Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-02-10T17:16:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 761778 bytes, checksum: ecca750c172b279fb9ce213dddba2559 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-10T17:16:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 761778 bytes, checksum: ecca750c172b279fb9ce213dddba2559 (MD5) Previous issue date: 2016-05-24 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Sondas cromossomo-específicas referem-se a um conjunto de sequências de DNA marcadas com fluorescência, específicas de um par cromossômico, visualizadas através da hibridização em preparações citogenéticas. Tais sondas possibilitam a visualização altamente sensível e exclusiva de cromossomos individuais, ampliando a resolução diferencial de cariótipos. Elas podem ser empregadas em análises de organização do genoma, genômica comparativa, estudos evolutivos e filogenéticos, auxiliar na identificação de pares de homólogos, comparação cariotípica e obtenção de mapas físicos com marcas que auxiliem em programas de melhoramento genético. Técnicas de microdissecção de cromossomos, juntamente com métodos de isolamento e amplificação do DNA microdissectado, representam ferramentas úteis para serem aplicadas na construção dessas sondas cromossomo-específicas. Um fator considerado limitante no uso da microdissecção é a necessidade de coletar em torno de 20 cópias de um determinado cromossomo. Isso implica na necessidade de reconhecimento prévio do alvo e a certeza na identificação. A utilização de um único cromossomo resolve essa questão e possibilita a construção de sondas sem necessidade de identificação prévia, além de reduzir os esforços relativos à microdissecção. Considerando o potencial informativo dessas sondas e o desafio de construí-las a partir de um único cromossomo, o presente trabalho foi realizado com objetivo de padronizar metodologias para construção de sondas cromossomo-específicas a partir de um cromossomo isolado por microdissecção. Para tanto, foram realizadas adaptações das técnicas para obtenção de cromossomos mitóticos e meióticos adequados para caracterização cariotípica e aplicação das técnicas de microdissecção e hibridização in situ fluorescente. Foram utilizadas metáfases provenientes de cultura de linfócitos humanos para padronização de (i) métodos de microdissecção; (ii) enzimas adequadas e condições de amplificação de um cromossomo por DOP-PCR; (iii) enzimas para a marcação fluorescente das sondas por random primer e (iv) condições de estringência para a hibridização in situ fluorescente (FISH). Após essas padronizações iniciais, as metodologias foram empregadas em milho (Zea mays) e pimentão (Capsicum annuum) para primeiros testes envolvendo espécies vegetais. Foram obtidas sondas cromossomo-específicas para o par 2 do cariótipo humano, para o par cromossômico 1 de milho e para pimentão (provavelmente o par 7 ou 8). Esses resultados demonstraram que, apesar da construção de sondas cromossomo-específicas ser uma metodologia extensa e desafiadora, a padronização de cada etapa possibilitou a marcação de um par específico a partir da coleta de um único cromossomo para humano, milho e pimentão. A microdissecção, a transferência do material para o microtubo e a comparação de diferentes parâmetros na amplificação por DOP-PCR foram consideradas como as etapas mais críticas do processo. A qualidade das preparações cromossômicas foi um fator crucial para aplicação das metodologias de microdissecção e FISH. Esse trabalho revela estratégias baseadas na microdissecção de um único cromossomo que possibilitaram a produção de sondas cromossomo-específicas para diferentes organismos, como humano, milho e pimentão. As etapas padronizadas poderão direcionar os procedimentos de construção de sondas cromossomo-específicas para todos os cromossomos dos cariótipos das espécies utilizadas nesse trabalho, bem como poderão ser aplicadas em outras plantas. / Chromosome-specific probes are DNA sequences, fluorescently labelled specifically for a chromosome pair. Such probes can be applied for analysis in evolutionary and phylogenetic studies, for karyotype comparison and to obtain physical maps that help in plant breeding programs. Techniques of chromosome microdissection, along with methods of isolation and amplification of microdissected DNA, represent useful tools to be employed in the construction of chromosome-specific probes. A considered limiting factor in the use of microdissection is the necessity to collect around 20 copies of a particular chromosome. This implies the need of prior recognition of the target and the conviction in identification. The use of a single chromosome solves this issue and allows the construction of probes without prior identification, besides reducing the efforts on microdissection. Considering the potential of these informative probes, this study aimed to compare and standardize methods of classical and molecular cytogenetics to build probes. Therefore, technical adjustments were made to obtain mitotic and meiotic chromosomes suitable for karyotype characterization and application in microdissection techniques and in situ hybridization. Metaphases from human lymphocytes were used to standardization of (i) microdissection methods; (ii) chromosomes amplification; (iii) DNA fluorescent labelling and (iv) stringency conditions for fluorescence in situ hybridization (FISH). After the initial protocol standardization, the methodologies were used in maize (Zea mays) and sweat peppers (Capsicum annuum). A chromosome-specific probe for pair 2 of human chromosomes, a probe to chromosome 1 of corn and a probe for sweat pepper (probably the pair 7 or 8) were obtained. Although chromosome-specific probes construction involves many steps, the standardization of each process stages allowed, in our conditions, to obtain a specific probe from a single chromosome for humans, corn and sweat pepper. The microdissection and the comparison of different DOP-PCR parameters were considered as the most critical steps of the process. Human and plant chromosomes showing preserved morphology and structure provided a suitable template DNA for probes construction. The quality of chromosome preparation was a key factor for the microdissection and application of FISH methodologies. This work reveals strategies based on microdissection of a single chromosome that made possible the production of chromosome-specific probes for different organisms, such as human, corn and pepper. Standardized steps may guide the procedures of chromosome-specific probes construction for all chromosomes of karyotypes of the species used in this work, and it may be applied to other plant.

