Der Folsäureantagonist Methotrexat (MTX) wird zur Behandlung onkologischer und rheumatoider Erkrankungen eingesetzt. Die Aufnahme des Methotrexats in die Zielzelle ist dabei Vorraussetzung für die Bindung an seine intrazellulären Zielstrukturen und erfolgt über verschiedene Transportsysteme. In diesem Zusammenhang ist bei entsprechenden Plasma-konzentrationen von MTX der Reduced Folate Carrier (RFC1) von besonderer Bedeutung. 1994 konnte erstmals die cDNA dieses Transporters aus Maus- und Hamstergewebe isoliert werden. Die cDNA für einen mit dem RFC1 identischen hepatozellulären MTX-Transporter der Ratte wurde 2000 kloniert. Vorhergehende Gen-Expressionsstudien zeigten, dass die RFC1-mRNA ubiquitär gebildet wird. Die Proteinexpression wurde jedoch bisher nur in ausgewählten Geweben der Maus untersucht. Systematische Arbeiten, in denen in vergleichender Weise sowohl die RFC1 Gen- als auch die Proteinexpression in allen Geweben mit einer möglichen Relevanz für die Folat- und Antifolataufnahme, Speicherung und Eliminierung untersucht werden, fehlten bisher. Insbesondere die Expression des RFC1-Proteins der Ratte (rRFC1) mittels immunologischer Verfahren ist bisher nicht beschrieben worden. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Gen- und Proteinexpression des rRFC1 in ausgewählten Geweben der Ratte darzustellen. Dieses schließt die Generierung spezifischer Antiseren gegen den rRFC1 als ersten Schritt mit ein. Es wurden geeignete antigene Aminosäuresequenzen des rRFC1 bestimmt und die entsprechenden cDNA Sequenzen wurden amplifiziert und in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert. Rekombinante rRFC1 Fusionsproteine konnten mittels E. coli Zellen hergestellt und anschließend aufgereinigt werden. Nachfolgend wurden entweder die rRFC1 Fusionsproteine oder die rRFC1 spezifischen Peptide, welche von dem Affinitätspeptid separiert worden waren, für die Immunisierung von Kaninchen verwendet Drei Antiseren mit ausreichender Reaktivität und Spezifität konnten gewonnen und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Die erhaltenen Antiseren sind gegen die intrazellulären N- und C-terminalen Regionen (ID1, ID7) bzw. gegen die erste extrazelluläre Schleife (OD1) gerichtet. In Western-Blot Studien konnte mittels dieser Antiseren für den rRFC1, der in transfizierten Nierenepithelzellen (MDCK-rRFC-HA) stabil exprimiert wurde, ein Molekulargewicht von 71 kD für die glykosylierte Form und von 53 kD für die unglykosylierte Form ermittelt werden. Weiter konnte belegt werden, dass das Protein in MDCK-rRFC1-HA Zellen überwiegend in der glycosylierten Form vorliegt. Mittels RT-PCR Analysen wurde die Genexpression des rRFC1 in allen untersuchten Geweben nachgewiesen. Besonders hohe mRNA-Gehalte waren in Thymus, Niere und Milz vorhanden, während in Herz- und Muskelgewebe sowie in Leukozyten nur ein Signal nahe der Nachweisgrenze detektierbar war. Durch immunhistologische Untersuchungen konnten die rRFC1 Proteinexpression und beträchtliche Unterschiede in der Signalintensität bestätigt werden. Zusätzlich konnten neue Informationen über die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation gewonnen werden: so konnte eine starke Expression des Transporters in der apikalen Membran von Dünn- und Dickdarmmukosa dargestellt werden, während die ebenfalls starke Färbung in der Niere auf den Bereich der basolateralen Membran der Tubuli beschränkt war. In der Leber war eine Expression mittlerer Intensität im Bereich der Lebertrias erkennbar. Während in der Milz nur in der roten Pulpa das RFC1-Protein detektiert wurde, konnten im Thymus sowohl in der Rinde als auch im Mark positive Zellen nachgewiesen werden. Im Hoden konnte der Transporter in den Sertoli-Zellen dargestellt werden. Eine starke Expression des Transporters wurde im Gehirn im Bereich der apikalen Membran der Ependymzellen des Plexus choroideus nachgewiesen. In der Skelettmuskulatur und im Herzgewebe beschränkte sich die Expression des rRFC1 auf das Perimysium des Muskelgewebes und auf kleinere Gefäße des Muskel- und Herzgewebes. In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass der RFC1 der Ratte ubiquitär exprimiert wird, wobei die Expressionsstärke jedoch stark variiert. Die beobachtete Gewebslokalisation des RFC1 belegt sowohl dessen zentrale Rolle in der Folathomöostase als auch in der MTX vermittelten Organtoxizität und Pharmakokinetik, insbesondere bei der intestinalen Resorption sowie der hepatischen und renalen Exkretion.

