Dans le cadre de la bioévaluation de matrices polluées, les objectifs de cette thèse ont d’abord été de mettre au point deux tests de génotoxicité sur les racines secondaires de la fève Vicia faba. D’abord, le test des micronoyaux, dont les résultats prometteurs ont permis l’initiation d’un processus de normalisation internationale par l’ISO. Ensuite, l’essai des comètes, avec des résultats moins encourageants en termes de faisabilité et de précision. Nous avons également tenté d’éclaircir les conséquences de la formation de micronoyaux sur le cycle de vie de la plante. Les résultats obtenus avec le cadmium, le cuivre et l’hydrazide maléique suggèrent un lien entre la présence de micronoyaux à court terme et une modification à long terme des traits d’histoire de vie de la plante. Le test des micronoyaux a aussi été appliqué parmi d’autres biomarqueurs pour évaluer l’écotoxicité de matrices contaminées, liquides ou solides. Dans le cadre du Groupement d’Intérêt Scientifique pour les Friches Industrielles (GISFI), nous avons évalué la génotoxicité de sols pollués par d’anciennes activités de cokerie. Nous avons également participé au projet « Ecotoxicité des sous-produits d’altération de Nanomatériaux » (Nanoalter), dans le cadre duquel nous avons évalué les dangers potentiels posés par la dégradation dans l’environnement de crèmes solaires comprenant des nanoparticules de dioxyde de titane. Enfin, les mécanismes de tolérance des plantes aux toxiques ont été étudiés par le dosage des phytochélatines et des enzymes du stress oxydant. / In the context of optimizing plant tests for polluted soil materials bioassessment, the objectives of this thesis were firstly the development of two genotoxicity tests on the secondary roots of a plant model, the broad bean Vicia faba. The first test was the micronucleus assay and gave promising results that lead to an international ISO standardizing process. The second test named comet assay and brought us less encouraging results because of problems with feasibility and precision. .To improve our knowledge about the consequences of micronuclei formation on plant life cycle, we studied life-history traits of beans developing from germination in a soil containing a sufficient quantity of genotoxic (cadmium, copper and maleic hydrazide) to induce micronuclei without provoking short-term (48h) growth retardation. The obtained results evoked a link between micronuclei presence after 48h and plant life cycle change or impairments.Besides, the micronucleus assay was applied among other assays or biomarkers to evaluate ecotoxicity of liquid or solid contaminated matrix. As part of the French Scientific Interest Group on Industrial Wasteland (GISFI), we evaluated the genotoxicity of soils polluted by a former coke-factory. Furthermore, we took part to the project “Ecotoxicity of nanomaterial alteration byproducts”, also called Nanoalter. Our goal was to assess the potential hazards attached to the environmental degradation of titanium dioxide-containing sunscreen nanocomposites. Then, the tolerance mechanisms of plants towards chemicals were studied by phytochelatins and oxidative stress enzymes measurements.

Les égoutiers sont exposés à une grande variété de mélanges de produits chimiques beaucoup ce sont des substances génotoxiques ou cancérigènes. Le but de cette étude transversale était d'explorer des biomarqueurs intégrés d’exposition et des effets précoces chez les égoutiers afin de mieux apprécier leur risque cancérogène (article I-protocole). L'article II expose l'étape de validation préalable effectuée sur la lignée cellulaire pour nos objectifs. Avec un recueil en 10 mois et sur une base hebdomadaire, nous avons, a) évalué l'exposition personnelle des égoutiers (n=34) et administratifs (n=30) (groupe témoin) à des hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et composés organiques volatils (COV) dans l'air des lieux de travail, b) évalué la génotoxicité de leurs extraits organiques urinaire par des tests in vitro : tests des comète et des micronoyaux sur les cellules Hep G2, c) évalué la réponse à un stress oxydatif de l'ADN par la mesure du 8 oxo 2' deoxyguanosine urinaire (8 oxodG) dans les urines de 24h (Article III). Les tests ont montré la présence de plus de génotoxiques dans les urines des égoutiers (P <0,001). La