Giardia duodenalis é um protozoário de distribuição mundial responsável por causar infecções entéricas em uma grande variedade de mamíferos, incluindo os humanos. Mesmo apresentando pouca variação em sua morfologia, os isolados podem ser diferenciados, de acordo com análises de proteína e polimorfismo de DNA, em pelo menos oito agrupamentos genéticos distintos, denominados assemblages (A-H). Apenas os assemblages A e B têm sido reportados em humanos e outros mamíferos. Isolados de assemblage A podem, ainda, ser divididos em quatro sub-assemblages (AI, AII, AIII e AIV). Sequencias heterogêneas têm sido frequentemente identificadas em estudos de caracterização molecular envolvendo amostras contendo múltiplos cistos do parasita. Buscando estudar a ocorrência dos eventos de heterozigose de sequencia alélica (ASH) e recombinação gênica, o presente trabalho teve como objetivo isolar cistos de G. duodenalis empregando-se a técnica de micromanipulação e caracterizá-los molecularmente através da análise multilócus envolvendo os genes gdh, tpi, orfC4 e bg. Dez cistos foram individualizados e utilizados na pesquisa. Todos foram igualmente identificados por todos os genes, nove cistos caracterizados como assemblage AII e um cisto caracterizado como assemblage B. Os cromatogramas oriundos do cisto identificado como assemblages B apresentaram diversos sítios heterogêneos nos genes gdh, bg e orfC4, sendo que, nesses dois últimos, observaram-se sobreposições dos alelos AII e B no produto sequenciado (heterozigose inter assemblage). Os produtos de PCR foram clonados e as sequencias obtidas revelaram a ocorrência dos dois alelos neste único cisto. Os sítios polimórficos encontrados nas sequencias do gene gdh indicaram heterozigose intra assemblage B. Embora ASH já tenha sido relatada em cistos individualizados de G. duodenalis, estes são os primeiros resultados indicando a presença dos dois alelos, simultaneamente, em um único indivíduo. Esses resultados demonstram fortes evidências que ocorre troca genética entre indivíduos geneticamente distintos de G. duodenalis / Giardia duodenalis is a worldwide distribution enteric protozoan responsible for causing infections in a wide variety of mammals, including humans. Even showing little change in their morphology, isolates can be distinguished, according to the analysis of proteins and DNA polymorphisms in at least eight distinct genetic groups, known assemblages (A - H). Only assemblages A and B have been reported in humans and other mammals. Isolates of assemblage A also can be divided into four sub-assemblages (AI, AII, AIII and AIV). Heterogeneous sequences have been frequently identified in studies involving molecular characterization of samples containing multiple cysts of the parasite. Seeking to study the occurrence of allelic sequence heterozygosity (ASH) and genetic recombination events, the present study aimed to isolate G. duodenalis cysts employing the micromanipulation technique and characterize them molecularly through multilocus analysis involving gdh, tpi, orfC4 and bg genes. Ten cysts were individualized and used in the research. All cysts were equally identified for all genes; nine cysts were characterized as assemblage AII and one characterized as assemblage B. The chromatograms derived from the cyst identified as assemblage B presented many heterogeneous sites in gdh, bg and orfC4 genes, and in these last two, there were overlaps of alleles AII and B in the sequenced product (heterozygous inter assemblage). PCR products were cloned and the sequences obtained revealed the occurrence of two alleles at this single cyst. The polymorphic sites found in the sequences of the gdh gene indicated intra heterozygosity assemblage B. Although ASH has already been reported in G. duodenalis individualized cysts, these are the first results indicating the presence of two alleles simultaneously in a single individual. These results demonstrate strong evidence that genetic exchange occurs between individuals genetically distinct of G. duodenalis

