Cystatin C, a 13 kDa low molecular weight protein is an inhibitor of cysteine proteases. Due to its low molecular weight and positive charge at physiological pH, it is freely filtered by the glomerulus and catabolized after reabsorption by proximal tubular cells with a low concentration (0.03-0.3 mg/L) in urine amongst healthy subjects. Urinary cystatin C is a potential biomarker detection of acute kidney injury (AKI) in the acute phase when patients are submitted to the intensive care unit. The aim in this report was to perform a full method validation of urinary analysis of cystatin C on a high throughput chemical analyzer by particle-enhanced turbidimetric immunoassay (PETIA) at the University Hospital in Uppsala, Sweden. The antigen excess, linearity, lower limit of quantification (LoQ), recovery, assay precision, stability and interference caused by haemoglobin was evaluated. No hook effect was observed, the assay was linear over the studied interval <0.001-0.950 mg/L with a regression of R2=0.9994. The LoQ was calculated to 0.020 mg/L with a coefficient of variation (CV) ≤10% which was considered acceptable. The assay had a recovery between 93-100% and the assay precision had a total CV <3.5%. Cystatin C is stable for 3 days in room temperature and 14 days in +4C. The assay did not show any major interference with haemoglobin. The urinary cystatin C showed good precision and performance characteristics by measurements using PETIA all of which is a necessary qualification for a biomarker at a 24-h running routine laboratory.

A degradação da qualidade das águas dos mananciais superficiais prejudica a sua utilização para abastecimento público. O monitoramento do fitoplâncton torna-se importante para detectar essas alterações nas águas que chegam as estações de tratamento de água. Água de má qualidade pode apresentar, entre outros aspectos, odor, sabor e excesso de organismos fitoplanctônicos que podem colmatar filtros, flotar em decantadores e produzir toxinas. As cianobactérias são organismos potenciais produtores de toxinas prejudiciais à saúde humana e animal. Nesse sentido, seu monitoramento é determinado na legislação brasileira. Este trabalho objetiva estabelecer parâmetros de garantia da qualidade analítica da contagem do fitoplâncton pelo método de Sedgwick-Rafter, através da participação em programa de comparação interlaboratorial e da validação desse método utilizando amostras não preservadas. Também pretende mostrar a importância do monitoramento do fitoplâncton em águas de abastecimento. Como forma de verificar o desempenho do Laboratório Central de Águas da Companhia Riograndense de Saneamento na análise de cianobactérias, foi avaliada a participação em Programa de Comparação Interlaboratorial, promovido pela Rede Metrológica do Rio Grande do Sul. O desempenho foi considerado satisfatório na contagem dos organismos, dentre os 30 laboratórios brasileiros participantes. No entanto, de forma geral, foram constatadas dificuldades da identificação dos organismos, sinalizando a importância de uma boa análise qualitativa. O método utilizado pelo Laboratório foi validado como exigência da norma ISO/IEC 17025, pois o método de Sedgwick-Rafter utilizado com modificação precisava ser validado. A validação foi realizada para amostras não preservadas, evidenciando não haver diferença dos resultados de análise entre amostras vivas e preservadas até três dias após a coleta, mesmo com amostra não refrigerada. O método foi considerado exato e robusto, além de terem sido calculados limite de detecção, limite de quantificação e incerteza de medição. Assegurar que o método é preciso e confiável reflete nos resultados de monitoramentos fitoplanctônicos. Assim, durante o monitoramento mensal, realizado durante um ano, em seis mananciais utilizados para abastecimento público, detectaram-se os períodos de floração de cianobactérias, bem como os gêneros presentes. Esses dados auxiliam na avaliação da qualidade da água e na tomada de decisões em relação à melhor maneira de realizar o seu tratamento. Portanto, este trabalho mostrou a necessidade da utilização de métodos confiáveis no monitoramento fitoplanctônico. A participação em comparações interlaboratoriais é fundamental para avaliar o desempenho dos laboratórios e um meio de buscar treinamento e melhoria contínua dos analistas e dos métodos utilizados. Também ficou clara a necessidade de aperfeiçoamento na identificação dos gêneros de cianobactérias, pois a identificação incorreta pode provocar erros na quantificação e fornecer resultados que não correspondem à realidade do manancial amostrado. Além disso, evidenciou-se a importância do monitoramento do fitoplâncton na avaliação da água para abastecimento público. A correta identificação