Neste trabalho, demonstramos a fabricação de microambientes tridimensionais para investigar o crescimento celular. Inicialmente, desenvolvemos um sistema de microfabricação que utiliza fotopolimerização via absorção de dois fótons, com o qual se pode fabricar um conjunto de microestruturas com formas e espaçamentos pré-determinados. Este sistema de fabricação utiliza pulsos de femtossegundos, provenientes de um laser de Ti:safira operando em 790 nm. A intensidade destes pulsos é alta o bastante para induzir a absorção de dois fótons no fotoiniciador, o qual é responsável por promover a polimerização em uma resina acrílica. A natureza não linear da absorção de dois fótons confina a excitação ao volume focal, permitindo a fabricação de estruturas tridimensionais com alta resolução espacial. Para a obtenção dos microambientes, foi necessário o desenvolvimento de um sistema opto-mecânico de movimentação, tanto do feixe quando do substrato da amostra. Com esta técnica, fabricamos microambientes compostos de estruturas com diferentes formas (paralelepípedos, cilindros e cones) e espaçamentos, os quais foram caracterizados através de microscopia óptica e eletrônica. Para demonstrar a viabilidade destes microambientes para a investigação do crescimento celular, estes foram utilizados para monitorar o desenvolvimento da célula Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7), uma linhagem celular de adenocarcinoma de mama que apresenta fenótipo tumoral amplamente utilizada como modelo de estudo para câncer de mama. Observamos, via microscopia óptica de transmissão e fluorescência, o desenvolvimento das células MCF-7 nos distintos microambientes. Nossos resultados indicam uma melhor aderência e, portanto, desenvolvimento celular nas microestruturas cilíndricas. Observamos ainda uma maior densidade de células nos microambientes com estruturas separadas de 12 µm, a qual diminui com o aumento do espaçamento, de tal forma que para o microambiente com 30 µm, por exemplo, poucas células são observadas. Portanto, nossos resultados demonstram que os microambientes desenvolvidos são viáveis para estudos mais aprofundados em biologia celular, com potenciais aplicações em engenharia de tecido. / In this work we have demonstrated the fabrication of tridimensional microenvironments for the investigation of cell growth. Initially we have developed a two-photon absorption photopolymerization microfabrication system, which allows producing a set of microstructures with predetermined forms and spacing. This fabrication system uses femtosecond pulses from a Ti: sapphire laser operating at 790 nm. These pulses are intense enough to induce two-photon absorption by the photoinitiator, that is responsible for promoting the polymerization in an acrylic resin. The nonlinear nature of the two-photon absorption confines the excitation to the focal volume, allowing the fabrication of tridimensional structures with high spatial resolution. In order to obtain the microenvironments, it was necessary to develop a movement system for both the laser beam and the sample substrate. With this technique we have fabricated microenvironments composed by structures with different geometries (parallelepipeds, cylinders and cones) and spacing, which were characterized by optical and scanning electron microscopes. To demonstrate the feasibility of the microenvironments for the investigation of cell growth, the samples were used to monitor de development of the Michigan Cancer Foundation-7 cell (MCF-7), a lineage of breast adenocarcinoma that has a tumoral phenotype and is highly used as a model in breast cancer studies. We have observed, through conventional optical and fluorescence microscopy, the growth of the MCF-7 cells in the various microenvironments. Our results indicate a better adhesion and, therefore, better development of cells on the cylindrical microstructures. We also observe a higher cell density in the microenvironments with microstructures having a spacing of 12 µm, which reduces as the distance between microstructures increases, in such a way that for the microenvironment with 30 µm spacing, for example, just a few cells are observed. Thus, our results demonstrate that the produced microenvironments are applicable in deeper studies in microbiology, with potential application in tissue engineering.

