Os complexos Mycobacterium chelonae M.abscessus e Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum são compostos por espécies bacterianas de crescimento rápido e potencialmente patogênicas. Sua distribuição é ubíqua no ambiente, são resistentes a cloração da água e a sua replicação ocorre mesmo em condições de escassez de nutrientes. Estão envolvidos em casos de infecção pulmonar e extrapulmonar, e causam infecções em pacientes imunocomprometidos ou submetidos a rocedimentos cirúrgicos invasivos. Os objetivos do presente trabalho foram: confirmar através de testes fenotípicos e com as técnicas de PRA hsp65 e seqüenciamento do fragmento do rpoB, a identificação de micobactérias de crescimento rápido, incluídas nos complexos M. chelonae-M.abscessus e M. fortuitum-M.peregrinum. Foram incluídos no estudo os isolados provenientes de pacientes com dois ou mais isolamentos provenientes de sítio não estéril ou um isolamento de sítio estéril. O estudo de 38 isolados demonstrou que as provas fenotípicas disponíveis atualmente não permitem a identificação de todas as espécies de micobactérias de crescimento rápido já descritas na literatura. O PRA hsp65 possibilitou a identificação rápida e precisa de 63% das espécies de micobactérias e demonstrou um perfil compartilhado pelas espécies M. abscessus 2; M. bolletii 1 e M. massiliense 1. O seqüenciamento do gene rpoB confirmou a identificação das espécies citadas. Nossos resultados demonstraram que o PRA-hsp65 e o seqüenciamento do gene rpoB são ferramentas úteis para fornecer a identificação das espécies de micobactérias com mais acurácia. O uso dessas técnicas poderiam ser consideradas em laboratórios de referência para identificar Micobactérias de crescimento rápido uma vez que elas são patógenos emergentes implicados em surtos e isolados de pacientes em centros de referência para tratamento de tuberculose multirresistente. / Mycobacterium chelonae-M. abscessus and Mycobacterium fortuitum-M. peregrinum complexes are composed by bacterial species characterized by rapid grow and considered as potential pathogens. These microorganisms are ubiquitous in the environment, resistant to water treatment such as standard chlorination and are able to replicate even at poor nutrient conditions. They are related to lung and extralung infections in immune-compromised patients or those submitted to invasive surgical procedures. The aim of this study was to confirm the identification of Mycobacterium chelonae - M. abscessus and Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum complexes, isolated from biological samples considering one or two repetitions if samples are originated from sterile or non-sterile site respectively. Phenotypic tests and molecular methods, PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing, were applied to identify 38 strains previously isolated. Results demonstrated that available phenotypic tests did not allow the identification of all described fast growing Mycobacterium. The PRA of hsp65 gene confirmed the identification of 63% of the Mycobacterium studied, and demonstrated the band pattern shared by M. abscessus 2, M. bolletii and M. massiliensis. The rpoB gene sequencing confirmed the identification of the species cited. Our results demonstrated that PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing are useful tools to provide a more accurate species identification of mycobacteria. The use of such techniques would be considered in reference laboratories to identify fast growing Mycobacterium species since they are considered emerging pathogens implicated in outbreaks and isolated from a patient in reference centers for treatment of multidrug resistant tuberculosis.