dos organismos presentes determina as ações que devem ser tomadas em relação à freqüência de monitoramento ou ao processo de tratamento de água. / The water quality degradation of surface waters compromise its use for public supply. Monitoring phytoplankton is important to detect these changes in waters going to water treatment plants. Poor water quality may cause, among other things, odor, taste and excess phytoplankton organisms that can bridge filters, decanters float in decanters and produce toxins. Cyanobacteria are organisms potential producers of toxins harmful to human and animal health. In this sense, their monitoring is determined by Brazilian law. This work aims to establish parameters for quality assurance of analytical phytoplankton counting by Sedgwick-Rafter method, through participation in interlaboratory comparison program and the validation of this method using samples unpreserved. Also demonstrates the importance of phytoplankton monitoring in the water supply. As a way to check the performance of the Central Laboratory for Water and Sanitation Company Riograndense analysis of cyanobacteria, it was evaluated the participation in Interlaboratory Comparison Program, sponsored by Rede Metrológica of Rio Grande do Sul. The performance was satisfactory during counting organisms among the 30 Brazilian laboratories participating. However, in general, were found difficulties in identifying, indicating the importance of a good qualitative analysis. The method was validated by the Laboratory as a requirement of ISO / IEC 17025, because the Sedgwick-Rafter method used with modification needed to be validated. The validation was performed for samples unpreserved, showing no difference between the results of analysis and samples preserved until three days after collection, even with no refrigerated sample. The method was considered accurate and robust, and have their limit of detection, limit of quantification and uncertainty calculated. Ensure that the method is accurate and reliable monitoring reflects phytoplankton results. Thus, during the monthly monitoring was conducted over a year for six water sources used for public supply, there were periods of cyanobacteria bloom, and the genera present were detected. These data help to assess the water quality and in making decisions about the best way to accomplish water treatment. Therefore, this study showed the necessity of using reliable methods for phytoplankton monitoring. Participation in interlaboratory comparisons is essential in evaluating the performance of laboratories and a means of seeking continuous improvement and training of analysts and the methods used. Also there was a clear need for improvement in the identification cyanobacteria genera, because misidentification can cause errors in the measurement and provide results that do not correspond to the reality of the water supply. In addition, the study showed the importance of phytoplankton monitoring in the assessment of water for public supply. The correct organisms identification determines the actions to be taken in relation to frequency of monitoring or process water treatment.

A degradação da qualidade das águas dos mananciais superficiais prejudica a sua utilização para abastecimento público. O monitoramento do fitoplâncton torna-se importante para detectar essas alterações nas águas que chegam as estações de tratamento de água. Água de má qualidade pode apresentar, entre outros aspectos, odor, sabor e excesso de organismos fitoplanctônicos que podem colmatar filtros, flotar em decantadores e produzir toxinas. As cianobactérias são organismos potenciais produtores de toxinas prejudiciais à saúde humana e animal. Nesse sentido, seu monitoramento é determinado na legislação brasileira. Este trabalho objetiva estabelecer parâmetros de garantia da qualidade analítica da contagem do fitoplâncton pelo método de Sedgwick-Rafter, através da participação em programa de comparação interlaboratorial e da validação desse método utilizando amostras não preservadas. Também pretende mostrar a importância do monitoramento do fitoplâncton em águas de abastecimento. Como forma de verificar o desempenho do Laboratório Central de Águas da Companhia Riograndense de Saneamento na análise de cianobactérias, foi avaliada a participação em Programa de Comparação Interlaboratorial, promovido pela Rede Metrológica do Rio Grande do Sul. O desempenho foi considerado satisfatório na contagem dos organismos, dentre os 30 laboratórios brasileiros participantes. No entanto, de forma geral, foram constatadas dificuldades da identificação dos organismos, sinalizando a importância de uma boa análise qualitativa. O método utilizado pelo Laboratório foi validado como exigência da norma