De acordo com a literatura recente, a eletroquímica de partículas magnéticas e fenômenos de colisões em superfícies eletródicas resultam em curvas voltamétricas e amperométricas com perfis completamente destoados do convencional. Alguns modelos teóricos propõem explicações, no entanto, ainda se observa a necessidade de aquisição de mais dados experimentais. Visando contribuir com esta área, esta Dissertação de Mestrado aborda a manipulação de micropartículas e nanopartículas de magnetita modificadas com azul da Prússia (Fe3O4-PB), bem como o estudo das propriedades eletroquímicas das partículas na presença de um campo magnético externo. Filmes constituídos por micropartículas sobre eletrodos de carbono (grafite) foram obtidos por duas técnicas distintas, drop coating e magneto-deposição. Para ambos os métodos, os filmes apresentaram dois picos nos voltamogramas, um de oxidação (0,12 V) e outro de redução (-0,05 V), que estão associados ao par redox azul da Prússia/branco da Prússia. Para o filme obtido via drop coating, observaram-se correntes de pico mais elevadas. Também, micropartículas de Fe3O4-PB individuais foram isoladas (single particle) com auxílio de um microscópio óptico e analisadas por voltametria, onde se verificou o aparecimento de picos com os mesmos valores de potenciais. Utilizando os dois estados de comutação de campo (0,2 Tesla), ligado e desligado, foi possível controlar a presença e a ausência da partícula no eletrodo. Também, observaram-se diferenças nos valores de densidade de corrente nos cronoamperogramas para cada micropartícula de Fe3O4-PB e que a morfologia da micropartícula interfere significativamente na resposta eletroquímica. Por fim, e agora se tratando da eletroquímica de nanopartículas de Fe3O4-PB sobre um ultramicroeletrodo (UME) de ouro, controlaram-se as colisões das mesmas em diferentes condições experimentais, como na presença e na ausência de um campo magnético externo paralelo a superfície do eletrodo e com intensidades variadas (0,1 e 0,2 Tesla). Na ausência do campo, as nanopartículas que chegaram ao UME colidiram e se acumularam, gerando sinais eletroquímicos do tipo corrente staircase. Na presença de um campo de 0,1 T, observaram-se vários transientes de correntes (spikes) associados às colisões das nanopartículas, eventos esses não observados frequentemente na presença do campo de 0,2 T. Assim, esses resultados abrem a discussão da necessidade de se aperfeiçoarem os modelos que explicam os perfis das curvas voltamétricas e amperométricas para esses sistemas. / According to recent literature, the electrochemistry of magnetic particles and collision phenomena on surfaces result in unconventional voltammetric and amperometric responses. Some theoretical models has been proposed; however, experimental data are required for improve that. In order to contribute to this research area, this Master\'s Dissertation describes the manipulation of microparticles and nanoparticles of magnetite modified with Prussian blue (Fe3O4-PB), as well as the study of electrochemical properties of them in presence of an external magnetic field. Carbon (graphite) electrodes modified with microparticles were obtained by using two different techniques, (i) magneto-deposition and (ii) drop coating. For both, two peaks in the voltammograms were observed, related to oxidation (0.12 V) and reduction (-0.05 V), which are associated with redox couple Prussian blue / Prussian white. Higher peaks currents were observed for the film obtained via drop coating. Also, individual Fe3O4-PB microparticles (single particles) were isolated by using an optical microscope and analyzed by voltammetry, where there was the appearance of peaks with the same potential values. However, using two commutations magnetic states, \"switch on\" and \"switch off\", it was possible to monitor the presence and the absence of the particle on electrode. Also, there were differences in the values of current density in the chronoamperograms for each Fe3O4-PB microparticle, and the morphology of the microparticle significantly interfered in the electrochemical response. Finally, it was performed several electrochemical experiments regarding to collisions of Fe3O4-PB nanoparticles on a gold ultramicroelectrode. Controlled collisions in different experimental conditions were carried out, such as in the presence and absence of an external magnetic field parallel to the surface electrode, and also with intensities fields of 0.1 and 0.2 Tesla. In the absence of the field, the nanoparticles reached the UME and collided, resulting in electrochemical signals of this type staircase, due to accumulation of them. On the other hand, in the presence of a 0.1 T, we observed several transient currents (spikes) associated with the collisions of the nanoparticles. These events were not observed in the presence of the field of 0.2 T. Thus, these findings allow us to the discussion for improvements on the models for these systems, in order to explain the profiles of voltammetric and amperometric responses.

