Les résultats du criblage siRNA destiné à identifier de nouveaux acteurs de la NER, sont en court d'exploitation mais nous mettons déjà en évidence le rôle de certains gènes impliqués dans la biochimie des ARNm comme ceux empêchant la formation des hybrides ARN/ADN dans l'efficacité de réparation des lésions UV. En étudiant le rôle de la methyltransférase DOT1L, nous avons montré que son absence dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFDOT1L) conduit à une sensibilité de ces cellules aux irradiations UV alors que la réparation des lésions produites par cette irradiation est intacte. L'absence de DOT1L conduit en réalité à une inhibition de l'initiation de la transcription des gènes après irradiation. Au niveau mécanistique, des expériences de STRIP-FRAP ont établit que DOT1L assurait l'association de l'ARN polymérase II à la chromatine après irradiation UV. Dans une analyse plus détaillée, nous avons montré que DOT1L favorisait la formation du complexe de pré-initiation au niveau du promoteur des gènes de ménage ainsi que l'apparition de marques d'euchromatine transcriptionnellement actives. Bien que l'expression des gène de ménage soit inhibée, une analyse transcriptomique montre que les gènes pro-apoptotiques sont fortement transactivés chez les MEFDOT1L après irradiation. Le traitement à la trichostatine A, qui relaxe la chromatine, diminue la transactivation des gènes apoptotiques et restore l'initiation de la transcription et la survie aux UV. Sur la base de ces données, nous proposons que DOT1L garde structure de la chromatine ouverte après UV.

Les résultats du criblage siRNA destiné à identifier de nouveaux acteurs de la NER, sont en court d’exploitation mais nous mettons déjà en évidence le rôle de certains gènes impliqués dans la biochimie des ARNm comme ceux empêchant la formation des hybrides ARN/ADN dans l’efficacité de réparation des lésions UV. En étudiant le rôle de la methyltransférase DOT1L, nous avons montré que son absence dans des fibroblastes embryonnaires de souris (MEFDOT1L) conduit à une sensibilité de ces cellules aux irradiations UV alors que la réparation des lésions produites par cette irradiation est intacte. L’absence de DOT1L conduit en réalité à une inhibition de l’initiation de la transcription des gènes après irradiation. Au niveau mécanistique, des expériences de STRIP-FRAP ont établit que DOT1L assurait l’association de l'ARN polymérase II à la chromatine après irradiation UV. Dans une analyse plus détaillée, nous avons montré que DOT1L favorisait la formation du complexe de pré-initiation au niveau du promoteur des gènes de ménage ainsi que l'apparition de marques d’euchromatine transcriptionnellement actives. Bien que l'expression des gène de ménage soit inhibée, une analyse transcriptomique montre que les gènes pro-apoptotiques sont fortement transactivés chez les MEFDOT1L après irradiation. Le traitement à la trichostatine A, qui relaxe la chromatine, diminue la transactivation des gènes apoptotiques et restore l’initiation de la transcription et la survie aux UV. Sur la base de ces données, nous proposons que DOT1L garde structure de la chromatine ouverte après UV. / As a result of siRNA screening we identified new players at the interface between NER machinery and chromatin. Despite it is ongoing study we already highlighted that certain genes which are involved in the biochemistry of mRNA such as splicing and preventing the formation of RNA:DNA hybrids are important for efficient repair of UV damage. Studying the role of histone H3 lysine 79 methyltransferase DOT1L, we have shown that its absence in mouse embryonic fibroblasts leads to high sensitivity of these cells to UV irradiation while the repair of lesions produced by UV irradiation remains intact. The absence of DOT1L leads to an inhibition of the initiation of gene transcription after UV irradiation. At the mechanistic level, STRIP-FRAP experiments have established that DOT1L assured the association of RNA polymerase II to the chromatin after UV irradiation. In a more detailed analysis, we show that DOT1L favors the formation of pre-initiation complex at the promoter of housekeeping genes as well as the appearance of marks of the transcriptionally active euchromatin. Although the expression of the housekeeping gene is inhibited, a transcriptomic analysis shows that the proapoptotic genes are highly transactivated in DOT1L depleted cells after UV irradiation. Treatment with trichostatin A, which relaxes the chromatin, lowers the transactivation of proapoptotic genes and restores the transcription initiation as well as cell survival after UV. On the basis of these data, we propose that DOT1L keeps the opened chromatin structure after UV irradiation.

La méthylation de l’uridine sur son carbone 5 est apparue au cours de l’évolution sous plusieurs formes. Tout d’abord, les thymidylate synthases permettent la synthèse de novo du dTMP, un précurseur essentiel de l’ADN des trois règnes du vivant. Deux familles de thymidylate synthases sont connues à ce jour : ThyA et la flavo-enzyme ThyX, codées par des gènes hétérologues et ayant des structures et mécanismes réactionnels radicalement différents. En outre, cette méthylation de l’uridine est apparue (probablement plus tard) sous forme de modifications post-transcriptionnelles des ARNt et ARNr. Cette thèse vise à questionner les contraintes évolutives ayant menés indépendament à ces quatres types de méthylation de l’uridine.Une première partie décrit l’identification d’une voie métabolique permetant la complémentation du phénotype d’auxotrophie pour la thymidine par des analogues nucléotidiques chez Escherichia coli. Une approche de biologie synthétique en vue d’établir une voie alternative de biosynthèse du thymidylate a aussi été mise en œuvre. Une technique de sélection de gènes de complémentation du phénotype d’auxotrophie pour la thymidine, issus de mutagénèse aléatoire, a pu être développée. Dans une seconde partie, des études biochimiques et sppectroscopiques ont été réalisées sur la méthyle-transférase flavine-dépendante TrmFO, responsable de la méthylation post-transciptionnelle de l’uridine 54 des ARNt de certains microorganismes.L’implication de certains résidus dans la fixation du substrat a pu être déterminée d’une part, et certains intermédiaires réactionnels potentiels ont été caractérisés spectralement d’autre part. Ces dernières observations s’appuient, en outre, sur des études en cours de spectroscopie résolue en temps et des simulations de dynamique moléculaire afin de mieux comprendre les flavoprotéines en général et les méthyle transférases flavine-dépendantes en particulier. / Enzymes catalyzing the methylation of uridine at its carbon 5 position have appeared independently in different forms across evolution. Thymidylate synthases ThyA and the flavoprotein ThyX catalyze the de novo synthesis of dTMP, an essential DNA precursor in the three domains of life. They are encoded by heterologous genes and have drastically different structures and reaction mechanisms. On the other hand, this uridine methylation is also performed by tRNA and rRNA post-transcriptional modification enzymes.This thesis assesses the question of the evolutionary constraints that have led independently to four kinds of uridine methylation. The first part describes the identification of a metabolic pathway allowing the complementation of thymidine auxotrophy by non-natural nucleotide analogs in Escherichia coli. A synthetic biology approach, aiming to establish an alternative pathway for thymidylate biosynthesis, was also implemented and a selection strategy for thymidine auxotrophy-complementing genes, could be developed.In a second part, biochemical and spectral studies where realised on the flavin-dependent methyltransferase TrmFO, responsible for the post-transcriptional methylation of uridine at the invariant position 54 of tRNA in several microorganisms. The involvement of specific amino acid residues in substrate fixation and in stabilization of potential reaction intermediates was demonstrated. Their spectral characterization supports previously proposed reaction schemes for flavin-dependent thymidylate forming enzymes. These observations are currently being pursued by parallel approaches combining time-resolved spectroscopy and molecular dynamics simulations, aiming to further our understanding of how flavin mediates the transfer of carbon molecules from folate to uracil rings.