ISO/IEC 17025, pois o método de Sedgwick-Rafter utilizado com modificação precisava ser validado. A validação foi realizada para amostras não preservadas, evidenciando não haver diferença dos resultados de análise entre amostras vivas e preservadas até três dias após a coleta, mesmo com amostra não refrigerada. O método foi considerado exato e robusto, além de terem sido calculados limite de detecção, limite de quantificação e incerteza de medição. Assegurar que o método é preciso e confiável reflete nos resultados de monitoramentos fitoplanctônicos. Assim, durante o monitoramento mensal, realizado durante um ano, em seis mananciais utilizados para abastecimento público, detectaram-se os períodos de floração de cianobactérias, bem como os gêneros presentes. Esses dados auxiliam na avaliação da qualidade da água e na tomada de decisões em relação à melhor maneira de realizar o seu tratamento. Portanto, este trabalho mostrou a necessidade da utilização de métodos confiáveis no monitoramento fitoplanctônico. A participação em comparações interlaboratoriais é fundamental para avaliar o desempenho dos laboratórios e um meio de buscar treinamento e melhoria contínua dos analistas e dos métodos utilizados. Também ficou clara a necessidade de aperfeiçoamento na identificação dos gêneros de cianobactérias, pois a identificação incorreta pode provocar erros na quantificação e fornecer resultados que não correspondem à realidade do manancial amostrado. Além disso, evidenciou-se a importância do monitoramento do fitoplâncton na avaliação da água para abastecimento público. A correta identificação dos organismos presentes determina as ações que devem ser tomadas em relação à freqüência de monitoramento ou ao processo de tratamento de água. / The water quality degradation of surface waters compromise its use for public supply. Monitoring phytoplankton is important to detect these changes in waters going to water treatment plants. Poor water quality may cause, among other things, odor, taste and excess phytoplankton organisms that can bridge filters, decanters float in decanters and produce toxins. Cyanobacteria are organisms potential producers of toxins harmful to human and animal health. In this sense, their monitoring is determined by Brazilian law. This work aims to establish parameters for quality assurance of analytical phytoplankton counting by Sedgwick-Rafter method, through participation in interlaboratory comparison program and the validation of this method using samples unpreserved. Also demonstrates the importance of phytoplankton monitoring in the water supply. As a way to check the performance of the Central Laboratory for Water and Sanitation Company Riograndense analysis of cyanobacteria, it was evaluated the participation in Interlaboratory Comparison Program, sponsored by Rede Metrológica of Rio Grande do Sul. The performance was satisfactory during counting organisms among the 30 Brazilian laboratories participating. However, in general, were found difficulties in identifying, indicating the importance of a good qualitative analysis. The method was validated by the Laboratory as a requirement of ISO / IEC 17025, because the Sedgwick-Rafter method used with modification needed to be validated. The validation was performed for samples unpreserved, showing no difference between the results of analysis and samples preserved until three days after collection, even with no refrigerated sample. The method was considered accurate and robust, and have their limit of detection, limit of quantification and uncertainty calculated. Ensure that the method is accurate and reliable monitoring reflects phytoplankton results. Thus, during the monthly monitoring was conducted over a year for six water sources used for public supply, there were periods of cyanobacteria bloom, and the genera present were detected. These data help to assess the water quality and in making decisions about the best way to accomplish water treatment. Therefore, this study showed the necessity of using reliable methods for phytoplankton monitoring. Participation in interlaboratory comparisons is essential in evaluating the performance of laboratories and a means of seeking continuous improvement and training of analysts and the methods used. Also there was a clear need for improvement in the identification cyanobacteria genera, because misidentification can cause errors in the measurement and provide results that do not correspond to the reality of the water supply. In addition, the study showed the importance of phytoplankton monitoring in the assessment of water for public supply. The correct organisms identification determines the actions to be taken in relation to frequency of monitoring or process water treatment.

