Tübingen, Univ., Diss., 2004.

Regensburg, Univ., Diss., 2008.

Die Regulation krankheitsrelevanter Gene und deren Proteine über Veränderungen in der DNA-Methylierung stellen einen wichtigen und zugleich noch unzureichend erforschten Bereich bei Erkrankungen mit inflammatorischer Komponente dar. In dieser Arbeit wurde die Methylierung pro- und antiinflammatorischer Gene im hypoxischen Setting hervorgerufen durch Präeklampsie, Angsterkrankung und Inflammation bei Sklerodermie untersucht. Zur Bestimmung der prozentualen Methylierung wurde Pyrosequenzierung durchgeführt. Bei einem Teil der Proben erfolgte zusätzlich die Bestimmung der Genexpression mittels Real Time PCR. Bei Angsterkrankung zeigte sich eine signifikante Hypermethylierung am Promotor des Treg spezifischen Transkriptionsfaktors FOXP3. Daraus könnte eine beeinträchtigte Funktion der Tregs und somit eine erhöhte Komorbidität resultieren. In der Gruppe der an Sklerodermie erkrankten Personen zeigte sich entgegen den Erwartungen eine signifikant höhere RORC1 und RORC2 Methylierung. Eine Genexpressionsanalyse erbrachte eine signifikant niedrigere Expression von RORC bei Sklerodermie im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Diese überraschenden Ergebnisse könnten der Methodik geschuldet sein. Auf eine Auftrennung der verschiedenen T-Zellen vor Messung der Methylierung wurde verzichtet. Plazentagewebe bei Präeklampsie zeigte eine signifikant geringere Methylierung am FOXP3 Promotor als Plazentagewebe von gesunden Schwangeren. Die Veränderbarkeit der DNA-Methylierung durch äußere Einflüsse und Medikamente stellt hierbei einen vielversprechenden Ansatzpunkt für zukünftige Therapien dar und sollte in weiteren Studien konkretisiert werden. / Epigenetic research offers new insights about the regulation of gene activities and provides important knowledge of the pathogenesis of diseases. Hypoxic conditions through preeclampsia, panic disease and inflammation in systemic sclerosis were used to measure the methylation level of pro- and anti-inflammatory genes. The analyses were performed with PBMCs and placental tissue. To determine the methylation level pyrosequencing was used. Gene expression through real time PCR was additionally analyzed with part of the samples. A significant hypermethylation of the promoter of the Treg specific transcription factor FOXP3 in patients with panic diseases was shown. This could be a reason for the impaired function of Tregs in panic disorder and could cause the comorbidity of several diseases. Against expectations the transcription factor RORC was significantly higher methylated in patients with scleroderma and the gene expression was lower compared to the healthy control group. This surprising result might be caused through the used methods: t-cells were not divided into their subgroups. It could be possible that Th1- and Th2-cells are responsible for the hypermethylation of RORC. Placental tissue of patients with preeclampsia showed significant lower methylation levels of the FOXP3 promoter than tissue of healthy pregnant women. The convertibility of DNA methylation with external factors and pharmaceuticals is a promising approach for therapies and should be substantiated in future studies.