Neste trabalho, demonstramos a fabricação de microambientes tridimensionais para investigar o crescimento celular. Inicialmente, desenvolvemos um sistema de microfabricação que utiliza fotopolimerização via absorção de dois fótons, com o qual se pode fabricar um conjunto de microestruturas com formas e espaçamentos pré-determinados. Este sistema de fabricação utiliza pulsos de femtossegundos, provenientes de um laser de Ti:safira operando em 790 nm. A intensidade destes pulsos é alta o bastante para induzir a absorção de dois fótons no fotoiniciador, o qual é responsável por promover a polimerização em uma resina acrílica. A natureza não linear da absorção de dois fótons confina a excitação ao volume focal, permitindo a fabricação de estruturas tridimensionais com alta resolução espacial. Para a obtenção dos microambientes, foi necessário o desenvolvimento de um sistema opto-mecânico de movimentação, tanto do feixe quando do substrato da amostra. Com esta técnica, fabricamos microambientes compostos de estruturas com diferentes formas (paralelepípedos, cilindros e cones) e espaçamentos, os quais foram caracterizados através de microscopia óptica e eletrônica. Para demonstrar a viabilidade destes microambientes para a investigação do crescimento celular, estes foram utilizados para monitorar o desenvolvimento da célula Michigan Cancer Foundation-7 (MCF-7), uma linhagem celular de adenocarcinoma de mama que apresenta fenótipo tumoral amplamente utilizada como modelo de estudo para câncer de mama. Observamos, via microscopia óptica de transmissão e fluorescência, o desenvolvimento das células MCF-7 nos distintos microambientes. Nossos resultados indicam uma melhor aderência e, portanto, desenvolvimento celular nas microestruturas cilíndricas. Observamos ainda uma maior densidade de células nos microambientes com estruturas separadas de 12 µm, a qual diminui com o aumento do espaçamento, de tal forma que para o microambiente com 30 µm, por exemplo, poucas células são observadas. Portanto, nossos resultados demonstram que os microambientes desenvolvidos são viáveis para estudos mais aprofundados em biologia celular, com potenciais aplicações em engenharia de tecido. / In this work we have demonstrated the fabrication of tridimensional microenvironments for the investigation of cell growth. Initially we have developed a two-photon absorption photopolymerization microfabrication system, which allows producing a set of microstructures with predetermined forms and spacing. This fabrication system uses femtosecond pulses from a Ti: sapphire laser operating at 790 nm. These pulses are intense enough to induce two-photon absorption by the photoinitiator, that is responsible for promoting the polymerization in an acrylic resin. The nonlinear nature of the two-photon absorption confines the excitation to the focal volume, allowing the fabrication of tridimensional structures with high spatial resolution. In order to obtain the microenvironments, it was necessary to develop a movement system for both the laser beam and the sample substrate. With this technique we have fabricated microenvironments composed by structures with different geometries (parallelepipeds, cylinders and cones) and spacing, which were characterized by optical and scanning electron microscopes. To demonstrate the feasibility of the microenvironments for the investigation of cell growth, the samples were used to monitor de development of the Michigan Cancer Foundation-7 cell (MCF-7), a lineage of breast adenocarcinoma that has a tumoral phenotype and is highly used as a model in breast cancer studies. We have observed, through conventional optical and fluorescence microscopy, the growth of the MCF-7 cells in the various microenvironments. Our results indicate a better adhesion and, therefore, better development of cells on the cylindrical microstructures. We also observe a higher cell density in the microenvironments with microstructures having a spacing of 12 µm, which reduces as the distance between microstructures increases, in such a way that for the microenvironment with 30 µm spacing, for example, just a few cells are observed. Thus, our results demonstrate that the produced microenvironments are applicable in deeper studies in microbiology, with potential application in tissue engineering.