moyenne du 8 oxodG urinaire chez les égoutiers était plus élevée (non significatif, P = 0,28) que les administratifs et ses valeurs moyennes ont été associées (P = 0,04) avec les années de travail dans le système des égouts. Les concentrations des HAP et COV dans l'atmosphère professionnelle des égoutiers étaient élevées par rapport à celles des administratifs (P <0,01) et il a été montré une augmentation de risque du cancer en utilisant les facteurs d'équivalence de toxicité et de risque unitaire de cancer. En conclusion, les biomarqueurs intégrés urinaire d’exposition et non spécifiques montrent que les égoutiers sont professionnellement exposés aux mélanges des substances génotoxiques. Il n’est pas possible de relier nos résultats avec l’accroissement du risque cancérogène chez les égoutiers. / Sewage workers are exposed to a wide variety of mixtures of chemicals many were shown to be genotoxicants or carcinogens. The aim of this cross sectional study was to explore integrated biomarkers of exposure and of early effects among sewage workers in order to better assess their carcinogenic risk (Paper I-protocol). Paper II, describes the validation step performed prior to choose the cellular line that meet our objectives. Over 10 months and on weekly basis, we, a) assessed the personal exposure of sewage (n=34) and office (n=30) workers (control group) to polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) and volatile organic compounds (VOCs) in the air of workplaces, b) evaluated the genotoxicity of organic urine extracts by in vitro comet and micronucleus assays on Hep G2 cells, c) assessed the DNA oxidative stress by the 24h urinary 8 oxo 2' deoxyguanosine (8 oxodG) (Paper III). The tests showed greater genotoxicity in the urine extracts of sewage workers (P<0.001). The 24hr urinary 8 oxodG mean level in sewage workers was higher (nonsignificant, P=0.28) than office workers and its mean values were associated (P=0.04) with working years in sewage system. Workplace air concentrations of PAHs and VOCs were elevated in sewage compared to office workplaces (P<0.01) and resulted in an increased lifetime cancer risk using toxicity equivalent factors and inhalation unit risk of cancer. In conclusion, the applied integrated and non-specific urinary biomarkers show that sewage workers experience exposure to multiple genotoxicants at the workplace. It is not possible to simply link our results with the increased cancer risk in sewage workers.

Cette thèse étudie les principes de mise en oeuvre pour l'exécution sur un même ordinateur, de tâches de niveaux de criticité différents, et dont certaines peuvent avoir des contraintes temps réel dur. Les difficultés pour réaliser ces objectifs forment trois catégories. Il faut d'abord prouver que les tâches disposeront d'assez de ressources pour s'exécuter; il doit être ainsi possible d'avoir des politiques d'allocations et d'ordonnancement sûres, prévisibles et simples. Il faut également apporter des garanties de sécurité pour s'assurer que les tâches critiques s'exécuteront correctement en présence de défaillances ou malveillances. Enfin, le système doit pouvoir être réutilisé dans une variété de situations. Cette thèse propose de s'attaquer au problème par la conception d'un système hautement sécurisé, extensible, et qui soit indépendant des politiques d'allocation de ressources. Cela est notamment accompli par le prêt de ressource, qui permet de décompter les ressources indépendamment des domaines de protection. Cette approche évite d'avoir à partitionner les ressources, ce qui simplifie le problème global de l'allocation et permet de ne pas gâcher de ressources. Les problèmes de type inversion de priorité, famine ou dénis de service sont supprimés à la racine. Nous démontrons la faisabilité de cette approche è l'aide d'un prototype, Anaxagoros. La démarche que nous proposons simplifie drastiquement l'allocation des ressources mais implique des contraintes dans l'écriture de services partagés (comme les pilotes de périphériques). Les principales difficultés consistent en des contraintes de synchronisation supplémentaires. Nous proposons des mécanismes originaux et efficaces pour résoudre les problèmes de concurrence et synchronisation, et une méthodologie générale pour faciliter l'écriture sécurisée de ces services partagés.