Die Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine multifaktoriell bedingte Autoimmunerkrankung, die durch entzündlichen Gelenksbefall charakterisiert ist. Unter fehlender oder ungenügender therapeutischer Intervention nimmt die Erkrankung einen progressiven Verlauf, der zu Gelenkdestruktionen und damit zu zunehmender Behinderung, sowie Arbeitsunfähigkeit führt. Neben den Einschränkungen in der Gelenkfunktion können in jedem Krankheitsstadium Allgemeinsymptome und vielfältige extraartikuläre Manifestationen auftreten, sodass die Erkrankung mit einer verkürzten Lebenserwartung bzw. erhöhter Mortalität assoziiert ist. Obwohl in den letzten Jahren deutliche Fortschritte in der Therapie erzielt wurden, ist eine definitive Heilung nicht möglich. Gemäß der EULAR-Guidelines von 2019 ist Methotrexat (MTX) weiterhin als „anchor drug“ in der RA das Erstlinienmedikament der Wahl. Bei Therapieversagen von MTX und dem Fehlen von negativen Prognoseparametern kann als Zweitlinientherapie ein anderes konventionelles DMARD (csDMARD) in Monotherapie oder Kombination eingesetzt werden. Eine der Optionen ist Leflunomid (LEF), das in Studien seine Wirksamkeit als DMARD und seine Überlegenheit gegenüber Placebo bewiesen hat. Es ist aber nach wie vor nicht wirklich geklärt, ob Patienten im klinischen Alltag tatsächlich von einer Therapie mit LEF oder LEF/MTX profitieren, insbesondere nach dem Versagen einer Erstlinientherapie mit MTX. Dazu wurde in der vorliegenden Untersuchung der Alltagseinsatz und Nutzen von LEF sowohl in Monotherapie als auch in Kombination mit MTX analysiert. Es handelt sich um eine historisch prospektive Kohortenstudie mit Patienten der Rheumatologischen Ambulanz des Universitätsklinikums Dresden. Es erfolgte die Einteilung der Studienkohorte (n=158) in zwei Untergruppen. In der erweiterten LEF-Kohorte (eLEF) befanden sich alle Patienten, welche zu einem beliebigen Zeitpunkt zwischen 2007 und 2015 mit LEF (n=103) oder mit LEF/MTX (n=49) behandelt worden waren. In der post MTX-Kohorte (pMTX-Gruppe) befanden sich alle Patienten, die nach dem Versagen einer Erstlinientherapie mit MTX zwischen 2007 und 2015 mit LEF (n=39) oder LEF/MTX (n=16) als Zweitlinientherapie behandelt worden waren. Es wurde das Therapieüberleben mittels Kaplan-Meier-Kurven, sowie der klinische Verlauf im ersten Jahr mittels Scoresystemen (CDAI) erfasst. Zudem wurden Nebenwirkungen, Absetzgründe und radiographischer Progress analysiert. Sowohl in der eLEF-Gruppe als auch in der pMTX-Gruppe lag ein signifikant schlechteres Gesamttherapieüberleben in Kombinationstherapie von LEF/MTX im Vergleich zur Monotherapie mit LEF vor (eLEF p=0,004; pMTX p=0,002; Signifikanzniveau p=0,05). Im klinischen Verlauf zeigten sich keine signifikanten Unterschiede, lediglich der Startscorewert der Kombinationstherapie war signifikant höher als unter Monotherapie. Beide Therapieregime konnten eine durchschnittliche Verbesserung von moderater zu niedriger Krankheitsaktivität, aber nicht bis in Remission erreichen. Insgesamt lag eine hohe Abbrecherzahl innerhalb des ersten Behandlungsjahres unabhängig vom Therapieregime vor. Der wichtigste Absetzgrund war (außer in der pMTX-Gruppe unter LEF/MTX) Wirkversagen, von dem etwa jeder zweite Patient betroffen war. Der andere wesentliche Absetzgrund waren Nebenwirkungen, hier war etwa jeder vierte bis fünfte Patient betroffen. Zudem traten unter Kombinationstherapie mehr Nebenwirkungen als unter Monotherapie auf. Radiographischer Progress spielte in der vorliegenden Kohorte keine relevante Rolle. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie Hinweise, dass die Kombinationstherapie der Monotherapie nicht überlegen ist. Daher wäre durchaus vertretbar, bei einem Therapiewechsel primär eine Monotherapie anzustreben, was sich unter Berücksichtigung des langjährigen Therapiebedarfs und des höheren Patientenalters positiv auf Interaktionen mit anderen Medikamenten, auf Nebenwirkungen und auf die Compliance der Patienten auswirken könnte. Zugleich könnten Kosten gespart werden. Aufgrund des längerfristig nicht überzeugenden Verlaufes, sollte ein Wechsel auf ein zweites csDMARD (oder die Etablierung einer Kombinationstherapie) nach Versagen von MTX entsprechend der Leitlinien der EULAR nur bei Fehlen negativer Prognosefaktoren und in höherem Lebensalter, sowie mit einem engmaschigen Therapiemonitoring (klinisch, laborchemisch, radiologisch) erfolgen. Dennoch ist bei weltweitem Auftreten der Erkrankung die Medikation mit LEF weiterhin eine preisgünstigere Alternative für die Länder, wo zusätzliche Ressourcen knapp sind.:Inhaltsverzeichnis V Abbildungen VIII Tabellen X Glossar XII Akürzungsverzeichnis XIX 1 Einleitung und Fragestellung 1 2 Die Rheumatoide Arthritis (RA) 3 2.1 Epidemiologie 3 2.2 Ätiologie 4 2.2.1 Genetische Veränderungen 4 2.2.2 Epigenetische Veränderungen 5 2.2.3 Nicht genetische Faktoren/Umwelt 5 2.3 Pathophysiologie/Pathogenese 8 2.3.1 Synovium 8 2.3.2 Weitere Antikörper 12 2.3.3 Krankheitsverlauf 12 2.4 Klinisches Bild 14 2.4.1 Gelenkbefall 14 2.4.2 Differentialdiagnosen 16 2.4.3 Extraartikuläre Manifestationen 19 2.4.4 Sonderformen 23 2.5 Diagnostik 23 2.5.1 Labor 24 2.5.2 Bildgebung 25 2.6 Therapie 27 2.6.1 Medikamentöse Basistherapie 27 2.6.2 Weitere Aspekte zum Einsatz von bDMARDs/ tsDMARDs 32 2.6.3 Einschätzung der Krankheitsaktivität 33 2.6.4 Ko-Medikation und begleitende nichtmedikamentöse Therapien 36 2.7 Prognose 37 2.7.1 Komorbiditäten 39 2.7.2 Mortalität 40 3 Leflunomid (LEF) 42 3.1 Wirkmechanismus 42 3.2 Pharmakologische Aspekte 43 3.3 Arzneimittelinteraktionen 44 3.4 Wirksamkeit 45 3.4.1 Klinisch 45 3.4.2 Radiologischer Progress 46 3.4.3 Kombinationstherapien 47 3.5 Nebenwirkungen 48 3.5.1 Spezielle Nebenwirkungen 49 3.6 Praktische Anwendung 55 3.7 Kontraindikationen 56 4 Studienergebnisse 58 4.1 Material und Methoden 58 4.2 Patientenpool und Vergleichsgruppen 59 4.2.1 Weitere Subgruppen 64 4.2.2 Patientencharakteristika 66 4.2.3 Nachverfolgung 67 4.3 Therapieüberleben 68 4.3.1 Ergebnisübersicht: Therapie- und Patientengruppen 68 4.3.2 Ergebnisübersicht möglicher Einflussfaktoren 69 4.4 Therapieverlauf im ersten Jahr 78 4.4.1 Ergebnisübersicht CDAI 78 4.4.2 Ergebnisübersicht SDAI 80 4.4.3 Ergebnisübersicht DAS28 81 4.4.4 Entzündungsparameter 83 4.4.5 Therapiewirksamkeit und Therapieabbruch 87 4.4.6 Vorliegen von Prognosefaktoren 89 4.5 Nebenwirkungen 93 4.5.1 Ergebnisübersicht eLEF-Gruppe 93 4.5.2 Ergebnisübersicht pMTX 96 4.6 Absetzgründe 100 4.6.1 Ergebnisübersicht 100 4.7 Röntgenprogress 103 4.7.1 Ergebnisübersicht 103 5 Interpretation und Diskussion 105 5.1 