Microestruturas poliméricas dopadas despertam grande interesse nas áreas de óptica, fotônica e biologia, pois viabilizam a produção de dispositivos com propriedades específicas. Contudo, a dopagem de microestruturas com mais de um dopante é pouco explorada na literatura. Nesse contexto, o presente trabalho propõe o desenvolvimento de uma metodologia para fabricar microestruturas poliméricas com múltiplas dopagens, através de fotopolimerização por absorção de dois fótons. Esta técnica de microfabricação faz uso de um feixe laser pulsado (Ti:safira, 780 nm, 100 fs) que é focalizado, através de lentes de microscópio, no volume de uma resina polimérica contendo fotoiniciador composto orgânico responsável por iniciar o processo de polimerização. A intensidade dos pulsos de femtossegundos é alta o bastante para que processos não lineares absorcivos, nesse caso absorção de dois fótons, ocorram apenas no volume focal, induzindo a polimerização apenas ao seu redor. Como dopantes utilizamos os corantes fluorescentes Rodamina e Fluoresceína. Para averiguar a eficácia do sistema de fabricação desenvolvido, produzimos estruturas com apenas um dopante, e as caracterizamos utilizando microscopia óptica e eletrônica. Microestruturas contendo mais de um dopante, em regiões distintas, foram produzidas através da fabricação sequencial de estruturas dopadas. Essa metodologia permite a produção de estruturas com dupla dopagem, as quais apresentam boa integridade estrutural e preservam as propriedades ópticas dos dopantes. Por fim, visando aplicações em biologia, empregamos a metodologia desenvolvida para fabricar microambientes dopados, em sítios específicos, com o antibiótico cloridrato de ciprofloxacino. Estudos iniciais do desenvolvimento da bactéria Escherichia coli nestes microambientes foram feitos, com o objetivo de demonstrar a viabilidade para este tipo de aplicação. / Doped microstructures have attracted interest in optics, photonics and biology, because they allow the production of devices with specific proprieties. However, doping microstructures with more than one dopant is not much exploited in the literature. In this work we demonstrate the development of a method to fabricate multi-doped microstructures by two-photon absorption polymerization. For the microfabrication we used a femtosecond laser (Ti:sapphire laser, 780 nm, 100 fs) that is focused, by a microscope objective, in the volume of a polymeric resin containing a photoinitiator organic compound responsible to initiate the polymerization. The intensity of the femtosecond pulses is high enough to induced two-photon absorption, and consequently polymerization, only around the focal volume. As dopants we employed the fluorescent dyes Rhodamine and Fluorescein. In order to verify the microfabrication system, we have initially fabricated microstructures with only one dopant, which were characterized using optical and electron microscopies. Microstructures containing more than one dopant, in distinct regions, were produced by sequential fabrication of single doped structures. Such method allowed the fabrication of double doped structures, which presents good structural integrity and maintain the characteristic optical properties of the dyes. Finally, aiming at biological applications, we employed the developed method to fabricate micro-environments doped, in specific sites, with the antibiotics ciprofloxacin hydrochloride. Initial studies on the growth of the bacterium Escherichia coli, on such microstructures, were carried out to demonstrate the feasibility for such type of application.

Microestruturas poliméricas dopadas despertam grande interesse nas áreas de óptica, fotônica e biologia, pois viabilizam a produção de dispositivos com propriedades específicas. Contudo, a dopagem de microestruturas com mais de um dopante é pouco explorada na literatura. Nesse contexto, o presente trabalho propõe o desenvolvimento de uma metodologia para fabricar microestruturas poliméricas com múltiplas dopagens, através de fotopolimerização por absorção de dois fótons. Esta técnica de microfabricação faz uso de um feixe laser pulsado (Ti:safira, 780 nm, 100 fs) que é focalizado, através de lentes de microscópio, no volume de uma resina polimérica contendo fotoiniciador composto orgânico responsável por iniciar o processo de polimerização. A intensidade dos pulsos de femtossegundos é alta o bastante para que processos não lineares absorcivos, nesse caso absorção de dois fótons, ocorram apenas no volume focal, induzindo a polimerização apenas ao seu redor. Como dopantes utilizamos os corantes fluorescentes Rodamina e Fluoresceína. Para averiguar a eficácia do sistema de fabricação desenvolvido, produzimos estruturas com apenas um dopante, e as caracterizamos utilizando microscopia óptica e eletrônica. Microestruturas contendo mais de um dopante, em regiões distintas, foram produzidas através da fabricação sequencial de estruturas dopadas. Essa metodologia permite a produção de estruturas com dupla dopagem, as quais apresentam boa integridade estrutural e preservam as propriedades ópticas dos dopantes. Por fim, visando aplicações em biologia, empregamos a metodologia desenvolvida para fabricar microambientes dopados, em sítios específicos, com o antibiótico