A degradação da qualidade das águas dos mananciais superficiais prejudica a sua utilização para abastecimento público. O monitoramento do fitoplâncton torna-se importante para detectar essas alterações nas águas que chegam as estações de tratamento de água. Água de má qualidade pode apresentar, entre outros aspectos, odor, sabor e excesso de organismos fitoplanctônicos que podem colmatar filtros, flotar em decantadores e produzir toxinas. As cianobactérias são organismos potenciais produtores de toxinas prejudiciais à saúde humana e animal. Nesse sentido, seu monitoramento é determinado na legislação brasileira. Este trabalho objetiva estabelecer parâmetros de garantia da qualidade analítica da contagem do fitoplâncton pelo método de Sedgwick-Rafter, através da participação em programa de comparação interlaboratorial e da validação desse método utilizando amostras não preservadas. Também pretende mostrar a importância do monitoramento do fitoplâncton em águas de abastecimento. Como forma de verificar o desempenho do Laboratório Central de Águas da Companhia Riograndense de Saneamento na análise de cianobactérias, foi avaliada a participação em Programa de Comparação Interlaboratorial, promovido pela Rede Metrológica do Rio Grande do Sul. O desempenho foi considerado satisfatório na contagem dos organismos, dentre os 30 laboratórios brasileiros participantes. No entanto, de forma geral, foram constatadas dificuldades da identificação dos organismos, sinalizando a importância de uma boa análise qualitativa. O método utilizado pelo Laboratório foi validado como exigência da norma ISO/IEC 17025, pois o método de Sedgwick-Rafter utilizado com modificação precisava ser validado. A validação foi realizada para amostras não preservadas, evidenciando não haver diferença dos resultados de análise entre amostras vivas e preservadas até três dias após a coleta, mesmo com amostra não refrigerada. O método foi considerado exato e robusto, além de terem sido calculados limite de detecção, limite de quantificação e incerteza de medição. Assegurar que o método é preciso e confiável reflete nos resultados de monitoramentos fitoplanctônicos. Assim, durante o monitoramento mensal, realizado durante um ano, em seis mananciais utilizados para abastecimento público, detectaram-se os períodos de floração de cianobactérias, bem como os gêneros presentes. Esses dados auxiliam na avaliação da qualidade da água e na tomada de decisões em relação à melhor maneira de realizar o seu tratamento. Portanto, este trabalho mostrou a necessidade da utilização de métodos confiáveis no monitoramento fitoplanctônico. A participação em comparações interlaboratoriais é fundamental para avaliar o desempenho dos laboratórios e um meio de buscar treinamento e melhoria contínua dos analistas e dos métodos utilizados. Também ficou clara a necessidade de aperfeiçoamento na identificação dos gêneros de cianobactérias, pois a identificação incorreta pode provocar erros na quantificação e fornecer resultados que não correspondem à realidade do manancial amostrado. Além disso, evidenciou-se a importância do monitoramento do fitoplâncton na avaliação da água para abastecimento público. A correta identificação dos organismos presentes determina as ações que devem ser tomadas em relação à freqüência de monitoramento ou ao processo de tratamento de água. / The water quality degradation of surface waters compromise its use for public supply. Monitoring phytoplankton is important to detect these changes in waters going to water treatment plants. Poor water quality may cause, among other things, odor, taste and excess phytoplankton organisms that can bridge filters, decanters float in decanters and produce toxins. Cyanobacteria are organisms potential producers of toxins harmful to human and animal health. In this sense, their monitoring is determined by Brazilian law. This work aims to establish parameters for quality assurance of analytical phytoplankton counting by Sedgwick-Rafter method, through participation in interlaboratory comparison program and the validation of this method using samples unpreserved. Also demonstrates the importance of phytoplankton monitoring in the water supply. As a way to check the performance of the Central Laboratory for Water and Sanitation Company Riograndense analysis of cyanobacteria, it was evaluated the participation in Interlaboratory Comparison Program, sponsored by Rede Metrológica of Rio Grande do Sul. The performance was satisfactory during counting organisms among the 30 Brazilian laboratories participating. However, in general, were found difficulties in identifying, indicating the importance of a good qualitative analysis. The method was validated by the Laboratory as a requirement of ISO / IEC 17025, because the Sedgwick-Rafter method used with modification needed to be validated. The validation was performed for samples unpreserved, showing no difference between the results of analysis and samples preserved until three days after collection, even with no refrigerated sample. The method was considered accurate and robust, and have their limit of detection, limit of quantification and uncertainty calculated. Ensure that the method is accurate and reliable monitoring reflects phytoplankton results. Thus, during the monthly monitoring was conducted over a year for six water sources used for public supply, there were periods of cyanobacteria bloom, and the genera present were detected. These data help to assess the water quality and in making decisions about the best way to accomplish water treatment. Therefore, this study showed the necessity of using reliable methods for phytoplankton monitoring. Participation in interlaboratory comparisons is essential in evaluating the performance of laboratories and a means of seeking continuous improvement and training of analysts and the methods used. Also there was a clear need for improvement in the identification cyanobacteria genera, because misidentification can cause errors in the measurement and provide results that do not correspond to the reality of the water supply. In addition, the study showed the importance of phytoplankton monitoring in the assessment of water for public supply. The correct organisms identification determines the actions to be taken in relation to frequency of monitoring or process water treatment.