Therapieüberleben 105 5.2 Therapieverlauf im ersten Jahr 108 5.3 Nebenwirkungen 111 5.4 Therapievergleiche 113 5.5 Röntgenprogress 115 6 Schlussfolgerung 117 7 Anhang 120 7.1 Zusäzliche Abbildungen zu Kapitel 2 120 7.2 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 4 122 7.2.1 LEF-Erstlinie 122 7.2.2 Therapieüberleben: Zusätzliche Vergleiche in Abhängigkeit der Therapie 123 7.2.3 Therapieüberleben in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Kombinationstherapie 126 7.2.4 Therapieverlauf im ersten Jahr: Statistische Tests 128 7.2.5 Zusammenhang zwischen CRP bzw. BSG und CDAI für pMTX 133 7.2.6 Nebenwirkungen in Abhängigkeit vom Serostatus 134 7.2.7 pMTX-LM-L-Gruppe 135 7.3 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 5 136 7.3.1 LEF und Prednisolon 136 8 Literaturverzeichnis 139 / Rheumatoid arthritis (RA) is a multifactorial autoimmune disease characterized by inflammatory joint involvement. In the absence or inadequacy of therapeutic intervention, the disease takes a progressive course, leading to joint destruction, increasing disability, and incapacity to work. In addition to limitations in joint function, general symptoms and multiple extra-articular manifestations may occur at any stage of the disease, so that the disease is associated with a shortened life expectancy and increased mortality. Although significant advances in therapy have been made in recent years, a definitive cure is not possible. According to the 2019 EULAR guidelines, Methotrexate (MTX) remains the first-line drug of choice as the 'anchor drug' in RA. In case of treatment failure of MTX and the absence of poor prognostic factors, another conventional DMARD (csDMARD) can be used as second-line therapy in monotherapy or combination. One of the options is Leflunomide (LEF), which has demonstrated its efficacy as a DMARD and its superiority to placebo in trials. However, it is still not really clear whether patients actually benefit from therapy with LEF or LEF/MTX in daily clinical practice, especially after failure of first-line therapy with MTX. To this end, the present study analyzed the everyday use and benefit of LEF both in monotherapy and in combination with MTX. It is a historical prospective cohort study with patients of the Rheumatologic Outpatient Clinic of the University Hospital of Dresden. The study cohort (n=158) was divided into two subgroups. The extended LEF cohort (eLEF) included all patients who had been treated with LEF (n=103) or with LEF/MTX (n=49) at any time between 2007 and 2015. The post MTX cohort (pMTX group) included all patients who had been treated with LEF (n=39) or LEF/MTX (n=16) as second-line therapy after failure of first-line MTX between 2007 and 2015. Treatment survival was assessed using Kaplan-Meier curves, and clinical outcome in the first year was assessed using scoring systems (CDAI). In addition, side effects, discontinuation reasons, and radiographic progression were analyzed. In both the eLEF group and the pMTX group, there was a significantly worse overall therapy survival in combination therapy of LEF/MTX compared to monotherapy with LEF (eLEF p=0.004; pMTX p=0.002; significance level p=0.05). There were no significant differences in the clinical course, only the start score of the combination therapy was