cloridrato de ciprofloxacino. Estudos iniciais do desenvolvimento da bactéria Escherichia coli nestes microambientes foram feitos, com o objetivo de demonstrar a viabilidade para este tipo de aplicação. / Doped microstructures have attracted interest in optics, photonics and biology, because they allow the production of devices with specific proprieties. However, doping microstructures with more than one dopant is not much exploited in the literature. In this work we demonstrate the development of a method to fabricate multi-doped microstructures by two-photon absorption polymerization. For the microfabrication we used a femtosecond laser (Ti:sapphire laser, 780 nm, 100 fs) that is focused, by a microscope objective, in the volume of a polymeric resin containing a photoinitiator organic compound responsible to initiate the polymerization. The intensity of the femtosecond pulses is high enough to induced two-photon absorption, and consequently polymerization, only around the focal volume. As dopants we employed the fluorescent dyes Rhodamine and Fluorescein. In order to verify the microfabrication system, we have initially fabricated microstructures with only one dopant, which were characterized using optical and electron microscopies. Microstructures containing more than one dopant, in distinct regions, were produced by sequential fabrication of single doped structures. Such method allowed the fabrication of double doped structures, which presents good structural integrity and maintain the characteristic optical properties of the dyes. Finally, aiming at biological applications, we employed the developed method to fabricate micro-environments doped, in specific sites, with the antibiotics ciprofloxacin hydrochloride. Initial studies on the growth of the bacterium Escherichia coli, on such microstructures, were carried out to demonstrate the feasibility for such type of application.

No presente trabalho produzimos microestruturas, através da técnica de fotopolimerização via absorção de dois fótons, dopadas com nanofios de ZnO, um material que vem sendo amplamente explorado devido as suas interessantes propriedades ópticas e elétricas. Para a fabricação das microestruturas, utilizamos um oscilador laser de Ti:safira que produz pulsos de aproximadamente 100 fs em 800 nm. A intensidade dos pulsos de femtossegundos é alta o suficiente para induzir a absorção¬ de dois fótons em torno do volume focal, localizando a polimerização a esta região. Portanto, através da varredura do feixe na resina polimérica fabrica-se a estrutura desejada. Neste trabalho, desenvolvemos uma metodologia para introduzir nanofios de ZnO às microestruturas fabricadas, a partir da mistura do pó de nanofios de ZnO à resina acrílica. A resina utilizada é uma combinação de duas resinas, o etoxilated(6)trimethylolpropane triacrylate (SR-499) e tris(2-hydroxy ethyl)isocyanurate triacrylate (SR-368). Como fotoiniciador utilizamos o Lucirin TPO-L (2,4,6-trimetilbenzoiletoxifenil phosphine oxide). As microestruturas produzidas foram caracterizadas pelas técnicas de microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia de energia dispersiva, difração de Raios X e espectroscopia de espalhamento micro-Raman. Através destas técnicas, foi possível observar a presença dos nanofios nas microestruturas, bem como caracterizar suas propriedades morfológicas que se mostram adequadas para o desenvolvimento de microdispositivos. Observamos também a emissão de fluorescência das microestruturas excitadas por um e dois fótons. Sendo assim, a metodologia de fabricação descrita aqui pode ser usada como mais uma opção na concepção de novos dispositivos tecnológicos. / In this study we fabricated microstructures, using the two-photon polymerization technique, containing ZnO nanowires, a material that has been widely exploited due to their interesting optical and electrical properties. For the microstructures fabrication, we used Ti:Sapphire laser oscillator operating at 800 nm with 100 fs pulses. The intensity of the fs-pulses is high enough to induce two-photon absorption, confining the excitation and thus the polymerization to the focal volume. By scanning the beam across the resin the desired microstructure is fabricated. In this work, we developed a method to introduce ZnO nanowires in the fabricated microstructure by mixing the ZnO nanowires powder to the acrylic resin. The used resin is a combination of two compounds, etoxilated(6)trimethylolpropane triacrylate (SR-499) and tris(2-hydroxy ethyl)isocyanurate triacrylate (SR-368). As a photoinitiator we have used Lucirin TPO-L (2,4,6-trimetilbenzoiletoxifenil phosphine oxide).The produced samples were characterized by optical microscopy, scanning electron microscopy, energy dispersive spectroscopy, X-ray diffraction spectroscopy and micro-Raman scattering. From these techniques it was possible to observe the presence of nanowires in the microstructures, as well as to characterize the morphological properties, which has been shown to be interesting for developing microdevices. We have also observed fluorescent emission of the microstructures excites by one and two-photons absorption. Therefore, the methodology described here can be used as an alternative in the design of new optical devices.