La fumée du tabac est un aérosol extrêmement complexe constitué de milliers de composés répartis entre la phase particulaire et la phase vapeur. Il a été démontré que les effets toxicologiques de cette fumée sont associés aux composés appartenant aux deux phases. Plusieurs composés biologiquement actifs ont été identifiés dans la fumée du tabac; cependant, il n’y a pas d’études démontrant la relation entre les réponses biologiques obtenues via les tests in vitro ou in vivo et les composés présents dans la fumée entière du tabac. Le but de la présente recherche est de développer des méthodes fiables et robustes de fractionnement de la fumée à l’aide de techniques de séparation analytique et de techniques de détection combinés à des essais in vitro toxicologiques. Une étude antérieure réalisée par nos collaborateurs a démontré que, suite à l’étude des produits de combustion de douze principaux composés du tabac, l’acide chlorogénique s’est avéré être le composé le plus cytotoxique selon les test in vitro du micronoyau. Ainsi, dans cette étude, une méthode par chromatographie préparative en phase liquide a été développée dans le but de fractionner les produits de combustion de l’acide chlorogénique. Les fractions des produits de combustion de l’acide chlorogénique ont ensuite été testées et les composés responsables de la toxicité de l’acide chlorogénique ont été identifiés. Le composé de la sous-fraction responsable en majeure partie de la cytoxicité a été identifié comme étant le catéchol, lequel fut confirmé par chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse à temps de vol. Des études récentes ont démontré les effets toxicologiques de la fumée entière du tabac et l’implication spécifique de la phase vapeur. C’est pourquoi notre travail a ensuite été focalisé principalement à l’analyse de la fumée entière. La machine à fumer Borgwaldt RM20S® utilisée avec les chambres d’exposition cellulaire de British American Tobacco permettent l’étude in vitro de l’exposition de cellules à différentes concentrations de fumée entière du tabac. Les essais biologiques in vitro ont un degré élevé de variabilité, ainsi, il faut prendre en compte toutes les autres sources de variabilité pour évaluer avec précision la finalité toxicologique de ces essais; toutefois, la fiabilité de la génération de la fumée de la machine n’a jamais été évaluée jusqu’à maintenant. Nous avons donc déterminé la fiabilité de la génération et de la dilution (RSD entre 0,7 et 12 %) de la fumée en quantifiant la présence de deux gaz de référence (le CH4 par détection à ionisation de flamme et le CO par absorption infrarouge) et d’un composé de la phase particulaire, le solanesol (par chromatographie en phase liquide à haute performance). Ensuite, la relation entre la dose et la dilution des composés de la phase vapeur retrouvée dans la chambre d’exposition cellulaire a été caractérisée en utilisant une nouvelle technique d’extraction dite par HSSE (Headspace Stir Bar Sorptive Extraction) couplée à la chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse. La répétabilité de la méthode a donné une valeur de RSD se situant entre 10 et 13 % pour cinq des composés de référence identifiés dans la phase vapeur de la fumée de cigarette. La réponse offrant la surface maximale d’aire sous la courbe a été obtenue en utilisant les conditions expérimentales suivantes : intervalle de temps d’exposition/ désorption de 10 0.5 min, température de désorption de 200°C pour 2 min et température de concentration cryogénique (cryofocussing) de -75°C. La précision de la dilution de la fumée est linéaire et est fonction de l’abondance des analytes ainsi que de la concentration (RSD de 6,2 à 17,2 %) avec des quantités de 6 à 450 ng pour les composés de référence. Ces résultats démontrent que la machine à fumer Borgwaldt RM20S® est un outil fiable pour générer et acheminer de façon répétitive et linéaire la fumée de cigarette aux cultures cellulaires in vitro. Notre approche consiste en l’élaboration d’une méthodologie permettant de travailler avec un composé unique du tabac, pouvant être appliqué à des échantillons plus complexes par la suite ; ex : la phase vapeur de la fumée de cigarette. La méthodologie ainsi développée peut potentiellement servir de méthode de standardisation pour l’évaluation d’instruments ou de l’identification de produits dans l’industrie de tabac. / Tobacco smoke is an extremely complex aerosol composed of thousands of constituents distributed amongst the particulate and vapor phases. Toxicological effects have been linked to compounds present in both of these phases. Many biologically active compounds have been identified within tobacco smoke; however, there is a lack of studies correlating specific in vitro or in vivo biological responses to components within whole tobacco smoke. The goal of this research was to develop reliable and robust smoke fractionation methods using analytical separation and detection techniques in combination with in vitro toxicological assays. In a previous study by our collaborators, toxicological assessment of the particulate phase combustion products of twelve individual tobacco components revealed that the combustion products of chlorogenic acid were the most cytotoxic using the in vitro micronucleus test. Therefore, a preparative liquid chromatography method was developed in this work to fractionate the combustion products of chlorogenic acid to assess the bioactivity of these fractions and to identify the compounds responsible for the toxicity observed. The sub-fraction responsible for the most cytotoxic response comprised catechol, which was identified by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Emerging studies have highlighted the toxicological significance of whole tobacco smoke and specifically the vapor phase, which shifted our focus to whole smoke analyses. The Borgwaldt RM20S® smoking machine in combination with British American Tobacco’s in vitro cell exposure chamber allow for the generation of fresh cigarette smoke in various doses and delivery to cell cultures. In vitro biological assays have a high degree of variability, thus, all other sources of variability must be accounted for to accurately assess toxicological endpoints; however, the reliability of dose delivery of the instrument had not been assessed until now. We have determined the reliability (RSD from 0.7-12%) of smoke generation and dilution by quantifying two reference standard gases (CH4 by flame ionization detection and CO by infrared absorption) and the tobacco particulate phase marker, solanesol (by high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detection). The relationship between dose and diluted vapor phase components found within the exposure chamber was then characterized by developing a headspace stir-bar sorptive extraction-gas chromatography/mass spectrometry method. The method repeatability gave an RSD from 10-13% for five reference compounds identified in the vapor phase of cigarette smoke. The maximal peak area response was obtained using the following experimental conditions: exposure-to-desorption time interval of 10  0.5 min, desorption temperature of 200 °C for 2 min, and a cryofocussing temperature of -75 °C. The dilution precision was found to yield a linear response of analyte abundance and was observed to be a function of concentration (RSD from 6.2-17.2 %) with quantities of 6-450 ng for the reference compounds. The findings obtained suggest the Borgwaldt RM20S® is a reliable tool to generate and deliver repeatable and linear doses of cigarette smoke to in vitro cell cultures. Our approach began with designing the methodology to work with an individual tobacco component, which could then be applied to a more complex sample, e.g., the vapor phase of cigarette smoke. The methodology developed can potentially serve as standardized methods for the assessment of instrumentation or screening of products for the Tobacco Industry.