significantly higher than under monotherapy. Both therapy regimens were able to achieve an average improvement from moderate to low disease activity, but not to remission. Overall, a high dropout rate was present within the first year of treatment regardless of the therapy regimen. The main discontinuation reason (except in the pMTX group on LEF/MTX) was efficacy failure, affecting approximately one in two patients. The other major reason for discontinuation was side effects, affecting approximately one in four to five patients. In addition, more side effects occurred with combination therapy than with monotherapy. Radiographic progression did not play a relevant role in the present cohort. In summary, the present study shows some evidence that combination therapy is not superior to monotherapy. Therefore, it would be quite justifiable to aim primarily for monotherapy when changing therapy, which could have a positive effect on interactions with other drugs, on side effects, and on patient compliance, taking into account the long-term need for therapy and the higher patient age. At the same time, costs could be saved. Due to the unconvincing course in the longer term, a switch to a second csDMARD (or the establishment of a combination therapy) after failure of MTX should, according to the EULAR guidelines, only be made in the absence of poor prognostic factors and at an higher age, as well as with close-meshed therapy monitoring (clinical, laboratory, radiological). Nevertheless, with worldwide occurrence of the disease, medication with LEF continues to be a less expensive alternative for countries where additional resources are scarce.:Inhaltsverzeichnis V Abbildungen VIII Tabellen X Glossar XII Akürzungsverzeichnis XIX 1 Einleitung und Fragestellung 1 2 Die Rheumatoide Arthritis (RA) 3 2.1 Epidemiologie 3 2.2 Ätiologie 4 2.2.1 Genetische Veränderungen 4 2.2.2 Epigenetische Veränderungen 5 2.2.3 Nicht genetische Faktoren/Umwelt 5 2.3 Pathophysiologie/Pathogenese 8 2.3.1 Synovium 8 2.3.2 Weitere Antikörper 12 2.3.3 Krankheitsverlauf 12 2.4 Klinisches Bild 14 2.4.1 Gelenkbefall 14 2.4.2 Differentialdiagnosen 16 2.4.3 Extraartikuläre Manifestationen 19 2.4.4 Sonderformen 23 2.5 Diagnostik 23 2.5.1 Labor 24 2.5.2 Bildgebung 25 2.6 Therapie 27 2.6.1 Medikamentöse Basistherapie 27 2.6.2 Weitere Aspekte zum Einsatz von bDMARDs/ tsDMARDs 32 2.6.3 Einschätzung der Krankheitsaktivität 33 2.6.4 Ko-Medikation und begleitende nichtmedikamentöse Therapien 36 2.7 Prognose 37 2.7.1 Komorbiditäten 39 2.7.2 Mortalität 40 3 Leflunomid (LEF) 42 3.1 Wirkmechanismus 42 3.2 Pharmakologische Aspekte 43 3.3 Arzneimittelinteraktionen 44 3.4 Wirksamkeit 45 3.4.1 Klinisch 45 3.4.2 Radiologischer Progress 46 3.4.3 Kombinationstherapien 47 3.5 Nebenwirkungen 48 3.5.1 Spezielle Nebenwirkungen 49 3.6 Praktische Anwendung 55 3.7 Kontraindikationen 56 4 Studienergebnisse 58 4.1 Material und Methoden 58 4.2 Patientenpool und Vergleichsgruppen 59 4.2.1 Weitere Subgruppen 64 4.2.2 Patientencharakteristika 66 4.2.3 Nachverfolgung 67 4.3 Therapieüberleben 68 4.3.1 Ergebnisübersicht: Therapie- und Patientengruppen 68 4.3.2 Ergebnisübersicht möglicher Einflussfaktoren 69 4.4 Therapieverlauf im ersten Jahr 78 4.4.1 Ergebnisübersicht CDAI 78 4.4.2 Ergebnisübersicht SDAI 80 4.4.3 Ergebnisübersicht