Os complexos Mycobacterium chelonae M.abscessus e Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum são compostos por espécies bacterianas de crescimento rápido e potencialmente patogênicas. Sua distribuição é ubíqua no ambiente, são resistentes a cloração da água e a sua replicação ocorre mesmo em condições de escassez de nutrientes. Estão envolvidos em casos de infecção pulmonar e extrapulmonar, e causam infecções em pacientes imunocomprometidos ou submetidos a rocedimentos cirúrgicos invasivos. Os objetivos do presente trabalho foram: confirmar através de testes fenotípicos e com as técnicas de PRA hsp65 e seqüenciamento do fragmento do rpoB, a identificação de micobactérias de crescimento rápido, incluídas nos complexos M. chelonae-M.abscessus e M. fortuitum-M.peregrinum. Foram incluídos no estudo os isolados provenientes de pacientes com dois ou mais isolamentos provenientes de sítio não estéril ou um isolamento de sítio estéril. O estudo de 38 isolados demonstrou que as provas fenotípicas disponíveis atualmente não permitem a identificação de todas as espécies de micobactérias de crescimento rápido já descritas na literatura. O PRA hsp65 possibilitou a identificação rápida e precisa de 63% das espécies de micobactérias e demonstrou um perfil compartilhado pelas espécies M. abscessus 2; M. bolletii 1 e M. massiliense 1. O seqüenciamento do gene rpoB confirmou a identificação das espécies citadas. Nossos resultados demonstraram que o PRA-hsp65 e o seqüenciamento do gene rpoB são ferramentas úteis para fornecer a identificação das espécies de micobactérias com mais acurácia. O uso dessas técnicas poderiam ser consideradas em laboratórios de referência para identificar Micobactérias de crescimento rápido uma vez que elas são patógenos emergentes implicados em surtos e isolados de pacientes em centros de referência para tratamento de tuberculose multirresistente. / Mycobacterium chelonae-M. abscessus and Mycobacterium fortuitum-M. peregrinum complexes are composed by bacterial species characterized by rapid grow and considered as potential pathogens. These microorganisms are ubiquitous in the environment, resistant to water treatment such as standard chlorination and are able to replicate even at poor nutrient conditions. They are related to lung and extralung infections in immune-compromised patients or those submitted to invasive surgical procedures. The aim of this study was to confirm the identification of Mycobacterium chelonae - M. abscessus and Mycobacterium fortuitum - M. peregrinum complexes, isolated from biological samples considering one or two repetitions if samples are originated from sterile or non-sterile site respectively. Phenotypic tests and molecular methods, PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing, were applied to identify 38 strains previously isolated. Results demonstrated that available phenotypic tests did not allow the identification of all described fast growing Mycobacterium. The PRA of hsp65 gene confirmed the identification of 63% of the Mycobacterium studied, and demonstrated the band pattern shared by M. abscessus 2, M. bolletii and M. massiliensis. The rpoB gene sequencing confirmed the identification of the species cited. Our results demonstrated that PRA-hsp65 and rpoB gene sequencing are useful tools to provide a more accurate species identification of mycobacteria. The use of such techniques would be considered in reference laboratories to identify fast growing Mycobacterium species since they are considered emerging pathogens implicated in outbreaks and isolated from a patient in reference centers for treatment of multidrug resistant tuberculosis.

As micobactérias de crescimento rápido causam infecções pulmonares, infecções relacionadas a traumas cutâneos e aos cuidados com a saúde. Ha um número reduzido de opções terapêuticas para o tratamento dessas infecções e os dados nacionais sobre os determinantes genéticos dessa resistência são escassos. Duas classes de antimicrobianos importantes no tratamento são as fluorquinolonas e os macrolídeos. Enquanto a maioria dos isolados do Grupo M. chelonae-abscessus apresenta resistência intrínseca às fluorquinolonas, e são sensíveis aos macrolídeos, a maioria dos isolados do Grupo M. fortuitum é sensível às fluorquinolonas e expressa RNA-metilases que impedem a ação dos macrolídeos. Os determinantes da resistência às fluorquinolonas conhecidos em micobactérias são mutações no gene gyrA e para os macrolídeos é a expressão de genes erm, que codificam RNA-metilases. Nos dois casos os determinantes tem localização cromossômica. Outros determinantes de resistência podem ter localização plasmidial, a exemplo do gene aacA4\'-8, presente em plasmídio do grupo de incompatibilidade IncP, detectado em M. abscessus, que codifica resistência à kanamicina e tobramicina. Neste estudo foram avaliados: a correlação entre à susceptibilidade ao ciprofloxacino e moxifloxacino e presença de mutações nos genes gyrA e gyrB; a susceptibilidade à claritromicina e presença de genes que codificam RNA-metilases; a presença de plasmídios do grupo de incompatibilidade IncP em diferentes espécies de micobactérias; a estabilidade e a transferência por conjugação do plasmídio pBRA-100; a relação clonal entre isolados que albergam plasmídios IncP e o perfil de susceptibilidade antimicrobiana de uma coleção de isolados da espécie M. abscessus. Cento e vinte e dois isolados dos Grupos M. abscessus e M. fortuitum foram analisados quanto às concentrações inibitórias mínimas, por microdiluição, utilizando-se o painel RAPMYCO®. As sequências parciais dos genes gyrA e gyrB e a presença de genes que codificam RNA-metilases foram determinadas em 69 e 59 desses isolados, respectivamente. A presença de plasmídios