Giardia duodenalis é um protozoário de distribuição mundial responsável por causar infecções entéricas em uma grande variedade de mamíferos, incluindo os humanos. Mesmo apresentando pouca variação em sua morfologia, os isolados podem ser diferenciados, de acordo com análises de proteína e polimorfismo de DNA, em pelo menos oito agrupamentos genéticos distintos, denominados assemblages (A-H). Apenas os assemblages A e B têm sido reportados em humanos e outros mamíferos. Isolados de assemblage A podem, ainda, ser divididos em quatro sub-assemblages (AI, AII, AIII e AIV). Sequencias heterogêneas têm sido frequentemente identificadas em estudos de caracterização molecular envolvendo amostras contendo múltiplos cistos do parasita. Buscando estudar a ocorrência dos eventos de heterozigose de sequencia alélica (ASH) e recombinação gênica, o presente trabalho teve como objetivo isolar cistos de G. duodenalis empregando-se a técnica de micromanipulação e caracterizá-los molecularmente através da análise multilócus envolvendo os genes gdh, tpi, orfC4 e bg. Dez cistos foram individualizados e utilizados na pesquisa. Todos foram igualmente identificados por todos os genes, nove cistos caracterizados como assemblage AII e um cisto caracterizado como assemblage B. Os cromatogramas oriundos do cisto identificado como assemblages B apresentaram diversos sítios heterogêneos nos genes gdh, bg e orfC4, sendo que, nesses dois últimos, observaram-se sobreposições dos alelos AII e B no produto sequenciado (heterozigose inter assemblage). Os produtos de PCR foram clonados e as sequencias obtidas revelaram a ocorrência dos dois alelos neste único cisto. Os sítios polimórficos encontrados nas sequencias do gene gdh indicaram heterozigose intra assemblage B. Embora ASH já tenha sido relatada em cistos individualizados de G. duodenalis, estes são os primeiros resultados indicando a presença dos dois alelos, simultaneamente, em um único indivíduo. Esses resultados demonstram fortes evidências que ocorre troca genética entre indivíduos geneticamente distintos de G. duodenalis / Giardia duodenalis is a worldwide distribution enteric protozoan responsible for causing infections in a wide variety of mammals, including humans. Even showing little change in their morphology, isolates can be distinguished, according to the analysis of proteins and DNA polymorphisms in at least eight distinct genetic groups, known assemblages (A - H). Only assemblages A and B have been reported in humans and other mammals. Isolates of assemblage A also can be divided into four sub-assemblages (AI, AII, AIII and AIV). Heterogeneous sequences have been frequently identified in studies involving molecular characterization of samples containing multiple cysts of the parasite. Seeking to study the occurrence of allelic sequence heterozygosity (ASH) and genetic recombination events, the present study aimed to isolate G. duodenalis cysts employing the micromanipulation technique and characterize them molecularly through multilocus analysis involving gdh, tpi, orfC4 and bg genes. Ten cysts were individualized and used in the research. All cysts were equally identified for all genes; nine cysts were characterized as assemblage AII and one characterized as assemblage B. The chromatograms derived from the cyst identified as assemblage B presented many heterogeneous sites in gdh, bg and orfC4 genes, and in these last two, there were overlaps of alleles AII and B in the sequenced product (heterozygous inter assemblage). PCR products were cloned and the sequences obtained revealed the occurrence of two alleles at this single cyst. The polymorphic sites found in the sequences of the gdh gene indicated intra heterozygosity assemblage B. Although ASH has already been reported in G. duodenalis individualized cysts, these are the first results indicating the presence of two alleles simultaneously in a single individual. These results demonstrate strong evidence that genetic exchange occurs between individuals genetically distinct of G. duodenalis