The focus of this work was the development and application of highly efficient RNA catalysts for the site-specific modification of RNA with special focus on methylation. In the course of this thesis, the first methyltransferase ribozyme (MTR1), which uses m6G as the methyl group donor was developed and further characterized. The RNA product was identified as the natural modification m1A. X-Ray crystallography was used to solve the 3D structure of the ribozyme, which directly suggested a plausible reaction meachnism. The MTR1 ribozyme was also successfully repurposed for a nucleobase transformation reaction of a purine nucleoside. This resulted in a formyl-imidazole moiety directly on the intact RNA, which was directly used for further bioconjugation reactions. Finally, additional selections and reselections led to the identification of highly active alkyltransferase ribozymes that can be used for the labeling of various RNA targets / Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Entwicklung sowie Anwendung hocheffizienter RNA-Katalysatoren für die positionsspezifische Modifikation von RNA mit besonderem Fokus auf Methylierungen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das erste Methyltransferase-Ribozym (MTR1), das m6G als Methylgruppendonor verwendet, entwickelt und näher charakterisiert. Das RNA-Produkt wurde als die natürliche Modifikation m1A identifiziert. Mit Hilfe der Röntgenkristallographie wurde des Weiteren die 3D-Struktur des Ribozyms aufgeklärt, was direkt auf ein plausibles Reaktionsmuster schließen ließ. Das MTR1-Ribozym wurde zudem erfolgreich für eine Nukleobasen-Transformationsreaktion eines Purins verwendet, bei der eine Formyl-Imidazol-Einheit direkt an der intakten RNA gebildet wird. Dieses Reaktionsprodukt wurde für positionsgenaue Biokonjugationsreaktionen verwendet. Schließlich führten zusätzliche Selektionen und weitere Reselektionen zur Identifizierung hochaktiver Alkyltransferase-Ribozyme, die für die Markierung verschiedener Ziel-RNAs verwendet werden können.

Western societies are steadily becoming older undergoing a clear trend of delayed parenthood. Children of older fathers have an undeniably higher risk for certain neurodevelopmental disorders and other medical conditions. Changes in the epigenetic landscape and especially in DNA methylation patterns are likely to account for a portion of this inherited disease susceptibility. DNA methylation changes during the ageing process are a well-known epigenetic feature. These so-called age-DMRs exist in developmentally important genes in the methylome of several mammalian species. However, there is only a minor overlap between the age-DMR datasets of different studies. We therefore replicated age-DMRs (which were obtained from a genome wide technique) by applying a different technical approach in a larger sample number. Here, this study confirmed 10 age-DMRs in the human and 4 in the bovine sperm epigenome from a preliminary candidate list based on RRBS. For this purpose, we used bisulphite Pyrosequencing in 94 human and 36 bovine sperm samples. These Pyrosequencing results confirm RRBS as an effective and reliable method to screen for age-DMRs in the vertebrate genome. To decipher whether paternal age effects are an evolutionary conserved feature of mammalian development, we compared methylation patterns between human and bovine sperm in orthologous regulatory regions. We discovered that the level of methylation and the age effect are both species-specific and speculate that these methylation marks reflect the lineage-specific development of each species to hit evolutionary requirements and adaptation processes. Different methylation levels between species in developmentally important genes also imply a differing mutational burden, representing a potential driver for point mutations and consequently deviations in the underlying DNA sequence of different species. Using the example of different haplotypes, this study showed the great effect of single base variations on the methylation of adjacent CpGs. Nonetheless, this study could not provide further evidence or a mechanism for the transfer of epigenetic marks to future generations. Therefore, further research in tissues from the progeny of old and young fathers is required to determine if the observed methylation changes are