Les infections respiratoires sont une cause importante de morbidité et de mortalité à travers le monde. D’ailleurs, de nouveaux virus respiratoires sont continuellement identifiés, dont le metapneumovirus humain (hMPV) en 2001. Ce virus est maintenant reconnu comme une cause fréquente d’infections respiratoires sévères chez les jeunes enfants, telles que des pneumonies et des bronchiolites. Il se classe d’ailleurs en 2e ou 3e position après le virus respiratoire syncytial, en alternance avec les virus influenza. La majorité des infections sévères causées par le hMPV touche les individus dont le système immunitaire est plus faible c’est-à-dire les jeunes enfants, les personnes âgées et les sujets immunosupprimés. Diverses études démontrent qu’une infection respiratoire virale sévère en bas âge peut prédisposer un enfant à développer de l’asthme durant sa vie. Malgré cela, les médecins n’ont toujours aucun vaccin ni traitement à leur disposition. L’analyse du génome et de la fonction des protéines du hMPV nous offre maintenant des pistes prometteuses pour le développement d’antiviraux. De plus, un modèle murin bien établi permet désormais l’étude in vivo de ces antiviraux. Ce projet de doctorat avait donc comme objectif de développer des approches thérapeutiques pour contrer les infections causées par le hMPV. Pour ce faire, deux étapes de l’infection ont été ciblées : l’entrée du virus dans la cellule hôte par fusion, et la réplication du génome viral à l’intérieur de la cellule infectée. La première molécule identifiée avec succès est un inhibiteur de fusion, le peptide HRA2, qui s’est révélé hautement efficace in vitro et in vivo contre le hMPV. Le deuxième groupe de molécules est formé de petits ARN interférants (siRNAs) dirigés contre des gènes essentiels à la réplication du hMPV. L’interférence à l’ARN est d’ailleurs une discipline en plein essor depuis sa récente identification. Deux siRNAs ciblant la nucléoprotéine et la phosphoprotéine du hMPV se sont avérés extrêmement actifs contre ce virus in vitro et des résultats très encourageants ont été obtenus chez la souris. / Respiratory infections are a leading cause of morbidity and mortality worldwide. New viruses are constantly discovered and one of them, the human Metapneumovirus (hMPV), was identified in 2001. hMPV causes upper and lower respiratory infections ranging from cold- or flu-like illnesses to more severe and life-threatening infections such as pneumonia and bronchiolitis. hMPV is only second or third to human respiratory syncytial virus in frequency and sometimes as frequent as human influenza viruses in causing respiratory infections. The majority of severe infections caused by hMPV are seen in individuals having the weakest immune system such as young children, elderly and immunocompromised subjects. Many studies tend to demonstrate that severe viral respiratory infection during childhood can lead to asthma development later in life. Unfortunately, physicians have no vaccine or treatment to fight against severe hMPV infections. Genome and protein fonction analyses are offering promising avenues for the development of effective antivirals. Moreover, hMPV pathogenesis has been described in a murine model which now offers a convenient way to evaluate candidate molecules. This PhD project main goal was therefore to design new molecules against hMPV infections. For that matter, two steps of hMPV replication cycle were targeted, i.e., virus entry into the host cell which happens by a fusion mechanism, and viral genome replication inside the infected cell. The first molecule successfully identified is a fusion inhibitor, the HRA2 peptide that showed highly potent activity against hMPV in vitro but also in vivo. The second group of molecules corresponds to small interfering RNAs (siRNAs) targeting genes essential for hMPV replication. RNA interference has been a rapidly growing field since its first description in the 1990’s. Here, we identified two highly effective siRNAs against hMPV in vitro which target the nucleoprotein and phosphoprotein. Evaluation of these siRNAs in a murine model of hMPV infection also showed great possibilities. /