Orientador: Neura Bragagnolo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-14T07:58:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Almeida_ClaudiaAparecidaSilva.pdf: 1001464 bytes, checksum: 3c27f65564ffb97e7caaa036a1c438ef (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Foi otimizado e validado um método para determinação dos principais fitosteróis em óleos vegetais, utilizando cromatografia gasosa, eliminando-se a etapa preparativa por cromatografia em camada delgada preconizada no método oficial da AOCS. A etapa de extração dos fitosteróis foi otimizada utilizando um planejamento experimental rotacional completo 24, cujas variáveis estudadas foram: temperatura, tempo de saponificação, número de extrações e peso da amostra. Os resultados dos testes de recuperação, obtidos a partir de dois níveis de adição, variaram de 96 a 105% para o b-sitosterol, de 96 a 97% para o campesterol e de 101 a 103% para o estigmasterol. Os limites de detecção e de quantificação foram, respectivamente, 11,4 e 38,0 mg/100g para o b-sitosterol, 2,3 e 7,65 mg/100g para o campesterol e 1,95 e 6,5 mg/100g para o estigmasterol. A identificação dos picos foi confirmada por espectrometria de massas. O método otimizado foi também validado por comparação com a metodologia oficial da AOCS. O resultados não apresentaram diferenças significativas (p>0,05) entre os teores de estigmasterol e b-sitosterol obtidos pelas duas metodologias. Entretanto, foram observadas diferenças significativas (p<0,05) entre os resultados de campesterol sendo que, no método da AOCS os resultados foram significativamente menores. O método otimizado e validado no presente trabalho mostrou ser de fácil execução, rápido, preciso e exato. Como os fitosteróis possuem estruturas semelhantes a do colesterol a metodologia desenvolvida foi otimizada para a determinação simultânea de colesterol e dos principais fitosteróis em óleos vegetais a qual apresentou ótima precisão e exatidão, diminuindo assim os custos e o tempo de análise. A média da porcentagem de recuperação para o colesterol, obtida a partir de três níveis de adição foi de 95,2. A precisão do método foi de 1,6 ± 0,1 mg/100g e os limites de detecção e de quantificação foram de 0,3 e 1,0 mg/100g, respectivamente. A metodologia foi aplicada em óleo de girassol, canola, milho, soja e azeite de oliva sendo analisadas 3 marcas de cada óleo e 10 de azeite. De cada marca foram analisados 3 lotes e todos os lotes foram analisados em triplicata totalizando 108 análises de óleo e 90 de azeite de oliva. Além da determinação dos principais fitosteróis e colesterol as amostras foram analisadas quanto aos parâmetros índice de refração, ácidos graxos livres, índice de peróxidos e composição de ácidos graxos. Dos óleos vegetais analisados no presente trabalho, o menor teor de fitosterol total foi obtido no azeite e o maior no óleo de milho, havendo grandes variações entre os lotes analisados. Quanto aos parâmetros índice de refração, ácidos graxos livres e índice de peróxidos todos os óleos vegetais analisados estão de acordo com a RDC 270 de 22/09/2005 Regulamento Técnico para Óleos Vegetais, Gordura vegetal e Creme Vegetal (ANVISA) enquanto, das 10 marcas de azeite de oliva analisadas 4 amostras apresentaram teores de b-sitosterol abaixo do limite recomendado pela RDC 270 indicando possível adulteração. Duas marcas também apresentaram teores de ácidos graxos 18:2w6, 22:0 e isômeros trans em desacordo com a RDC 270 indicando adulteração / Abstract: A method for phytosterols determination in vegetable oils was optimized and validated using gas chromatography without the thin- layer chromatography preparation step as praised by the AOCS official method. The extraction step for phytosterols was optimized using a design 24, in which the studied variables were: temperature, saponification time, number of extractions and sample weight. The results obtained in the recovering tests, for two levels of fortification, ranged