transmitted to the next generation and if they are associated with altered transcriptional activity of the respective genes. This could provide a direct link between the methylome of sperm from elderly fathers and the development potential of the next generation. / Unsere westliche Gesellschaft wird immer älter und unterliegt einem eindeutigen Trend zur verzögerten Elternschaft. Kinder von älteren Vätern haben ein unbestreitbar höheres Risiko für bestimmte neurologische Entwicklungsstörungen und andere Erkrankungen. Epigenetische Veränderungen insbesondere im DNA-Methylierungsmuster sind wahrscheinlich für einen Teil dieser vererbten Krankheitsanfälligkeit verantwortlich. Altersbedingte Veränderungen im DNA-Methylierungsmuster sind ein bekanntes und gut erforschtes Phänomen in der Epigenetik. Diese so genannten Alters-DMRs konnten im Methylom mehrerer Säugetierarten nachgewiesen werden, insbesondere in entwicklungsrelevanten Genen. Allerdings gibt es nur geringe Überschneidungen zwischen den Alters-DMR-Datensätzen verschiedener Studien. Unser Ziel war es daher, die Vertrauenswürdigkeit eines laborinternen Datensatzes, der auf Reduced Representation Bisulphite Sequencing (RRBS) basierte, zu erhöhen, indem wir einen anderen technischen Ansatz in einer unabhängigen Kohorte anwenden. Mit der Methode des Bisulphite Pyrosequencing konnten wir in dieser Studie 10 Alters-DMRs im menschlichen und 4 im Rinder-Spermienepigenom aus einer vorläufigen Kandidatenliste basierend auf RRBS validieren. Diese Ergebnisse bestätigen, dass RRBS eine wirksame und zuverlässige Methode ist, um neue Alters-DMRs im Wirbeltiergenom zu finden. Um festzustellen, ob väterliche Alterseffekte in der Evolution verschiedener Säugetierarten konserviert wurden, verglichen wir die Methylierungsmuster orthologer Regionen zwischen dem menschlichem und dem Rinderspermienepigenom. Es zeigte sich, dass sowohl der Methylierungsgrad als auch der Alterseffekt artspezifisch sind. Daher vermuten wir, dass diese Methylierungsmuster die artspezifische Entwicklung als Antwort auf evolutionäre Anforderungen und durchlebte Anpassungsprozesse darstellen. Diese unterschiedlichen Methylierungslevel zwischen verschiedenen Arten in entwicklungswichtigen Genen implizieren auch eine unterschiedliche Mutationslast, die einen potenziellen Treiber für Punktmutationen und folglich Abweichungen in der zugrunde liegenden DNA-Sequenz der verschiedenen Arten darstellt. Am Beispiel verschiedener Haplotypen konnten wir exemplarisch den ausgeprägten Einfluss bereits einzelner DNA-Basenvariationen auf die Methylierung benachbarter CpGs demonstrieren. Allerdings konnte diese Studie keinen weiteren Beweis oder einen Mechanismus für die Übertragung von epigenetischen Markierungen auf künftige Generationen liefern. Daher sind weitere Untersuchungen an embryonalen, fötalen und adulten Geweben von Nachkommen alter bzw. junger Väter unabdingbar, um festzustellen, ob die beobachteten Methylierungsveränderungen auch auf die nächste Generation übertragen werden. Ferner ist festzustellen, ob sie die Transkriptionsaktivität der betroffenen Gene beeinflussen. Dies könnte einen direkten Einfluss des Spermienmethyloms älterer Väter auf das Entwicklungspotenzial der nächsten Generation belegen.

Agrobacterium tumefaciens ist ein pathogenes Bodenbakterium, welches nach Integration seiner T-DNA in das pflanzliche Genom die Bildung von tumorartigen Wucherungen, den sogenannten Wurzelhalsgallen, an einer Reihe unterschiedlicher Wirtspflanzen verursacht. Die Expression der T-DNA-codierten Onkogene resultiert in der Proliferation und Differenzierung der sogenannten Wurzelhalsgallen, einem Prozess, welcher mit weitreichenden transkriptionellen und physiologischen Veränderungen verbunden ist. Für DNA-Methylierungen ist bekannt, dass diese zu Genexpressionsveränderungen beitragen, welche neoplastisches Wachstum in Säugetieren begünstigen. Über die Funktion epigenetischer Prozesse für die Physiologie und Entwicklung pflanzlicher Tumore ist bisher hingegen wenig bekannt. Daher wurde in dieser Arbeit das Methylierungsmuster von Wurzelhalsgallen, welche an Arabidopsis thaliana induziert wurden, sowohl genomweit als auch auf Basis einzelner Gene bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Onkogene ipt, iaaH und iaaM welche mit der T-DNA ins Genom integriert werden und die Proliferation auslösen, im Tumorgewebe unmethyliert vorliegen. Dennoch sind die Onkogene empfänglich gegenüber epigenetischen Modifikationen, da die siRNA-vermittelte Methylierung sowohl ihre Transkription als auch das Tumorwachstum unterbindet. Eine genomweite Studie der DNA-Methylierungsmuster mittels Tiling-Array-Analysen von immunopräzipitierter methylierter DNA zeigte ein global hypermethyliertes Tumor-Genom im Vergleich zum tumorfreien Sprossgewebe. Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu den Methylierungsmustern der meisten Säuger-Tumore, welche typischerweise mit globaler Hypomethylierung und lokaler Hypermethylierung von Promotor-Sequenzen assoziiert sind. Im Unterschied dazu waren die Promoter-Sequenzen im Pflanzentumor eher hypomethyliert. Die Methylierungsunterschiede zwischen Wurzelhalsgallen und Sprossgewebe korrelierten mit transkriptionellen Veränderungen. Speziell Gene, welche in Entwicklungsprozessen und Zellteilung involviert sind, waren von Methylierungsänderungen betroffen. Dies impliziert, dass insbesondere diese Prozesse epigenetisch kontrolliert werden. Die Methylierung von Genen, welche einer transkriptionellen Kontrolle durch ABA unterliegen, war durch eine ABA-Behandlung induzierbar. DNA-Methylierungen kontrollieren somit wahrscheinlich essenzielle physiologische Prozesse während der Tumorentwicklung wie beispielsweise die ABA-vermittelte Trockenstressanpassung. Arabidopsis-Mutanten, welche in Nicht-CG-Methylierungsprozessen beeinträchtigt sind, entwickelten größere Tumore als die Kontrollpflanzen der entsprechenden Wildtypen. Dies weist auf eine Inhibierung des Tumor-Wachstums durch ein hypermethyliertes Genom, insbesondere der Nicht-CG-Motive hin. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass Genexpression, physiologische Prozesse und die Entwicklung pflanzlicher Tumore einer Regulation durch DNA-Methylierung unterliegen. / Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen which causes formation of crown gall tumors on a wide range of host species as a result of integration of its T-DNA into the plant genome. Expression of the T-DNA encoded oncogenes triggers proliferation and differentiation of crown galls, a process which is associated with severe global gene expression and physiological changes. DNA methylation changes are known to contribute to transcriptional changes which facilitate neoplastic growth in mammals. However, the role of epigenetic processes in physiology and development of plant tumors is not yet understood. Therefore, in this study the methylation pattern of Arabidopsis crown galls was analyzed on a genome-wide and single gene level. The proliferation-provoking oncogenes ipt, iaaH and iaaM, which are integrated into the plant genome along with the T-DNA, were shown to be unmethylated in the tumor genome. Nevertheless, they are susceptible to epigenetic modifications as siRNA-mediated methylation prevented both oncogene transcription and subsequent tumor development. The genome-wide analysis of DNA methylation by methylcytosine immunoprecipitation and tiling arrays revealed a globally hypermethylated tumor genome compaired to that of the tumor-free stems. This contrasts the methylation patterns in most mammalian cancers, which are typically associated with global hypomethylation and local hypermethylation of gene promoters. In crown gall tumors, promoters where rather hypomethylated. Methylation differences of crown galls and stem tissue correlated well with transcriptional changes. Especially genes involved in development and cell division were differentially methylated, implying that these processes are epigenetically controlled in the tumor. Methylation of genes which are known to be transcriptionally inhibited in an ABA-dependent manner was inducible upon ABA treatment. This suggests that DNA methylation controls essential physiological processes during crown gall development, such as ABA-mediated drought stress adaption. Arabidopsis mutants impaired in non-CG methylation developed larger tumors than wild-type controls, which indicates that hypermethylation of non-CG motifs inhibits plant tumor growth. In summary, the results of this study provide evidence that gene expression, physiological processes and the development of plant tumors are regulated by DNA methylation.