do grupo IncP foi determinada por PCR e os produtos de amplificação tiveram suas sequencias caracterizadas. A estabilidade do plasmídio pBRA-100 em Escherichia coli TOP10® foi avaliada realizando-se repiques sucessivos por 57 dias e semeadura em agar LB contendo kanamicina. A transferência horizontal foi avaliada por ensaio de conjugação com E. coli J53 resistente à azida sódica. Em M. abscessus não houve diferença entre as sequencias da região QRDR de GyrA e GyrB entre isolados sensíveis e resistentes ao ciprofloxacino. Em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados testados apresentaram genes erm; entretanto não foi observada correlação entre a presença dos genes e resistência indutiva a claritromicina. O gene erm(45), descrito neste trabalho, foi detectado apenas em M. abscessus subsp. bolletii. Os ensaios de microdiluição evidenciaram que os antimicrobianos mais ativos contra M. abscessus subsp. abscessus foram amicacina (89%), tigeciclina (96%) e claritromicina (86%). Apenas nos dois isolados da espécie M. fortuitum resistentes ao ciprofloxacino foi detectada a substituição S83W na proteína GyrA. Trata-se de substituição ainda não descrita em micobactérias. Nao foi observada correlação entre substituições em GyrB e resistência ao ciprofloxacino ou moxifloxacino. O gene erm(46), descrito neste estudo, foi detectado em 65% dos isolados. Nos demais isolados foram detectados três outros genes: erm(47), erm(48) e erm(49), ainda nao descritos. Os plasmídios IncP foram detectados apenas em \"M. massiliense\" pertencentes a três grupos clonais distintos com índice de similaridade maior que 92%, quando analisados por ERIC-PCR. Houve sucesso na conjugação entre E. coli TOP-Myco e E. coli J53. Os ensaios de estabilidade evidenciaram que o plasmídio pBRA-100 é estável em E. coli com aproximadamente 100% da população bacteriana albergando o plasmídio após 57 subcultivos. / The rapidly growing mycobacteria cause lung infections, skin infections related to trauma and health care associated infections. There are a limited number of therapeutic options for treating these infections and national data on the genetic determinants of this resistance are scarce. Two major classes of antimicrobials used in treatment of these infections are macrolides and fluoroquinolones. While the majority of the isolates from M. chelonae-abscessus Group have intrinsic resistance to fluoroquinolones, and are sensitive to macrolides, most isolates from M. fortuitum Group are sensitive to fluoroquinolones and express RNA methylases that prevent the action of macrolides. The known fluoroquinolones resistance determinants in to mycobacteria are mutations in thegyrA gene and for macrolides the main determinant is the expression of erm genes which encode RNA methylases. In both cases the determinants are located at the chromosome. Other resistance determinants may have a plasmidial location, such as aacA4\'-8 gene, present in the pBRA100 plasmid detected in M. abscessus, which encodes resistance to kanamycin and tobramycin. This study evaluated the correlation between the susceptibility to ciprofloxacin and moxifloxacin and mutations in genes gyrA and gyrB; susceptibility to clarithromycin and the presence of RNA-methylases encodinggenes , the presence of plasmids of the incompatibility group IncP in different species mycobacteria; stability and conjugal transfer of plasmid pBRA-100; the clonal relationship between isolates harboring plasmids IncP and antimicrobial susceptibility profile of a collection of isolates of M. abscessus. One hundred and twenty-two isolates of M. chenolae-abscessus and M. fortuitum Groups were analyzed for their minimal inhibitory concentrations by microdilution, using the RAPMYCO® Panel. The partial sequences of the genes gyrA and gyrB and the presence of genes encoding RNA methylases were determined in 69 and 59 isolates, respectively. The presence of IncP group plasmids was determined by PCR and the sequence of PCR products were characterized. The stability of the pBRA-100 plasmid in Escherichia coli TOP10® was evaluated by performing successive subcultures for 57 days, and plating on LB agar containing kanamycin. The horizontal transfer was evaluated by conjugation with E. coli J53 a sodium azide resistant strain. In M. abscessus no differences between the sequences of the QRDR region of gyrA or gyrB among isolates susceptible and resistant to ciprofloxacin were observed. In M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii all isolates tested had erm genes; however there was no correlation between the presence of these genes and inducible resistance to clarithromycin. The erm(45), gene described in this paper, was only detected in M. abscessus subsp. bolletii. Microdilution tests showed that the most active antibiotics against M. abscessus subsp. abscessus were amikacin (89%), tigecycline (96%) and clarithromycin (86%). In only in two M. fortuitum isolates resistant to ciprofloxacin the amino acid substitution S83W was detected in GyrA. This substitution had not been described mycobacteria. No correlation was observed between substitutions in GyrB and resistance to ciprofloxacin or moxifloxacin. The erm(46) gene described in this study, was detected in 65% of the isolates. In the remaining isolates other three not yet described genes were detected: erm(47), erm(48) and erm(49). IncP plasmids were detected only in \"M. massiliense\" belonging to three clonal groups with at similarity index greater than 92% when analyzed by ERIC-PCR.We succeeded in conjugating E. coli TOP-Myco and E. coli J53. The stability tests showed that the plasmid pBRA-100 is stable in E. coli since approximately 100% of the bacterial population harbored the plasmid after 57 subcultures.