De acordo com a literatura recente, a eletroquímica de partículas magnéticas e fenômenos de colisões em superfícies eletródicas resultam em curvas voltamétricas e amperométricas com perfis completamente destoados do convencional. Alguns modelos teóricos propõem explicações, no entanto, ainda se observa a necessidade de aquisição de mais dados experimentais. Visando contribuir com esta área, esta Dissertação de Mestrado aborda a manipulação de micropartículas e nanopartículas de magnetita modificadas com azul da Prússia (Fe3O4-PB), bem como o estudo das propriedades eletroquímicas das partículas na presença de um campo magnético externo. Filmes constituídos por micropartículas sobre eletrodos de carbono (grafite) foram obtidos por duas técnicas distintas, drop coating e magneto-deposição. Para ambos os métodos, os filmes apresentaram dois picos nos voltamogramas, um de oxidação (0,12 V) e outro de redução (-0,05 V), que estão associados ao par redox azul da Prússia/branco da Prússia. Para o filme obtido via drop coating, observaram-se correntes de pico mais elevadas. Também, micropartículas de Fe3O4-PB individuais foram isoladas (single particle) com auxílio de um microscópio óptico e analisadas por voltametria, onde se verificou o aparecimento de picos com os mesmos valores de potenciais. Utilizando os dois estados de comutação de campo (0,2 Tesla), ligado e desligado, foi possível controlar a presença e a ausência da partícula no eletrodo. Também, observaram-se diferenças nos valores de densidade de corrente nos cronoamperogramas para cada micropartícula de Fe3O4-PB e que a morfologia da micropartícula interfere significativamente na resposta eletroquímica. Por fim, e agora se tratando da eletroquímica de nanopartículas de Fe3O4-PB sobre um ultramicroeletrodo (UME) de ouro, controlaram-se as colisões das mesmas em diferentes condições experimentais, como na presença e na ausência de um campo magnético externo paralelo a superfície do eletrodo e com intensidades variadas (0,1 e 0,2 Tesla). Na ausência do campo, as nanopartículas que chegaram ao UME colidiram e se acumularam, gerando sinais eletroquímicos do tipo corrente staircase. Na presença de um campo de 0,1 T, observaram-se vários transientes de correntes (spikes) associados às colisões das nanopartículas, eventos esses não observados frequentemente na presença do campo de 0,2 T. Assim, esses resultados abrem a discussão da necessidade de se aperfeiçoarem os modelos que explicam os perfis das curvas voltamétricas e amperométricas para esses sistemas. / According to recent literature, the electrochemistry of magnetic particles and collision phenomena on surfaces result in unconventional voltammetric and amperometric responses. Some theoretical models has been proposed; however, experimental data are required for improve that. In order to contribute to this research area, this Master\'s Dissertation describes the manipulation of microparticles and nanoparticles of magnetite modified with Prussian blue (Fe3O4-PB), as well as the study of electrochemical properties of them in presence of an external magnetic field. Carbon (graphite) electrodes modified with microparticles were obtained by using two different techniques, (i) magneto-deposition and (ii) drop coating. For both, two peaks in the voltammograms were observed, related to oxidation (0.12 V) and reduction (-0.05 V), which are associated with redox couple Prussian blue / Prussian white. Higher peaks currents were observed for the film obtained via drop coating. Also, individual Fe3O4-PB microparticles (single particles) were isolated by using an optical microscope and analyzed by voltammetry, where there was the appearance of peaks with the same potential values. However, using two commutations magnetic states, \"switch on\" and \"switch off\", it was possible to monitor the presence and the absence of the particle on electrode. Also, there were differences in the values of current density in the chronoamperograms for each Fe3O4-PB microparticle, and the morphology of the microparticle significantly interfered in the electrochemical response. Finally, it was performed several electrochemical experiments regarding to collisions of Fe3O4-PB nanoparticles on a gold ultramicroelectrode. Controlled collisions in different experimental conditions were carried out, such as in the presence and absence of an external magnetic field parallel to the surface electrode, and also with intensities fields of 0.1 and 0.2 Tesla. In the absence of the field, the nanoparticles reached the UME and collided, resulting in electrochemical signals of this type staircase, due to accumulation of them. On the other hand, in the presence of a 0.1 T, we observed several transient currents (spikes) associated with the collisions of the nanoparticles. These events were not observed in the presence of the field of 0.2 T. Thus, these findings allow us to the discussion for improvements on the models for these systems, in order to explain the profiles of voltammetric and amperometric responses.