Rahmen der Versuche zur Versauerung konnte eine gute Anpassungsfähigkeit der Archaea gegenüber erhöhten FOS-Konzentrationen gezeigt werden. Dabei war insbesondere eine erhöhte Abundanz der Syntrophomonadaceae mit Stressresistenz verbunden, während eine erhöhte Abundanz von Methanobacterium mit verminderter Säuretoleranz einher ging. Insgesamt liefern die Ergebnisse dieser Arbeit einen aufschlussreichen Einblick in die mikrobielle Population in NawaRo-Anlagen sowohl während des Normalbetriebes als auch im Verlauf von Prozessstörungen, die zu einem besseren Verständnis der ablaufenden Prozesse beitragen können. Dennoch ist die Rolle vieler beteiligter Organismen noch nicht gänzlich geklärt. Es sind daher weitere Studien nötig, um die mikrobiologischen Prozesse in Biogasanlagen vollständig zu verstehen.

Das Wachstum von M. acetivorans mit Kohlenmonoxid (CO) als Energiesubstrat unterscheidet sich deutlich von dem anderer methanogener Archaeen. M. acetivorans kann während des Wachstums auf CO zwischen Methanogenese und Azetogenese wechseln. Ein wichtiges Enzym, welches den Kohlenstoff-Fluss im Energiestoffwechsel von M. acetivorans reguliert, ist die N5-Methyl-H4SPT:HS-CoM-Methyltransferase Mtr. Durch die Deletion dieses Enzyms konnte ein Stamm, MKOmtr3, erhalten werden, welcher prinzipiell azetogen auf CO wächst, aber geringe Mengen an zusätzlichen Methylgruppen benötigt. Es zeigte sich, dass das bei der Methylgruppen-Reduktion gebildete Heterodisulfid aus HS-CoB und HS-CoM höchstwahrscheinlich für (eine) essentielle anabole Reaktion(en) benötigt wird. In Zellsuspensionen mit MKOmtr3 wurde festgestellt, dass M. acetivorans aus CO kein Methan bildet, d.h. die Mtr-Reaktion nicht umgangen werden kann. Demgegenüber wurde bei Supplementation mit einem Methylgruppen-Donor CO2 gebildet. Mit Hilfe von [13C]-Markierung konnte gezeigt werden, dass das CO2 nicht aus dem Methylgruppen-Donor, sondern aus intrazellulären Speicherstoffen gebildet wird und die Methylgruppen als Elektronenakzeptor fungieren. Somit konnte in dieser Arbeit die von anderer Seite aufgestellte Hypothese, dass es einen cytoplasmatischen Mtr-Bypass gibt, widerlegt werden. Durch Selektion konnten mehrere Suppressoren von MKOmtr3 erhalten werden, welche in der Lage waren mit CO ohne zusätzliche Methylgruppen zu wachsen. Dabei wurde festgestellt, dass diese Stämme nur noch Spuren von Methan bildeten und somit ausschließlich azetogen wuchsen. Dem Suppressor MKOmtrSF fehlte HdrD, das aktive Zentrum der membranständigen Heterodisulfid-Reduktase (HdrED). Das Fehlen der bisher als essentiell bezeichneten HdrED konnte durch Quantifizierung der Enzymaktivität und gezielter Deletion der codierenden Gene bestätigt werden. Trotz der azetogenen Lebensweise von MKOmtrSF und MKOmtrhdr blieb Mcr essentiell, da es weder gelang das Enzym zu inhibieren, ohne die Lebensfähigkeit des Stammes zu verlieren, noch die codierenden Gene zu deletieren. Um einen maximalen Fluss der geringen Mengen an Heterodisulfid, welche von Mcr noch produziert wird, zum Anabolismus zu gewährleisten, wird anscheinend der Haupt-“Verbraucher“, HdrED, ausgeschaltet. In dieser Arbeit wurde somit erstmals gezeigt, dass die Methanogenese nicht zwangsläufig