Die Evolution der Primaten zeigt eine Verbindung zwischen der zunehmenden Komplexität des sozialen Verhaltens und der Vergrößerung des humanen Gehirns, insbesondere des präfrontalen Cortex. Deshalb stellt der präfrontale Cortex bezüglich der Evolution des Menschen eine der interessantesten Strukturen im humanen Gehirn dar. Es wird angenommen, dass nicht allein die Größe, sondern auch die Funktion, vor allem das Zusammenspiel von Neuronen und nicht-neuronalen Zellen, wie z.B. Gliazellen, zur Differenzierung des menschlichen Gehirns von dem rezenter Primaten geführt hat. Daraus lässt sich schließen, dass die Gehirnfunktionen über eine ausgeglichene und gut aufeinander abgestimmte transkriptionelle Landschaft kontrolliert werden, die durch ein zugrundeliegendes genetisches und epigentisches Rückgrat organisiert ist. In dieser Studie wurden das Methylierungsprofil neuronaler und nicht-neuronaler Zellen des präfrontalen Cortex (Brodmann-Areal 10) von drei Menschen und drei Schimpansen miteinander verglichen. Die intra- und interspezifischen differenziell methylierten Regionen (DMRs) waren in bestimmten genomischen Regionen angereichert. Intraspezifische Methylierungsunterschiede zwischen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen konnten dreimal häufiger beobachtet werden als interspezifische Unterschiede in den einzelnen Zelltypen. Rund 90% der humanen intraspezifischen DMRs wiesen eine Hypomethylierung in den neuronalen Zellen im Vergleich zu den nicht-neuronalen Zellen auf. In den intraspezifischen DMRs (Mensch und Schimpanse) waren Gene angereichert, die mit verschiedenen neuropsychiatrischen Erkrankungen assoziiert sind. Der Vergleich zwischen Menschen und Schimpanse in den neuronalen und nicht-neuronalen Zelltypen zeigte eine Anreicherung von Genen mit human-spezifischer Histonsignatur. In den nicht-neuronalen Zellen konnten mehr interspezifische DMRs (n=666) detektiert werden als in den neuronalen Zellen (n=96). Ungefähr 95% der nicht-neuronalen interspezifischen DMRs waren im Menschen, im Vergleich zum Schimpansen, hypermethyliert. Daraus ergibt sich der Eindruck, dass mehrere hundert der nicht-neuronalen Gene während der humanen Gehirnevolution einer Methylierungswelle unterlagen. Dies führt zu der Annahme, dass der Einfluss dieser Veränderungen in den nicht-neuronalen Zellen auf die Vergößerung des menschlichen Gehirns bisher stark unterschätzt wurde. Die bekannteste genetische Ursache für erblichen Brust- und Eierstockkrebs sind Mutationen in den Tumorsuppressorgenen (TSG) BRCA1 und BRCA2. Dennoch können nur rund 20-25% der familiären Brustkrebserkrankungen über Keimbahnmutationen in BRCA1/BRCA2 erklärt werden, besonders bei Frauen, deren Erkrankung vor dem vierzigsten Lebensjahr auftritt. Epigenetische Veränderungen, die zu einer aberranten Genexpression führen, spielen ebenfalls eine wichtige Rolle bei der Karzinogenese und der Entwicklung einer Brustkrebserkrankung. Es ist bekannt, dass TSG nicht nur durch den Verlust der Heterozygotie (engl. loss of heterozygosity, LOH) oder homozygote Deletionen, sondern auch durch transkriptionelle Stilllegung via DNA-Methylierung inaktiviert werden können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde überprüft, welchen Einfluss aberrante Methylierungsmuster im Promotorbereich von TSG auf die Brustkrebskarzinogenese und die Expression der Gene haben. Für die Quantifizierung der Epimutationen wurden die Promotorbereiche von acht TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1, RB1) und des estrogene receptor (ESR1) Gens, welches eine Rolle in der Tumorprogression spielt, mittels Deep Bisulfite Amplicon Sequencing (DBAS) analysiert. Es wurden Blutproben von zwei unabhängigen BRCA1/BRCA2-mutationsnegativen Brustkrebs (BC)-Patientenkohorten, sowie von zwei unabhängigen alters-gematchten, gesunden Kontrollkohorten untersucht. BC-Kohorte 1 beinhaltet early-onset (EO) BC-Patientinnen. Kohorte 2 enthält BC-Patientinnen mit einem Risiko von >95% eine heterozygote Mutation in BRCA1/BRCA2 (high-risk, HR) zu tragen. Allele mit >50% methylierten CpGs werden als funktionell relevante Epimutationen erachtet, da bekannt ist, dass TSG über eine Methylierung im Promotorbereich transkriptionell stillgelegt werden. Im Vergleich zu ESR1 (Ø Methylierung, 3%), welches die Methylierungslevel eines durchschnittlichen Promotors wiederspiegelt, zeigten die TSG sehr geringe durchschnittliche Methylierungswerte von weniger als 1%. Zudem waren die durchschnittlichen Epimutationsraten (EMR; <0,0001-0,1%) der TSG sehr gering. Mit der Ausnahme von BRCA1, welches eine erhöhte EMR in der BC-Kohorte verglichen zu den Kontrollen (0,31% gegen 0,06%) zeigte, gab es keine signifikanten Gruppenunterschiede zwischen BC-Patientinnen und Kontrollen. Eine von 36 HR BC-Patientinnen zeigte im Vergleich zu den restlichen Proben eine stark erhöhte EMR von 14,7% in BRCA1. Rund ein Drittel (15/44) der EO BC-Patientinnen wiesen eine erhöhte Rate an Einzel-CpG Fehlern in mehreren TSG auf. Die nachfolgenden Expressionsanalysen ergaben eine erniedrigte Expression vieler TSG je analysierter Patientin. Diese Ergebnisse führen zu der Annahme, dass epigenetische Veränderungen in normalen Körperzellen als ein möglicher Indikator für einen gestörten Mechanismus, der für die Aufrechterhaltung des unmethylierten Status und der daraus resultierenden normalen Genexpression zuständig ist, angesehen werden können. Dies kann mit einem erhöhten BC-Risiko assoziiert werden. / The increasing complexity of social behavior along the ascending scale of primates, peaking in human spoken language, is accompanied by an impressive expansion of the human brain, particularly of the prefrontal cortex. Hence, prefrontal cortex appears to be one of the most interesting structures of the human brain, at least from an evolutionary perspective. But not only size but also function, in particular the interplay of neurons and glia cells, are suspected to distinguish the human brain from great apes and other primates. It is plausible to assume that proper brain function is controlled by a coordinated and well balanced transcriptional landscape, orchestrated by the underlying genetic and epigenetic backbone. Using reduced representation bisulfite sequencing (RRBS), we have compared the methylation profiles of neuronal and non-neuronal cells from three human and three chimpanzee prefrontal cortices (Brodmann area 10). Bioinformatic analyses revealed a genome-wide significant enrichment of differentially methylated regions (DMRs) in specific genomic areas. Intraspecific methylation differences between neuronal and non-neuronal cells are about three times more abundant than the interspecific methylation differences. More than 90% of human intraspecific DMRs were hypomethylated in neuronal cells, compared to non-neuronal cells. Intraspecific DMRs showed enrichment of genes associated with different neuropsychiatric disorders. Comparison between humans and chimpanzees yielded enrichments of genes showing human-specific brain histon modification. Interspecific DMRs were much more frequent in non-neuronal cells (n=666) than in neurons (n=96). Approximately 95% of interspecific DMRs in non-neuronal cells were hypermethylated in humans, compared to chimpanzees. It can be assumed that several hundreds of non-neuronal genes underwent a wave of methylation during human brain evolution. The impact of these changes in non-neuronal cells on the extension of the human brain may have been largely underestimated so far. The most prominent genetic cause for inherited breast and ovarian cancer are mutations in the BRCA1 and BRCA2 tumor suppressor genes (TSG). However, BRCA1/BRCA2 germline mutations explain less than 50% of all familial breast cancers, even for women diagnosed before the age of 40 years. It has also been