Le virus Herpès humain de type 6B (HHV-6B) est un virus qui infecte environ 95% de la population mondiale et qui est relativement bénin chez les personnes immunocompétentes mais dont les réactivations sont potentiellement graves chez les immunodéprimés. HHV-6B est l’agent étiologique de la roséole de l’enfant ou exanthème subit. Comme tout virus herpétique, HHV-6B a développé diverses stratégies lui permettant de moduler le système immunitaire à son avantage afin de persister au sein de son hôte. La caractérisation de nouveaux mécanismes d’évitement utilisés par HHV-6B ou l’identification de cibles immunodominantes permettraient de mettre en place de nouvelles stratégies afin de combattre l’infection. Au cours de nos recherches, nous avons identifié que la protéine de tégument U54 d’HHV-6B inhibe la synthèse d’interleukine-2 (IL-2). Nous avons déterminé la voie de signalisation de la calcineurine (CaN) / NFAT comme étant le facteur antagonisé par U54 et caractérisé le mécanisme aboutissant à cette inhibition. De plus, en nous basant sur ces résultats, nous avons testé l’impact d’une abrogation de la voie CaN/NFAT par U54 sur la progression de cellules de cancer du sein. Nous avons démontré que l’expression d’U54 provoque une baisse significative de la proliferation de cellules de cancer du sein MCF-7. Ces résultats ont fait germer l’idée du ciblage de cellules de cancer du sein exprimant la protéine U54 couplé à un protocole d’immunothérapie adoptive anti-cancéreuse. Enfin, l’immunothérapie adoptive antivirale est également un sujet d’étude qui a été abordé. Nous avons identifié des épitopes de la protéine IE1 d’HHV-6B présentés dans le contexte de trois des allèles les plus communs dans la population caucasienne : HLA-A*02, HLA-A*03 et HLA-B*07. Ceci nous a permit de perpétrer une expansion clonale de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de lyser des cellules infectées qui pourraient servir à contrôler d’éventuelles réactivations virales chez des patients immunodéprimés. De manière générale, nos travaux permettent d’étendre les connaissances sur les mécanismes utilisés par HHV-6B pour contourner le système immunitaire de l’hôte mais également d’identifier des cibles permettant de développer un éventuel protocole d’immunothérapie adoptive.

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Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) infecte et se réplique dans les cellules du système immunitaire. À sa sortie de la cellule, le virus s’enveloppe d’une partie de la membrane cellulaire et acquiert alors certaines des protéines membranaires de la cellule hôte. C’est le cas de la protéine HLA-DR du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (CMH-II) nécessaire à la présentation antigénique. Son incorporation par le virus augmente le potentiel infectieux et contribue à la persistance du virus. Vpu est une protéine du VIH-1 qui contribue au bourgeonnement viral. Une étude récente a montré que Vpu pourrait diminuer l’expression de HLA-DR mature à la surface des cellules infectées. Toutefois, il est aussi reconnu que Vpu module l’acquisition de HLA-DR mature par le VIH-1. Ces résultats pouvaient être expliqués par un contrôle de la localisation intracellulaire de HLA-DR et/ou des protéines structurales du VIH-1 par Vpu. En somme, Vpu pourrait favoriser les interactions spécifiques entre HLA-DR mature et le VIH-1 tout en diminuant l’expression générale de HLA-DR mature à la surface de la cellule. Nous avons souhaité confirmer ce double rôle de Vpu qui est important dans la pathogénèse du virus puisqu’il bénéficie ainsi des avantages de l’incorporation du HLA-DR mature tout en court-circuitant son rôle dans la réponse antigénique normale. Il est également admis que le virus bourgeonne à partir des microdomaines (radeaux lipidiques) de la cellule hôte. Ces régions de la membrane sont riches en cholestérol et constituent le lieu d’expression préférentiel des molécules de HLA-DR mature. Lors d’un traitement avec de la Simvastatin™, les radeaux lipidiques sont affectés car cette drogue inhibe la synthèse du cholestérol et de surcroit, diminue l’expression de HLA-DR mature à la surface cellulaire. L’usage de la Simvastatin™ nous a renseigné sur l’endroit où le virion pouvait interagir et éventuellement incorporer la molécule de l’hôte HLA-DR dans son enveloppe. Ce projet de recherche à permis de caractériser les interactions entre Vpu et HLA-DR et ainsi de mieux comprendre les mécanismes par lesquels Vpu module à la fois l’expression de HLA-DR à la surface des cellules infectées ainsi que son incorporation sur les virions. Les études conduites en microscopie confocale par co-marquage fluorescent de Vpu et HLA-DR ont conduit à la mise en évidence de l’existence d’une interaction entre Vpu et HLA-DR au sein de la cellule infectée. Les mesures de l’expression de HLA-DR à la surface de cellules infectées et de son incorporation à la surface des virions à l’aide des techniques de