essentiell in methanogenen Archaeen ist, sondern durch eine Variante des reduktiven Azetyl-CoA-Weges ersetzt werden kann.:Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung 7 1.1 Methan 7 1.2 Methanogene und Methanogenese 7 1.2.1 Hydrogenotrophe Methanogenese 9 1.2.2 Methylotrophe Methanogenese 12 1.2.3 Azetiklastische Methanogenese 14 1.2.4 Carboxidotrophe Methanogenese 16 1.3 M. acetivorans als Modellorganismus 20 1.4 Ziele dieser Arbeit 23 2. Material und Methoden 25 2.1 Chemikalien 25 2.2 Anaerobes Arbeiten 25 2.3 Verwendete Mikroorganismen 26 2.4 Mikrobiologische Methoden 27 2.4.1 Kultivierung von E. coli 27 2.4.2 Kultivierung von M. acetivorans 28 2.4.3 Bestimmung der Zellausbeute 31 2.4.4 Herstellung von Zellsuspensionen von M. acetivorans 32 2.4.5 Herstellung elektroporationskompetenter E. coli-Zellen 33 2.4.6 Transformation von E. coli 33 2.4.7 Polyethylenglykol-vermittelte Transformation von M. acetivorans 34 2.4.8 Liposomen-vermittelte Transformation von M. acetivorans 35 2.5 Molekularbiologische Methoden 36 2.5.1 Plasmide 36 2.5.2 Oligonukleotide 38 2.5.3 Isolierung von Plasmiden 43 2.5.4 Isolierung von genomischer DNA 43 2.5.5 Restriktionsverdau 44 2.5.6 Ligation mehrerer DNA-Fragmente 44 2.5.7 Cointegration von pAMG40 in pDN201-Derivate 45 2.5.8 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 45 2.5.9 Agarose-Gelelektrophorese 46 2.5.10 Sequenzierung von DNA 47 2.6 Analyse von Proteinen 47 2.6.1 Auftrennung von Proteinen mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 47 2.6.2 Bestimmung der Proteinkonzentration 48 2.6.3 Proteomanalyse 49 2.6.4 Bestimmung der Fumarat-Reduktase-Aktivität 51 2.6.5 Bestimmung der Heterodisulfid-Reduktase-Aktivität 52 2.7 Quantifizierung von Metaboliten 53 2.7.1 Quantifizierung gasförmiger Metabolite 53 2.7.2 Quantifizierung gelöster Metabolite 55 3. Ergebnisse 57 3.1 Wachstum von M. acetivorans M42 57 3.2 Deletion der Molybdän-abhängigen Formylmethanofuran-Dehydrogenasen 61 3.2.1 Deletion von Fmd1 61 3.2.2 Phänotypische Analyse von MKOfmd1 62 3.2.3 Deletion von Fmd2 64 3.3 Deletion der Formyltransferase Ftr 64 3.4 Deletion der Methyltransferase Mtr 67 3.4.1 Wachstum von MKOmtr3 mit Azetat + MeOH 67 3.4.2 Wachstum von MKOmtr3 mit CO + MeOH 70 3.5 Analyse von möglichen Mtr-Bypässen 74 3.5.1 Metabolitenbildung in Zellsuspensionen aus CO, MeOH und Trimethylamin 74 3.5.2 Deletion von Mtr in DmtsDFH 77 3.5.3 Markierung mit [13C]-MeOH 79 3.6 Überwindung der Methylgruppen-Abhängigkeit von MKOmtr3 82 3.6.1 Ersatz von MeOH bei Wachstum auf CO 82 3.6.2 Genom-Analyse von ausgewählten Suppressoren 85 3.6.3 Proteom-Analyse von ausgewählten Suppressoren 91 3.6.4 Physiologie von MKOmtrSF 96 3.6.5 Komplementation von MKOmtrSF mit MA2238 100 3.6.6 Fumarat-Reduktase-Aktivität in M. acetivorans? 