DAS28 81 4.4.4 Entzündungsparameter 83 4.4.5 Therapiewirksamkeit und Therapieabbruch 87 4.4.6 Vorliegen von Prognosefaktoren 89 4.5 Nebenwirkungen 93 4.5.1 Ergebnisübersicht eLEF-Gruppe 93 4.5.2 Ergebnisübersicht pMTX 96 4.6 Absetzgründe 100 4.6.1 Ergebnisübersicht 100 4.7 Röntgenprogress 103 4.7.1 Ergebnisübersicht 103 5 Interpretation und Diskussion 105 5.1 Therapieüberleben 105 5.2 Therapieverlauf im ersten Jahr 108 5.3 Nebenwirkungen 111 5.4 Therapievergleiche 113 5.5 Röntgenprogress 115 6 Schlussfolgerung 117 7 Anhang 120 7.1 Zusäzliche Abbildungen zu Kapitel 2 120 7.2 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 4 122 7.2.1 LEF-Erstlinie 122 7.2.2 Therapieüberleben: Zusätzliche Vergleiche in Abhängigkeit der Therapie 123 7.2.3 Therapieüberleben in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Kombinationstherapie 126 7.2.4 Therapieverlauf im ersten Jahr: Statistische Tests 128 7.2.5 Zusammenhang zwischen CRP bzw. BSG und CDAI für pMTX 133 7.2.6 Nebenwirkungen in Abhängigkeit vom Serostatus 134 7.2.7 pMTX-LM-L-Gruppe 135 7.3 Zusäzliche Analysen zu Kapitel 5 136 7.3.1 LEF und Prednisolon 136 8 Literaturverzeichnis 139

Der Folsäureantagonist Methotrexat (MTX) wird zur Behandlung onkologischer und rheumatoider Erkrankungen eingesetzt. Die Aufnahme des Methotrexats in die Zielzelle ist dabei Vorraussetzung für die Bindung an seine intrazellulären Zielstrukturen und erfolgt über verschiedene Transportsysteme. In diesem Zusammenhang ist bei entsprechenden Plasma-konzentrationen von MTX der Reduced Folate Carrier (RFC1) von besonderer Bedeutung. 1994 konnte erstmals die cDNA dieses Transporters aus Maus- und Hamstergewebe isoliert werden. Die cDNA für einen mit dem RFC1 identischen hepatozellulären MTX-Transporter der Ratte wurde 2000 kloniert. Vorhergehende Gen-Expressionsstudien zeigten, dass die RFC1-mRNA ubiquitär gebildet wird. Die Proteinexpression wurde jedoch bisher nur in ausgewählten Geweben der Maus untersucht. Systematische Arbeiten, in denen in vergleichender Weise sowohl die RFC1 Gen- als auch die Proteinexpression in allen Geweben mit einer möglichen Relevanz für die Folat- und Antifolataufnahme, Speicherung und Eliminierung untersucht werden, fehlten bisher. Insbesondere die Expression des RFC1-Proteins der Ratte (rRFC1) mittels immunologischer Verfahren ist bisher nicht beschrieben worden. Ziel dieser Arbeit war es daher, die Gen- und Proteinexpression des rRFC1 in ausgewählten Geweben der Ratte darzustellen. Dieses schließt die Generierung spezifischer Antiseren gegen den rRFC1 als ersten Schritt mit ein. Es wurden geeignete antigene Aminosäuresequenzen des rRFC1 bestimmt und die entsprechenden cDNA Sequenzen wurden amplifiziert und in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert. Rekombinante rRFC1 Fusionsproteine konnten mittels E. coli Zellen hergestellt und anschließend aufgereinigt werden. Nachfolgend wurden entweder die rRFC1 Fusionsproteine oder die rRFC1 spezifischen Peptide, welche von dem Affinitätspeptid separiert worden waren, für die Immunisierung von Kaninchen verwendet Drei Antiseren mit ausreichender Reaktivität und Spezifität konnten gewonnen und mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt werden. Die erhaltenen Antiseren sind gegen die intrazellulären N- und C-terminalen Regionen (ID1, ID7) bzw. gegen die erste extrazelluläre Schleife (OD1) gerichtet. In Western-Blot Studien konnte mittels dieser Antiseren für den rRFC1, der in transfizierten Nierenepithelzellen (MDCK-rRFC-HA) stabil exprimiert wurde, ein Molekulargewicht von 71 kD für die glykosylierte Form und von 53 kD für die unglykosylierte Form ermittelt werden. Weiter konnte belegt werden, dass das Protein in MDCK-rRFC1-HA Zellen überwiegend in der glycosylierten Form vorliegt. Mittels RT-PCR Analysen wurde die Genexpression des rRFC1 in allen untersuchten Geweben nachgewiesen. Besonders hohe mRNA-Gehalte waren in Thymus, Niere und Milz vorhanden, während in Herz- und Muskelgewebe sowie in Leukozyten nur ein Signal nahe der Nachweisgrenze detektierbar war. Durch immunhistologische Untersuchungen konnten die rRFC1 Proteinexpression und beträchtliche Unterschiede in der Signalintensität bestätigt werden. Zusätzlich konnten neue Informationen über die unterschiedliche subzelluläre Lokalisation gewonnen werden: so konnte eine starke Expression des Transporters in der apikalen Membran von Dünn- und Dickdarmmukosa dargestellt werden, während die ebenfalls starke Färbung in der Niere auf den Bereich der basolateralen Membran der Tubuli beschränkt war. In der Leber war eine Expression mittlerer Intensität im Bereich der Lebertrias erkennbar. Während in der Milz nur in der roten Pulpa das RFC1-Protein detektiert wurde, konnten im Thymus sowohl in der Rinde als auch im Mark positive Zellen nachgewiesen werden. Im Hoden konnte der Transporter in den Sertoli-Zellen dargestellt werden. Eine starke Expression des Transporters wurde im Gehirn im Bereich der apikalen Membran der Ependymzellen des Plexus choroideus nachgewiesen. In der Skelettmuskulatur und im Herzgewebe beschränkte sich die Expression des rRFC1 auf das Perimysium des Muskelgewebes und auf kleinere Gefäße des Muskel- und Herzgewebes. In dieser Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass der RFC1 der Ratte ubiquitär exprimiert wird, wobei die Expressionsstärke jedoch stark variiert. Die beobachtete Gewebslokalisation des RFC1 belegt sowohl dessen zentrale Rolle in der Folathomöostase als auch in der MTX vermittelten Organtoxizität und Pharmakokinetik, insbesondere bei der intestinalen Resorption sowie der hepatischen und renalen Exkretion.

Das Fehlen des FMR1-Genprodukts FMRP ist ursächlich für die Entstehung des Phänotyps bei Patienten mit Fragilem-X-Syndrom. Es kommt hierbei auf Grund einer Hypermethylierung der DNA im Bereich der FMR1-Promotorregion zu einer Hemmung der Transkription. Im Rahmen dieser Arbeit wurde untersucht, ob eine Behandlung mit Methotrexat, welches eine Hypomethylierung der DNA verursacht, eine Therapieoption für Patienten mit Fragilem-X-Syndrom darstellt. Es wurden Fibroblasten von Patienten mit Fragilem-X-Syndrom kultiviert und währenddessen mit Methotrexat behandelt. Hierbei trat eine Reaktivierung der FMR1-Transkription auf, FMRP konnte allerdings nicht reproduzierbar detektiert werden. Auch in der Untersuchung des Methylierungsstatus der FMR1-Promotorregion zeigte sich nach Behandlung keine Reduktion der Methylierung. Der fehlende Nachweis von FMRP in den behandelten Patientenzellen macht es unwahrscheinlich, dass MTX im Rahmen dieser Erkrankung klinische Anwendung finden wird.