from 96 to 105% for b-sitosterol, from 96 to 97% for campesterol and from 101 to 103% for stigmasterol. The detection and quantification limits were, 11.4 and 38.0 mg/100g for sitosterol, 2.3 and 7.65 mg/100g for campesterol and 1.95 and 6.5 mg/100g for stigmasterol, respectively. The peaks identification was confirmed by mass spectrometry. The optimized method was also validated by comparison with the AOCS. The results showed method no significantly difference (p>0,05) between stigmasterol and b-sitosterol contents, determined using both methods. However, significantly differences (p<0,05) were observed for campesterol results with AOCS method given significantly lower contents. The optimized and validated method presented in this study showed advantages, being easily executable, fast, precise and accurate. As phytosterols have a chemical structure similar to cholesterol, the developed methodology was optimized for the simultaneous determination of cholesterol and phytosterols in vegetable oils and it presented excellent accuracy, reducing analysis costs and time o. The average recovery for the three levels of cholesterol fortification was studied 95.2%. The precision of the developed method was 1.6 ± 0.1 mg/100g and the detection and quantification limits were 0.3 and 1.0 mg/100g, respectively. The methodology was applied for three brands sunflower, canola, corn, soybean oils and ten brands olive oil. Three batches from each brand were analyzed in triplicate, giving a total of 192 vegetable oil analysis. Besides the phytosterols and cholesterol determination, refractive index, free fatty acids, peroxide value and fatty acid composition were carried out in the samples. Olive oil presented the lowest value for phytosterols content and the corn oil the highest value, but there was great variability within the batches. Concerning the refractive index, free fatty acids and peroxide value, almost all samples analyzed were considered acceptable according to the brasilian legislation, but one brand of olive oil was not. Additionally, two brands of olive oil presented detectable amounts of the fatty acids 18:2w, 22:0 and trans isomers in disagreement to the brasilian legislation recommendation, suggesting adulteration / Universidade Estadual de Campi / Ciência de Alimentos / Mestre em Ciência de Alimentos

A gentamicina é um complexo antibiótico de largo espectro, produzido por actinomicetos do gênero Micromonospora e classificado entre os antibióticos aminoglicosídeos, utilizado no tratamento de infecções graves, devidas a microrganismos Gram-negativos. Alterações da sua atividade antimicrobiana, não demonstradas pelos ensaios químicos, podem ser avaliadas pelos ensaios microbiológicos. O objetivo deste trabalho foi comparar os delineamentos experimentais 5 x 1, 2 x 2 e 3 x 1, avaliando-se os parâmetros de validação de especificidade, linearidade, faixa ou intervalo, precisão e exatidão para cada delineamento experimental em diferentes níveis de concentração, apresentações e lotes. O plano de trabalho constituiu-se na realização de 81 ensaios (em 3 réplicas) de doseamento microbiológico de gentamicina. As concentrações das soluções empregadas foram preparadas numa faixa de 1,0 µg/mL a 5,0 µg/mL, diluídos em tampão fosfato 0,1 M pH 8,0. O meio utilizado foi o meio antibiótico no. 11, com Staphyloccocus epidermidis (ATCC 12228). Empregou-se 21 mL de meio como camada base e 4 mL de meio inoculado à 1% como camada superfície. As placas foram incubadas por 16-18 horas à 37 ± 1 °C. Os três delineamentos empregados apresentaram especificidade adequada para análise de creme dermatológico e solução injetável contendo sulfato de gentamicina. Também apresentaram exatidão e linearidade no intervalo avaliado. Os delineamentos não apresentaram diferença significativa quanto a precisão. Os resultados foram comparados através da determinação de índices de capacidade do sistema de medição. A análise estatística demonstrou que não