101 3.6.7 Abhängigkeit der Azetogenese vom Elektronentransport über die Zellmembran 101 3.7 Deletion der Heterodisulfid-Reduktase HdrED1 in MKOmtrSF 103 3.7.1 Anpassung der PEG-Transformationsmethode für MKOmtrSF 103 3.7.2 Konstruktion des Stammes MKOmtrhdr und dessen Wachstum 104 3.7.3 Heterodisulfid-Reduktase-Aktivität in M. acetivorans 105 3.8 Untersuchung der Essentialität von Mcr in MKOmtrSF 107 3.8.1 Inhibierung mit Bromethansulfonat und 3-Nitrooxy-Propanol 107 3.8.2 Deletion der Methyl-S-CoM Reduktase Mcr 109 4. Diskussion 113 4.1 Die Formiatbildung von M. acetivorans beim Wachstum auf CO 113 4.2 Methanogenese oder Azetogenese – die Rolle von Mtr als „Schalter“ 116 4.3 In M. acetivorans gibt es keinen cytoplasmatischen Mtr-Bypass 117 4.4 Die Abhängigkeit von MKOmtr3 von Methylgruppen und wie diese umgangen werden konnte 118 4.4.1 Der Verlust von MA2238 118 4.4.2 Der Verlust von MA2285 in MKOmtrSF 119 4.5 Katabole Methyl-Reduktion von MKOmtr3 120 4.6 Eine anabole Rolle von CoB-S-S-CoM in M. acetivorans? 120 4.7 Woher kommt CH3-S-CoM in MKOmtrSF? 122 4.8 Benötigt M. acetivorans für die Azetogenese Elektronentransport über die Membran? 123 4.9 Nichtmethanogenes Wachstum von M. acetivorans 127 4.10 Warum findet sich bisher kein ausschließlich mit Azetogenese wachsendes Archaeon? 128 4.11 Anwendungsmöglichkeiten für ein azetogenes Archaeon 132 Kurzfassung 137 Literaturverzeichnis 138 Anhang 154 Lebenslauf & Publikationen 163 Danksagung 164 Erklärung 165

The CO dehydrogenase~linked ferredoxin from acetate-grown <i>Methanosarcina thermophiIa</i> was characterized to determine the structure and biochemical properties of the iron-sulfur clusters. Chemical and spectroscopic analyses indicated that the ferredoxin contained two [4Fe-4S] clusters per monomer of 6,790 Da, although a [3Fe-4S] species was also detected in the oxidized protein. The midpoint potentials of the [4Fe-4S] and [3Fe~4S] clusters at pH 7 were -407 m V and + 103 m V, respectively. Evidence from biochemical and spectroscopic studies indicated that the [3Fe-4S] species may have been formed from [4Fe-4S] clusters when ferredoxin was oxidized. The gene encoding the CO dehydrogenase-linked ferredoxin (<i>fdxA</i>) in <i>Ms. thermophila</i> had the coding capacity for a 6,230-Da protein which contained eight cysteines with spacings typical of 2[4Fe-4S] ferredoxins. A second open reading frame (ORF1) was also identified which had the potential to encode a 2[4Fe-4S] bacterial-like ferredoxin (5,850 Da). The deduced proteins from <i>fdxA</i> and ORF1 were 62% identical. <i>fdxA</i> and ORFI were present as single copies in the genome and each was transcribed on a monocistronic mRNA. Both <i>fdxA</i> and ORF1 were transcribed in cells grown on methanol and trimethylamine, but only the <i>fdxA</i> -specific transcript was detected in acetate-grown cells. The apparent transcriptional start sites of <i>fdxA</i> and ORFI were downstream of sequences which had high identity with the consensus methanogen promoter. The heterodisulfide of two cofactors unique to the methanogenic microorganisms, HS-HTP and HS-CoM, was enzymatically reduced in cell extracts of <i>Ms. thermophila</i> using electrons from the oxidation of either H₂ or CO. The homodisulfides of either HS-HTP or HS-CoM were not reduced under the same conditions. The results indicated that methane is formed by reductive demethylation of CH₃-S-CoM using HS-HTP as a reductant in <i>Ms. thermophila</i>. Coupling of CO oxidation with reduction of the heterodisulfide suggested that the CO dehydrogenase-linked ferredoxin may be involved, although the details of electron flow are not known. / Ph. D.