reported that epigenetic abnormalities, which contribute to changes in gene expression, play an important role in carcinogenesis and breast cancer development. To rapidly quantify the number of epimutations in different TSG, in both a qualitative and quantitative manner, we have developed a deep bisulfite sequencing assay targeting the promoter regions of eight TSG (BRCA1, BRCA2, RAD51C, ATM, PTEN, TP53, MLH1 and RB1) and the estrogene receptor (ESR1) gene, which plays a role in tumor progression. We have analyzed blood samples of two independent BRCA1/BRCA2-mutation negative breast cancer (BC) cohorts and two independent age-matched healthy control cohorts. BC cohort 1 represents patients with early-onset BC and BC cohort 2 patients with a high risk to carry a heterozygous mutation. Since it is well known that tumor suppressor genes are transcriptionally silenced by promoter methylation, alleles with >50% methylated CpGs are considered as functionally relevant epimutations. Compared to ESR1, which is representative for an average promoter, TSG exhibited very low (<1%) average methylation levels and also very low mean epimutation rates (EMR; <0.0001% to 0.1%). With exception of BRCA1, which showed an increased EMR in BC (0.31% vs. 0.06%), there was no significant difference between patients and controls detectable. One of 36 HR BC patients showed a dramatically increased EMR (14.7%) in BRCA1. We identified in approximately one third (15 of 44) of EO BC patients increased rates of single CpG methylation errors in multiple TSG. Both EO and HR BC patients exhibited global underexpression of blood TSG. We propose that epigenetic abnormalities in normal body cells are indicative of disturbed mechanisms for maintaining low methylation and appropriate expression levels and may be associated with an increased BC risk.

Techn. Univ., Diss., 2009--München.

University, Diss., 2005--Würzburg.

The effect of late parenthood on the offspring´s physical and mental health status has recently become an increasingly important topic of discussion. Studies on neurodevelopmental disorders in children of older parents (Naserbakht et al., 2011) outline the negative consequences of aging fathers as unpredictable compared to the better-understood unfavorable maternal influences (Cedars et al. 2015). This may be due to the fact that lifelong production of male gametes becomes more susceptible to error, not only for somatic mutations. Non-genomic mechanisms such as epigenetic methylation also alter DNA dynamically throughout life (Jones et al., 2015) and influence the aging human sperm DNA (Jenkins et al., 2014). These methylation changes may be transmitted to the next generation via epigenetic inheritance mechanisms (Milekic et al., 2015), which may negatively impact the sensitive epigenetic regulation of cell differentiation in the embryonic period (Curley et al., 2011; Spiers et al., 2015). Accordingly, Nardone et al. (2014) reported several hypomethylated regions in autistic patients, illustrating potential epigenetic influences on the multifactorial pathogenesis of neuropsychiatric disorders. In the present study, the methylation status of five gene regions in the sperm DNA of males of different ages was analyzed by two techniques - pyrosequencing and deep bisulfite sequencing. Two gene regions, FOXK1 and DMPK, showed a highly significant age-related methylation loss and FOXK1 a reduced methylation variation at the level of single alleles. In addition, the examined gene region of FOXK1 showed significant methylation changes in the fetal cord blood DNA of the respective offspring of the sperm donor. This fact suggests a transfer of age-related methylation loss to the next generation. Interestingly, a methylation analysis at the level of single alleles showed that the methylation loss was inherited exclusively by the father. FOXK1 is a transcription factor that plays an