No presente trabalho produzimos microestruturas, através da técnica de fotopolimerização via absorção de dois fótons, dopadas com nanofios de ZnO, um material que vem sendo amplamente explorado devido as suas interessantes propriedades ópticas e elétricas. Para a fabricação das microestruturas, utilizamos um oscilador laser de Ti:safira que produz pulsos de aproximadamente 100 fs em 800 nm. A intensidade dos pulsos de femtossegundos é alta o suficiente para induzir a absorção¬ de dois fótons em torno do volume focal, localizando a polimerização a esta região. Portanto, através da varredura do feixe na resina polimérica fabrica-se a estrutura desejada. Neste trabalho, desenvolvemos uma metodologia para introduzir nanofios de ZnO às microestruturas fabricadas, a partir da mistura do pó de nanofios de ZnO à resina acrílica. A resina utilizada é uma combinação de duas resinas, o etoxilated(6)trimethylolpropane triacrylate (SR-499) e tris(2-hydroxy ethyl)isocyanurate triacrylate (SR-368). Como fotoiniciador utilizamos o Lucirin TPO-L (2,4,6-trimetilbenzoiletoxifenil phosphine oxide). As microestruturas produzidas foram caracterizadas pelas técnicas de microscopia óptica, microscopia eletrônica de varredura, espectroscopia de energia dispersiva, difração de Raios X e espectroscopia de espalhamento micro-Raman. Através destas técnicas, foi possível observar a presença dos nanofios nas microestruturas, bem como caracterizar suas propriedades morfológicas que se mostram adequadas para o desenvolvimento de microdispositivos. Observamos também a emissão de fluorescência das microestruturas excitadas por um e dois fótons. Sendo assim, a metodologia de fabricação descrita aqui pode ser usada como mais uma opção na concepção de novos dispositivos tecnológicos. / In this study we fabricated microstructures, using the two-photon polymerization technique, containing ZnO nanowires, a material that has been widely exploited due to their interesting optical and electrical properties. For the microstructures fabrication, we used Ti:Sapphire laser oscillator operating at 800 nm with 100 fs pulses. The intensity of the fs-pulses is high enough to induce two-photon absorption, confining the excitation and thus the polymerization to the focal volume. By scanning the beam across the resin the desired microstructure is fabricated. In this work, we developed a method to introduce ZnO nanowires in the fabricated microstructure by mixing the ZnO nanowires powder to the acrylic resin. The used resin is a combination of two compounds, etoxilated(6)trimethylolpropane triacrylate (SR-499) and tris(2-hydroxy ethyl)isocyanurate triacrylate (SR-368). As a photoinitiator we have used Lucirin TPO-L (2,4,6-trimetilbenzoiletoxifenil phosphine oxide).The produced samples were characterized by optical microscopy, scanning electron microscopy, energy dispersive spectroscopy, X-ray diffraction spectroscopy and micro-Raman scattering. From these techniques it was possible to observe the presence of nanowires in the microstructures, as well as to characterize the morphological properties, which has been shown to be interesting for developing microdevices. We have also observed fluorescent emission of the microstructures excites by one and two-photons absorption. Therefore, the methodology described here can be used as an alternative in the design of new optical devices.