The cell extract protein content of acetate- and methanol-grown Methanosarcina thermophila was examined by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis to determine the extent of regulation by the growth substrate. More than 100 mutually-exclusive spots were present in acetate- and methanol-grown cells suggesting a high degree of regulation. Spots corresponding to acetate kinase, phosphotransacetylase, and the five subunits of the nickel-containing carbon monoxide dehydrogenase (CODH) complex were identified in acetate-grown cells. The nickel-containing methyl coenzyme M methylreductase from acetate-grown M. thermophila was purified 16-fold from a cell extract to apparent homogeneity. The enzyme had a native molecular weight of between 132,000 and 141,000 and contained three subunits with a configuration of a1B1y1-. The as-isolated enzyme was inactive, but could be reductively reactivated by either titanium (III) citrate or reduced ferredoxin. Reactivation with ferredoxin was a simplification over previously reported reactivation systems. ATP stimulated, but was not required for reactivation. The CO dehydrogenase enzyme complex from M. thermophila was purified and separated into its respective components: the CO-oxidizing nickel/iron-sulfur (Ni/Fe-S) component and the cobalt-containing corrinoid/iron sulfur (Co/Fe-S) component. EPR spectroscopy and spectroelectrochemical titration of the Fe-S centers of the Ni/Fe-S component indicated the presence of two low-potential [4Fe-4S]2+/1+ centers and third high-potential center whose Fe-S configuration is unknown. When reduced with CO, the NilFe-S component exhibited a previously unobserved Ni-Fe-C EPR signal. The Co/Fe-S component contained one [4Fe-4S]2+/1+ cluster, and the as-isolated corrinoid in the component was in the base-off conformation suggesting that modulation of the electron density of the cobalt ion may result in a modified reactivity of the active site of the corrin. The CODH enzyme complex and isolated Co/Fe-S component reductively dechlorinated trichloroethylene to cis-dichloroethylene, trans-dichloroethylene, 1,1-dichloroethylene, vinyl chloride, and ethylene. Factor III also catalyzed the dechlorination of trichloroethylene when in the presence of titanium (III) citrate. Reconstitution of the Co/Fe-S component with the CO-reduced NilFe-S component also allowed dechlorination demonstrating an electron transfer from the reduced Ni/Fe-S component to the Co/Fe-S component. / Ph. D.

Methanosarcina are methanogens capable of growth and methanogenesis from H₂/CO₂, formate, methanol, methylamines, and acetate. Methanosarcina conserve energy by coupling electron transport and methyl transfer to the generation of ion gradients during acetoclastic growth. This work focuses on cytochrome b and heterodisulfide reductase, two proteins involved in energy conservation by electron transport. A procedure was developed for mass cultivation of Methanosarcina thermophila strain TM-1 in 12-liter fermentations which produced up to 10 grams wet weight/liter, in order to facilitate biochemical studies. Cytochromes occurring in Methanosarcina thermophila were characterized spectrophotometrically using chemical and physiological reactants. This analysis revealed two heme centers, one of which was only reduced by Na₂S₂O₄ or carbon monoxide. Partially purified cytochromes were found to be present in a complex and were characterized by electrophoretic and spectrophotometric analysis. The cytochrome-containing protein was found to contain two hemes and had an M_r of 28,000 Da. Heterodisulfide reductase was isolated from the soluble fraction by anion exchange chromatography and assayed using methyl viologen as an artificial electron donor. Electron transport from CO to the heterodisulfide of 2-mercaptoethanesulfonic acid (HS-CoM) and 7- mercaptoheptanoylthreonine phosphate (HS-HTP) was reconstituted using carbon monoxide dehydrogenase, ferredoxin, membranes, and heterodisulfide reductase. Both membranes and ferredoxin were required for reduction of the heterodisulfide. / Master of Science

The genes encoding the acetate kinase and phosphotransacetylase enzymes from <i>Methanosarcina thermophila</i> were isolated from a genomic library on a fifteen kilobase fragment The genes are located adjacent to one another, with the phosphotransacetylase gene (<i>pta</i>) directly upstream of the acetate kinase gene (<i>ack</i>). The two genes were sequenced, along with a third Open Reading Frame (designated <i>orfY</i>). The <i>orfY</i> gene appears to encode a novel protein whose physiological function has yet to be determined. / Ph. D.