important role in the epigenetic regulation of the cell cycle during embryonic neuronal development (Huang et al., 2004; Wijchers et al., 2006). For this reason, the methylation status of FOXK1 in the blood of autistic patients and an age- and sex-matched control group was investigated. While both groups showed age-associated FOXK1 methylation loss, a faster dynamics of methylation change was observed in the autistic group. Although further studies are needed to uncover inheritance mechanisms of epigenetic information, the present results show an evident influence of age-related methylation changes on offspring. When advising future fathers, it is important to consider how the paternal epigenome is altered by aging and can have a negative impact on the developing embryo. / Die Auswirkungen einer späten Elternschaft auf die körperliche und geistige Gesundheit der Nachkommen wurde in letzter Zeit zunehmend diskutiert. Studien zu neurologischen Entwicklungsstörungen bei Kindern älterer Eltern (Naserbakht et al. 2011) skizzieren insbesondere die negativen Folgen alternder Väter (Cedars et al. 2015). Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass die lebenslange Produktion männlicher Gameten im Laufe des Lebens nicht nur für somatische Mutationen fehleranfälliger wird. Auch nicht-genomische Mechanismen wie die epigenetische Methylierung verändert die DNA im Laufe des Lebens dynamisch (Jones et al. 2015) und beeinflussen die alternde menschliche Spermien-DNA (Jenkins et al. 2014). Möglicherweise werden diese Methylierungsveränderungen über epigenetische Vererbungsmechanismen an die nächste Generation übertragen (Milekic et al. 2015), was sich negativ auf die empfindliche epigenetische Regulation der Zelldifferenzierung in der Embryonalperiode auswirken kann (Curley et al. 2011; Spiers et al. 2015). Mögliche epigenetische Einflüsse auf die multifaktorielle Pathogenese neuropsychiatrischer Erkrankungen veranschaulichend, zeigten Nardone et al. (2014) mehrere hypomethylierte Regionen bei autistischen Patienten auf. In der vorliegenden Arbeit wurde der Methylierungsstatus von fünf Genregionen in der Spermien-DNA von Männern unterschiedlichen Alters durch zwei Techniken analysiert – das Pyrosequencing und das Deep Bisulfite Sequencing. Zwei Genregionen, FOXK1 und DMPK, zeigten einen hochgradig signifikanten altersbedingten Methylierungsverlust und FOXK1 auf der Ebene einzelner Allele eine verringerte Methylierungsvariation. Darüber hinaus zeigte die untersuchte Genregion von FOXK1 signifikante Methylierungsveränderungen in der Nabelschnurblut-DNA der jeweiligen Nachkommen der Samenspender. Diese Tatsache spricht für eine Übertragung des altersbedingten Methylierungsverlustes auf die nächste Generation. Anhand einer Methylierungsanalyse auf der Ebene einzelner Allele konnte interessanterweise gezeigt werden, dass der Methylierungsverlust ausschließlich durch den Vater vererbt wurde. FOXK1 ist ein Transkriptionsfaktor, der eine wichtige Rolle bei der epigenetischen Regulation des Zellzyklus während der embryonalen neuronalen Entwicklung spielt (Huang et al. 2004; Wijchers et al. 2006). Aus diesem Grund wurde der Methylierungsstatus von FOXK1 im Blut autistischer Patienten und einer alters- und geschlechtsentsprechenden Kontrollgruppe untersucht. Während beide Gruppen einen altersassoziierten FOXK1-Methylierungverlust zeigten, wurde in der autistischen Gruppe eine schnellere Dynamik der Methylierungsänderung beobachtet. Obwohl weitere Studien erforderlich sind, um Vererbungsmechanismen epigenetischer Information aufzudecken, zeigen die vorliegenden Ergebnisse einen offensichtlichen Einfluss altersbedingter Methylierungsveränderungen auf die Nachkommen. Bei der Beratung zukünftiger Väter ist es wichtig zu berücksichtigen, wie das väterliche Epigenom durch das Altern verändert wird und negative Auswirkungen auf den sich entwickelnden Embryo haben kann.