As micobactérias de crescimento rápido causam infecções pulmonares, infecções relacionadas a traumas cutâneos e aos cuidados com a saúde. Ha um número reduzido de opções terapêuticas para o tratamento dessas infecções e os dados nacionais sobre os determinantes genéticos dessa resistência são escassos. Duas classes de antimicrobianos importantes no tratamento são as fluorquinolonas e os macrolídeos. Enquanto a maioria dos isolados do Grupo M. chelonae-abscessus apresenta resistência intrínseca às fluorquinolonas, e são sensíveis aos macrolídeos, a maioria dos isolados do Grupo M. fortuitum é sensível às fluorquinolonas e expressa RNA-metilases que impedem a ação dos macrolídeos. Os determinantes da resistência às fluorquinolonas conhecidos em micobactérias são mutações no gene gyrA e para os macrolídeos é a expressão de genes erm, que codificam RNA-metilases. Nos dois casos os determinantes tem localização cromossômica. Outros determinantes de resistência podem ter localização plasmidial, a exemplo do gene aacA4\'-8, presente em plasmídio do grupo de incompatibilidade IncP, detectado em M. abscessus, que codifica resistência à kanamicina e tobramicina. Neste estudo foram avaliados: a correlação entre à susceptibilidade ao ciprofloxacino e moxifloxacino e presença de mutações nos genes gyrA e gyrB; a susceptibilidade à claritromicina e presença de genes que codificam RNA-metilases; a presença de plasmídios do grupo de incompatibilidade IncP em diferentes espécies de micobactérias; a estabilidade e a transferência por conjugação do plasmídio pBRA-100; a relação clonal entre isolados que albergam plasmídios IncP e o perfil de susceptibilidade antimicrobiana de uma coleção de isolados da espécie M. abscessus. Cento e vinte e dois isolados dos Grupos M. abscessus e M. fortuitum foram analisados quanto às concentrações inibitórias mínimas, por microdiluição, utilizando-se o painel RAPMYCO®. As sequências parciais dos genes gyrA e gyrB e a presença de genes que codificam RNA-metilases foram determinadas em 69 e 59 desses isolados, respectivamente. A presença de plasmídios do grupo IncP foi determinada por PCR e os produtos de amplificação tiveram suas sequencias caracterizadas. A estabilidade do plasmídio pBRA-100 em Escherichia coli TOP10® foi avaliada realizando-se repiques sucessivos por 57 dias e semeadura em agar LB contendo kanamicina. A transferência horizontal foi avaliada por ensaio de conjugação com E. coli J53 resistente à azida sódica. Em M. abscessus não houve diferença entre as sequencias da região QRDR de GyrA e GyrB entre isolados sensíveis e resistentes ao ciprofloxacino. Em M. abscessus subsp. abscessus e M. abscessus subsp. bolletii todos os isolados testados apresentaram genes erm; entretanto não foi observada correlação entre a presença dos genes e resistência indutiva a claritromicina. O gene erm(45), descrito neste trabalho, foi detectado apenas em M. abscessus subsp. bolletii. Os ensaios de microdiluição evidenciaram que os antimicrobianos mais ativos contra M. abscessus subsp. abscessus foram amicacina (89%), tigeciclina (96%) e claritromicina (86%). Apenas nos dois isolados da espécie M. fortuitum resistentes ao ciprofloxacino foi detectada a substituição S83W na proteína GyrA. Trata-se de substituição ainda não descrita em micobactérias. Nao foi observada correlação entre substituições em GyrB e resistência ao ciprofloxacino ou moxifloxacino. O gene erm(46), descrito neste estudo, foi detectado em 65% dos isolados. Nos demais isolados foram detectados três outros genes: erm(47), erm(48) e erm(49), ainda nao descritos. Os plasmídios IncP foram detectados apenas em \"M. massiliense\" pertencentes a três grupos clonais distintos com índice de similaridade maior que 92%, quando analisados por ERIC-PCR. Houve sucesso na conjugação entre E. coli TOP-Myco e E. coli J53. Os ensaios de estabilidade evidenciaram que o plasmídio pBRA-100 é estável em E. coli com aproximadamente 