há diferença significativa entre os resultados obtidos pelos delineamentos 5 x 1, 2 x 2 e 3 x 1, sendo equivalentes e intercambiáveis. / Gentamicin is a broad-spectrum antibiotic complex produced by actinomycetes belonging to Micromonospora genus and classified among aminoglycoside antibiotics, used in the treatment of serious infections derived from Gram-negative microorganisms. Alterations of their antimicrobial activity not shown in chemical assays can be evaluated through microbiological assays. The aim of this work was to compare 5 x 1, 2 x 2 and 3 x 1 experimental designs, evaluating validation parameters of specificity, linearity, range, precision, and accuracy for each experimental design in different levels of concentration, presentation, and lots. It consisted of 81 assays (in 3 replicas) of gentamicin microbiological dosage. The concentrations of the solutions used were employed in a range from 1.0 µg/ml to 5.0 µg/ml, diluted in phosphate buffer 0.1 M pH 8.0. Antibiotic medium number 11 was used, with Staphyloccocus epidermis (ATCC 12228)21ml of medium were used as base layer and 4 ml of medium inoculated at 1% were used as surface layer. The plates were incubated for 16-18 hours at 37 ± 1 ºC. The three designs employed showed adequate specificity for analysis of dermatological cream and injectable solution containing gentamicin sulphate. They also showed accuracy and linearity in the range evaluated, but not a significant difference concerning precision. The results were compared by means of the determination of the rates of measurement system capacity. The statistical analysis demonstrated that there is no significant difference among the results obtained.

This diploma thesis focuses on validation of RP–HPLC method for determination of organic acids in fruit juices. The aim of this thesis was to determine suitability of the method for verification of the fruit juices authenticity based on analysis of organic acids. The theoretical part describes chemical composition of fruit and fruit juices and focuses on organic acids. It provides description of various methods of organic acids analysis with more detailed description of High Performance Liquid Chromatography and its validation. The experimental part focuses on optimalization and validation of the method. Samples of malic, citric, succinic and ascorbic acid were analysed. The optimalized method was validated and following performance parameters were determined: repeatability, linearity, limit of detection (LOD) limit of quantitation (LOQ). RP–HPLC method was applied to real samples of 100% fruit juices (apple, orange and grapefruit) and the authenticity parameters were verified.

This diploma thesis focuses on optimization and validation of the method for a mixture of tetracycline antibiotics (oxytetracycline, tetracycline) determination using high performance liquid chromatography with a diode array detector (HPLC–DAD). The aim of this thesis was to determine suitability of the system for the determination of these antibiotics in milk. The theoretical part is focused on individual groups of antibiotics and their mechanism of action, resistances and possibilities of use. Next point of this thesis is legislation, which describes permitted amounts of antibiotics in milk. In this study, the HPLC method and validation parameter is described in detail. The experimental part deals with creation and optimization of the method and its validation. Following validation parameters were verified: system suitability, linearity, method accuracy, limit of detection and quantification, robustness. The results obtained indicate mostly suitable ratio of mobile phase of 0,01 M trifluoracetic acid:methanol:acetonitrile = 80:10:10. The wavelength 355 nm was found as the most feasible for this method after evaluating the result. Determination of robustness showed that the method is robust, and the only significant effect on the robustness was observed in column changes.