cytométrie en flux et d’immunocapture ont également permis de confirmer la modulation de l’expression de HLA-DR par Vpu. Enfin, le traitement des cellules infectées avec la Simvastatin™ nous a permis d’émettre l’hypothèse que l’acquisition de HLA-DR s’effectuait à une étape antérieure au bourgeonnement viral. Pour finir, nous avons tenté de corréler les différences observées dans la pathogénèse de certains sous-types viraux avec la variabilité de la séquence de Vpu entre ceux-ci, en lien avec une différence de localisation subcellulaire de Vpu. Les études conduites dans le cadre de mon projet de maîtrise ont contribués à une meilleure compréhension des mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte et de leur possible répercussion sur la pathogénèse du VIH-1 par différents sous-types viraux. Elles renseignent également de manière substantielle sur le rôle de Vpu, protéine dont le rôle est demeuré relativement méconnu dans la pathogénèse du VIH-1 ainsi que sur les mécanismes d’acquisition des molécules de l’hôte par le VIH-1. Les résultats présentés dans ce mémoire devraient susciter un regain d’intérêt pour cette protéine ainsi que pour les mécanismes d’incorporation des molécules de l’hôte par le VIH-1. / The type-1 human immunodeficiency virus (HIV-1) infects and replicates itself in the immune system cells. When it buds out, the virus covers itself with a part of the plasma membrane and then acquires some of the host membrane proteins. It is the case for the HLA-DR protein from the major histocompatibility complex class II (MHC-II) necessary for antigen presentation. Its viral incorporation increases the infectious potential and contributes to viral persistence. Vpu is an HIV-1 protein which contributes to the viral budding process. A recent study showed that Vpu could decrease the mature HLA-DR expression at the infected cell surface. Nevertheless, it is also known that Vpu modulates the mature HLA-DR acquisition by HIV-1. Those results could be explained by a control of the intracellular localization of HLA-DR and/or some HIV-1 structural protein by Vpu. In summary, Vpu could promote specific interactions between mature HLA-DR and HIV-1 while decreasing the general expression of mature HLA-DR at the cell surface. We wished to confirm the dual role of Vpu which is important in the viral pathogenesis by getting the mature HLA-DR incorporation advantages while short-circuiting its role in the normal antigen response. It is also accepted that the virus buds out from the infected cell lipid raft. These region are highly enriched with cholesterol and the preferential expression location of mature HLA-DR. With a Simvastatin™ treatment, the lipid raft are disrupt because this drug inhibit the synthesis of cholesterol, therefore down-modulating the mature HLA-DR expression at the cell surface. Using Simvastatin™ inform us on where the virus could possibly acquire the mature host molecule HLA-DR in its envelop. This research project allowed us to characterise the possible interactions between Vpu and HLA-DR that led to a better understanding of the mechanism by which Vpu modulates HLA-DR at the infected cell surface and its viral incorporation. The study conducted by confocal microscopy using multiple fluorescent tagging of Vpu and HLA-DR has led to the evidence of an interaction between Vpu and mature HLA-DR in an infected cell. The measurement of the cell surface expression of HLA-DR and its viral incorporation by flow cytometer and immunocapture techniques also allowed the confirmation of the Vpu modulation on HLA-DR expression. Finally, the Simvastatin™ treatment on infected cells allowed us to hypothesis that the mature HLA-DR acquisition was done at an earlier stage that the viral budding. To conclude, we also attempted to correlate the difference in the pathogenesis of some HIV-1 subtype with the sequence variability of Vpu between them: a link with a different subcellular localization of Vpu. The studies that have been performed in order to complete my master diploma have contributed to a better understanding of the acquisition mechanism of certain host molecules and their impact on different sub-types of HIV-1 pathogenesis. They also give substantial information on the roles of Vpu, a virus-encoded protein whose involvement in HIV-1 pathogenesis remains to be defined and on the acquisition mechanism of some host molecule by HIV-1. The results presented in this thesis will probably arouse an interest renewal for this protein and for the host molecule incorporation mechanism used by HIV-1.