100% da população bacteriana albergando o plasmídio após 57 subcultivos. / The rapidly growing mycobacteria cause lung infections, skin infections related to trauma and health care associated infections. There are a limited number of therapeutic options for treating these infections and national data on the genetic determinants of this resistance are scarce. Two major classes of antimicrobials used in treatment of these infections are macrolides and fluoroquinolones. While the majority of the isolates from M. chelonae-abscessus Group have intrinsic resistance to fluoroquinolones, and are sensitive to macrolides, most isolates from M. fortuitum Group are sensitive to fluoroquinolones and express RNA methylases that prevent the action of macrolides. The known fluoroquinolones resistance determinants in to mycobacteria are mutations in thegyrA gene and for macrolides the main determinant is the expression of erm genes which encode RNA methylases. In both cases the determinants are located at the chromosome. Other resistance determinants may have a plasmidial location, such as aacA4\'-8 gene, present in the pBRA100 plasmid detected in M. abscessus, which encodes resistance to kanamycin and tobramycin. This study evaluated the correlation between the susceptibility to ciprofloxacin and moxifloxacin and mutations in genes gyrA and gyrB; susceptibility to clarithromycin and the presence of RNA-methylases encodinggenes , the presence of plasmids of the incompatibility group IncP in different species mycobacteria; stability and conjugal transfer of plasmid pBRA-100; the clonal relationship between isolates harboring plasmids IncP and antimicrobial susceptibility profile of a collection of isolates of M. abscessus. One hundred and twenty-two isolates of M. chenolae-abscessus and M. fortuitum Groups were analyzed for their minimal inhibitory concentrations by microdilution, using the RAPMYCO® Panel. The partial sequences of the genes gyrA and gyrB and the presence of genes encoding RNA methylases were determined in 69 and 59 isolates, respectively. The presence of IncP group plasmids was determined by PCR and the sequence of PCR products were characterized. The stability of the pBRA-100 plasmid in Escherichia coli TOP10® was evaluated by performing successive subcultures for 57 days, and plating on LB agar containing kanamycin. The horizontal transfer was evaluated by conjugation with E. coli J53 a sodium azide resistant strain. In M. abscessus no differences between the sequences of the QRDR region of gyrA or gyrB among isolates susceptible and resistant to ciprofloxacin were observed. In M. abscessus subsp. abscessus and M. abscessus subsp. bolletii all isolates tested had erm genes; however there was no correlation between the presence of these genes and inducible resistance to clarithromycin. The erm(45), gene described in this paper, was only detected in M. abscessus subsp. bolletii. Microdilution tests showed that the most active antibiotics against M. abscessus subsp. abscessus were amikacin (89%), tigecycline (96%) and clarithromycin (86%). In only in two M. fortuitum isolates resistant to ciprofloxacin the amino acid substitution S83W was detected in GyrA. This substitution had not been described mycobacteria. No correlation was observed between substitutions in GyrB and resistance to ciprofloxacin or moxifloxacin. The erm(46) gene described in this study, was detected in 65% of the isolates. In the remaining isolates other three not yet described genes were detected: erm(47), erm(48) and erm(49). IncP plasmids were detected only in \"M. massiliense\" belonging to three clonal groups with at similarity index greater than 92% when analyzed by ERIC-PCR.We succeeded in conjugating E. coli TOP-Myco and E. coli J53. The stability tests showed that the plasmid pBRA-100 is stable in E. coli since approximately 100% of the bacterial population harbored the plasmid after 57 subcultures.