Oxidative stress is the imbalance of oxidants and reductants; it affects different parts of the organisms. In methane-producing archaea, Methanosarcina acetivorans, a rubrerythrin-like protein methanogen rubrerythrin, is involved in the oxidative defense of the microorganism. It is a 45 kDa homodimer protein in the buffer solution. ICPMS and EXAFS analyses confirmed the presence of iron and zinc in this protein's structure. EPR confirmed the iron (Fe3+) of the rubredoxin center with the characteristic peak in the low field having a 9.35 g value and a diiron center peak in the high field region with a characteristic 2.01 g value. A BioSAXS analysis was conducted to investigate the structural changes in a mRbr under different conditions. The results revealed that the protein undergoes substantial structural modifications when exposed to either oxidation or reduction. When treated with H2O2, the protein sample displayed an Rg of 47Ao and a Dmax of 167 Ao, indicating a larger size than the reduced state. Conversely, when subjected to Na2S2O4, the protein sample had an Rg of 45 Ao and a Dmax of 45 Ao.

Trotz der zunehmenden Bedeutung, die der Biogasprozess in der Reihe der regenerativen Energiequellen seit einigen Jahren einnimmt, sind dessen mikrobiologische Prozesse häufig nur zum Teil verstanden und die Zusammensetzung der mikrobiellen Biozönose oft unbekannt. Um jedoch die Biogasgewinnung möglichst effektiv zu gestalten, ist es essentiell, die physikochemischen Bedingungen im Reaktor an die Mikroorganismen anzupassen. Daher war es ein Ziel dieser Arbeit, die mikrobielle Gemeinschaft in verschiedenen Biogasanlagen abhängig vom eingesetzten Substrat zu charakterisieren. Dabei zeigte sich, dass insbesondere die archaeelle Diversität in NawaRo-Anlagen sehr limitiert ist und die Organismen in den einzelnen Anlagen nah verwandt sind. Von großer Bedeutung waren dabei die Genera Methanoculleus und Methanosarcina (bei hoher Acetatkonzentration) bzw. Methanothrix (bei geringer Acetatkonzentration). Deren genaues Verhältnis in den verschiedenen Anlagen hing wesentlich von den zugesetzten Co-Substraten ab und vor allem in Anlage A konnte eine Abhängigkeit der Abundanz von Methanosarcina je nach Zusatz von Hühnertrockenkot bzw. Rindermist beobachtet werden. Im Gegensatz dazu spielten die untersuchten chemischen Parameter eine geringere Rolle und es konnten kaum Korrelationen zwischen der Abundanz einzelner archaeeller Genera und physikochemischen Parametern beobachtet werden. In der mit Klärschlamm betriebenen Anlage KA waren außerdem verschiedene Methanobacteriales und Organismen der WCHA1-57-Klade von Bedeutung. Neben methanogenen Archaea konnten in den Anlagen C, KA und KL außerdem Crenarchaeota nachgewiesen werden, die wahrscheinlich in das erst kürzlich neu postulierte Phylum der „Bathyarchaeota“ einzuordnen sind. Deren genaue physiologische Funktion im Biogasprozess ist jedoch noch ungeklärt. Zusätzlich zu den Archaea wurden exemplarisch auch Proben aus den einzelnen Anlagen hinsichtlich ihrer bakteriellen Population untersucht. Dabei waren in den NawaRo-Anlagen A, B, C und KL vor allem Firmicutes und Cloacimonetes zu finden. Letztere stellen dabei eine bisher nur wenig charakterisierte Gruppe dar, die wahrscheinlich im hydrolytischen Abbau von Cellulose und/oder Aminosäuren eine entscheidende Rolle spielen. Innerhalb