In this work a new simplified procedure for isolation and determination of PAH in smoked meat products was developed. This procedure is using ASE as selective extraction technique. Its principle is addition of silicagel activated during 18 hours at 140 °C directly to the extraction cell in ratio 10 g to 1 g of homogenized sample. In the next step the sample is extracted by n-hexane at 100 °C and 10 MPa for three 10 minutes static extraction cycles. The flush volume is 60 % and the purge time 120 sec. During the extraction silicagel adsorb koextracted lipids and thus the obtained extract is suitable for immediate HPLC-FLD analysis. On the contrary, the classical extraction procedures with nonpolar solvent require difficult purification of extract for removal of unwanted lipids. Mostly applied techniques here are GPC and SPE. The new procedure was validated for determination of B[a]P as well as for determination of 4 PAH (B[a]A, CHR, B[b]F, B[a]P) in smoked sausages. It meets all requirements to be set by Regulation (EC) No 333/2007, respective by new Regulation (EC) No 836/2011. After the method validation, the content of 4 PAH was investigated in twelve samples of various smoked sausages manufactured in Slovakia. Two analyzed products showed high PAH levels exceeding maximum legislation limits set for B[a]P as well as for sum of 4 PAH by Regulation (EC) No 835/2011.

In forensic toxicology, analysis of drugs and metabolites in biological fluids is performed to determine cause of death, suspected drug use, drug facilitated sexual assaults, or whether someone was driving under the influence. Analyte identification and concentration determination can be determined in a variety of matrices (e.g., blood, urine, or oral fluid) and can be complex. It is therefore necessary to have optimal sample preparation and instrumental conditions that work for all matrices of interests. Determining the best approach can be challenging due to the amount of time and resources to perform expansive evaluations of sample preparation, stationary/mobile phases, liquid chromatography (LC) conditions and mass spectrometry (MS) operating parameters. In this study three different sample preparation methods were validated for blood and urine. The three sample preparation methods were solid-phase extraction (SPE), supported liquid extraction (SLE), and liquid-liquid extraction (LLE). Six different drug groups were used as the analytes being tested by the methods. These drug groups were amphetamines, local anesthetics, opioids, hallucinogens, antidepressants, and novel psychoactive substances (NPS). A total of twenty-three drugs were used: amphetamine, methamphetamine, (3,4-methylenedioxyamphetamine (MDA), 3,4-methylenedioxy-N-ethylamphetamine (MDEA), and 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA), benzoylecgonine (BZE), cocaine, lidocaine, codeine, methadone, morphine, 6-monoacetylmorphine (6-MAM), fentanyl, oxycodone, lysergic acid diethylamide (LSD), phencyclidine (PCP), amitriptyline, citalopram, fluoxetine, trazodone, ethylone, α-pyrrolidinopentiophenone (α-PVP), and 25I-NBOMe. The methods were validated according to guidelines set forth by the Scientific Working Group for Forensic Toxicology (SWGTOX) Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology and the American Academy of Forensic Science (AAFS) Standards Board (ASB) draft of Standard Practices for Method Validation in Forensic Toxicology. Parameters of calibration model, bias, precision, limit of detection (LOD), limit of quantitation (LOQ), dilution integrity, ion suppression/enhancement, interference studies, and stability were evaluated. Recovery was also assessed to determine the efficiency of the extraction. Calibration models met the 0.98 R2 minimum requirement. For all sample preparations the compounds evaluated in each were found to be stable for at least 72 hours. Interferences were found to be similar across all three sample preparation methods. Parameters of bias, precision, and dilution integrity were largely comparable between all three methods. Overall for LOD, SLE resulted in lower values for blood and urine ranging for 0.1 to 5 ng/mL. Overall for LOQ, SLE resulted in lower values for blood and LLE resulted in lower values for urine in the range of 0.5-10 ng/mL. SLE resulted in the highest recovery for all twenty-three analytes, due to LLE failing to extract consistently or completely for benzoylecgonine, morphine, and 6-monoacetylmorphine. Overall, SLE resulted in the lowest percent values for ion suppression and enhancement for both blood and urine. Overall, blood resulted in high ion suppression (exceeding -20%) for SPE and LLE. Final determination overall was that SLE was the best sample preparation method for all twenty-three analytes. This was determined based on the evaluation of recovery, ion suppression/enhancement, and LOD, as well as sample preparation time. Sample preparation time for SLE was approximately 1 hour, while SPE took 2.5 hours and LLE 2 hours.