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La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune qui touche environ 1% de la population mondiale. Elle entraîne une inflammation synoviale et une destruction de l’architecture articulaire. L’articulation rhumatoïde est un milieu très inflammatoire qui est infiltré par des cellules telles que les neutrophiles, les macrophages, les monocytes, les lymphocytes B et T ; par des protéines telles que des cytokines, des chimiokines, des molécules d’adhésion, par des complexes immuns, et par des auto-anticorps comme les facteurs rhumatoïdes qui sont un marqueur spécifique de la maladie et qui permettent d’établir un pronostic sur son évolution. De plus, dans l’articulation rhumatoïde, il y aura formation d’un pannus rhumatoïde avec érosion progressive du cartilage et de l’os. Les ostéoclastes sont les cellules principalement impliquées dans cette érosion osseuse. Afin d’effectuer des études in vitro, les ostéoclastes sont généralement obtenus à partir de monocytes isolés de sang humain, ce qui rend leur étude complexe car les variations sont très grandes d’un donneur de sang à l’autre. Nous avons utilisé la lignée cellulaire d’origine myéloïde HL60 pour obtenir des ostéoclastes et avons caractérisé ces cellules HL60 « osteoclast-like » dans tous les aspects de leur fonction et de leur activation. Nous avons aussi montré que les facteurs rhumatoïdes pouvaient agir directement sur les ostéoclastes pendant leur différenciation et pendant la résorption osseuse. Cette étude nous a permis d’amorcer la compréhension du rôle possible des facteurs rhumatoïdes sur la résorption osseuse dans la polyarthrite rhumatoïde.

Il a récemment été démontré que la nucléocapside du virus de l’hépatite C (VHC) subit l’ajout post-traductionnel d’un groupement acyl gras sur le résidu C172. Cette modification, appelée palmitoylation, est requise pour la production de virions infectieux. Chez les eucaryotes, la palmitoylation est catalysée par les enzymes de la famille DHHC. Notre objectif était d’identifier lesquelles des 23 protéines DHHC présentes chez les mammifère possèdent une activité palmitoyl-acyl transferase (PAT) sur la nucléocapside du VHC. Nous avons d’abord étudié l’expression et la localisation des protéines DHHC dans les hépatocytes humaines. Nous avons ensuite mesuré la variation du niveau de palmitoylation de la nucléocapside lorsque chaque DHHC candidate est surexprimée ou réprimée. Ce criblage a mené à l’identification de 5 enzymes qui exercent une activité PAT sur la nucléocapside du VHC : DHHC 1, 2, 3, 6 et 7. Leur co-localisation avec le substrat viral a été confirmée. / As previously demonstrated, a fatty acid group is post-translationnally added on the residue C172 of Hepatitis C virus (HCV) core protein and this modification, termed palmitoylation, is required for viral assembly. In eukaryotes, palmitoylation is performed by a family of enzymes sharing a closely related DHHC motif. The purpose of this study was to identify which of the 23 mammalian DHHCs could perform palmitoyl acyltransferase activity on the HCV core protein. First, we characterized the expression and localization of DHHC enzymes in human hepatocytes. Then we evaluated the variation in core palmitoylation levels when each cellular DHHC proteins was over-expressed or repressed. This screen identified five enzymes with PAT activity on HCV core protein; DHHC 1, 2, 3, 6 and 7. Their co-localization with the viral protein was also demonstrated. These findings pave the way for future studies on the role of core palmitoylation during the HCV infection.

La transplantation de myoblastes (TM) est une des thérapies potentielles des plus prometteuses pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Une des limites de cette approche est le rejet des myoblastes du donneur par le système immunitaire de l’hôte. L’induction d’une tolérance immunologique envers les myoblastes greffés permettrait de contourner les effets secondaires conséquents à une immunosuppression soutenue, aujourd’hui indispensable à la survie de la greffe. Notre objectif est donc d'induire une tolérance immunologique via l’établissement d’un chimérisme mixte par un protocole non-myéloablatif, chez des souris dystrophiques. Le protocole testé a permis d'induire une tolérance périphérique transitoire au donneur ainsi que l'établissement de taux variables de chimérisme mixte. Cependant, il n’a pas permis d’induire une tolérance à la TM. Bien que nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés quant à la TM, des améliorations, telle qu’une association à court terme à la rapamycine, pourraient être envisagées en vue d'une application en clinique. / Myoblast transplantation (MT) is one of the most promising potential therapies for Duchenne muscular dystrophy (DMD). One limitation of this approach is the rejection of the donor myoblast by the host immune system. Induction of donor-specific immune tolerance would avoid the toxicities of chronic immunosuppressive therapy that is currently required to prevent graft rejection. Our objective is to induce immunological tolerance through the establishment of mixed-chimerism using a non-myeloablative protocol, into DMD mice. Our results show that the tested protocol permits the induction of transient peripheral tolerance status to the donor. It also allows the establishment of variable rate of mixed-chimerism. However, this protocol failed to induce tolerance to MT. Although we did not obtain the expected results on the MT, improvements, such as association with a short-term rapamycin treatment, may be considered to enhance the outcome of the proposed protocol in perspective of clinical application for DMD patients.