der Firmicutes übten insbesondere die Clostridiales vielseitige physiologische Funktionen innerhalb der anaeroben Fermentation aus. Überraschend gering war jedoch der Anteil der syntrophen Organismen. Es ist möglich, dass einige der nicht näher klassifizierbaren OTUs dieser Gruppe angehören, da der syntrophe Abbau verschiedener Säuren von essentieller Bedeutung für den Biogasprozess ist. In der mit kommunalem Abwasserschlamm betriebenen Anlage KA war der Anteil der Firmicutes und Cloacimonetes deutlich geringer. Abundantestes Phylum waren hier die Proteobacteria, unter denen zusätzlich Syntrophe zu finden sind. Zusätzlich zur Untersuchung der mikrobiellen Gemeinschaft während des Normalbetriebes von Biogasanlagen wurden außerdem häufige Prozessstörungen simuliert. Dabei zeigte sich, dass es trotz rückläufiger Methanbildung häufig nicht zu Veränderungen in der Zusammensetzung der Mikroorganismen kommt und stattdessen deren Aktivität sinkt. Erst bei dramatischer Veränderung der physikochemischen Parameter, wie es im Rahmen des ersten Versuchs zur Ammonium-Intoxiaktion der Fall war, wurden deutliche Veränderungen in der archaeellen Biozönose detektiert. Die bakterielle Gemeinschaft blieb dabei kaum verändert. Bei geringerer Ammoniumkonzentration hingegen konnte eine gute Anpassungsfähigkeit der Archaea gezeigt werden. Dennoch war es nicht möglich, anhand dieser Versuche einen allgemein gültigen Grenzwert der Ammoniumkonzentration, ab der inhibitorische Effekte auftreten, festzulegen, da in Anlage A bei ähnlichen Konzentrationen die archaeelle Abundanz durchaus zurückging. Auch im Rahmen der Versuche zur Versauerung konnte eine gute Anpassungsfähigkeit der Archaea gegenüber erhöhten FOS-Konzentrationen gezeigt werden. Dabei war insbesondere eine erhöhte Abundanz der Syntrophomonadaceae mit Stressresistenz verbunden, während eine erhöhte Abundanz von Methanobacterium mit verminderter Säuretoleranz einher ging. Insgesamt liefern die Ergebnisse dieser Arbeit einen aufschlussreichen Einblick in die mikrobielle Population in NawaRo-Anlagen sowohl während des Normalbetriebes als auch im Verlauf von Prozessstörungen, die zu einem besseren Verständnis der ablaufenden Prozesse beitragen können. Dennoch ist die Rolle vieler beteiligter Organismen noch nicht gänzlich geklärt. Es sind daher weitere Studien nötig, um die mikrobiologischen Prozesse in Biogasanlagen vollständig zu verstehen.

We propose a new method to integrate genome-scale metabolic models into biogeochemical reaction modeling. This method predicts rates of microbial metabolisms by combining flux balance analysis (FBA) with microbial rate laws. We applied this new hybrid method to methanogenesis by Methanosarcina barkeri. Our results show that the new method predicts well the progress of acetoclastic, methanol, and diauxic metabolism by M. barkeri. The hybrid method represents an improvement over dynamic FBA. We validated genome-scale metabolic models of Methanosarcina barkeri, Methanosarcina acetivorans, Geobacter metallireducens, Shewanella oneidensis, Shewanella putrefaciens and Shewanella sp. MR4 for application to biogeochemical modeling. FBA was used to predict the response of cell metabolism, and ATP and biomass yield. Our analysis provides improvements to these models for the purpose of applications to natural environments. / 2019-07-28