La fumée du tabac est un aérosol extrêmement complexe constitué de milliers de composés répartis entre la phase particulaire et la phase vapeur. Il a été démontré que les effets toxicologiques de cette fumée sont associés aux composés appartenant aux deux phases. Plusieurs composés biologiquement actifs ont été identifiés dans la fumée du tabac; cependant, il n’y a pas d’études démontrant la relation entre les réponses biologiques obtenues via les tests in vitro ou in vivo et les composés présents dans la fumée entière du tabac. Le but de la présente recherche est de développer des méthodes fiables et robustes de fractionnement de la fumée à l’aide de techniques de séparation analytique et de techniques de détection combinés à des essais in vitro toxicologiques. Une étude antérieure réalisée par nos collaborateurs a démontré que, suite à l’étude des produits de combustion de douze principaux composés du tabac, l’acide chlorogénique s’est avéré être le composé le plus cytotoxique selon les test in vitro du micronoyau. Ainsi, dans cette étude, une méthode par chromatographie préparative en phase liquide a été développée dans le but de fractionner les produits de combustion de l’acide chlorogénique. Les fractions des produits de combustion de l’acide chlorogénique ont ensuite été testées et les composés responsables de la toxicité de l’acide chlorogénique ont été identifiés. Le composé de la sous-fraction responsable en majeure partie de la cytoxicité a été identifié comme étant le catéchol, lequel fut confirmé par chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse à temps de vol. Des études récentes ont démontré les effets toxicologiques de la fumée entière du tabac et l’implication spécifique de la phase vapeur. C’est pourquoi notre travail a ensuite été focalisé principalement à l’analyse de la fumée entière. La machine à fumer Borgwaldt RM20S® utilisée avec les chambres d’exposition cellulaire de British American Tobacco permettent l’étude in vitro de l’exposition de cellules à différentes concentrations de fumée entière du tabac. Les essais biologiques in vitro ont un degré élevé de variabilité, ainsi, il faut prendre en compte toutes les autres sources de variabilité pour évaluer avec précision la finalité toxicologique de ces essais; toutefois, la fiabilité de la génération de la fumée de la machine n’a jamais été évaluée jusqu’à maintenant. Nous avons donc déterminé la fiabilité de la génération et de la dilution (RSD entre 0,7 et 12 %) de la fumée en quantifiant la présence de deux gaz de référence (le CH4 par détection à ionisation de flamme et le CO par absorption infrarouge) et d’un composé de la phase particulaire, le solanesol (par chromatographie en phase liquide à haute performance). Ensuite, la relation entre la dose et la dilution des composés de la phase vapeur retrouvée dans la chambre d’exposition cellulaire a été caractérisée en utilisant une nouvelle technique d’extraction dite par HSSE (Headspace Stir Bar Sorptive Extraction) couplée à la chromatographie en phase liquide/ spectrométrie de masse. La répétabilité de la méthode a donné une valeur de RSD se situant entre 10 et 13 % pour cinq des composés de référence identifiés dans la phase vapeur de la fumée de cigarette. La réponse offrant la surface maximale d’aire sous la courbe a été obtenue en utilisant les conditions expérimentales suivantes : intervalle de temps d’exposition/ désorption de 10 0.5 min, température de désorption de 200°C pour 2 min et température de concentration cryogénique (cryofocussing) de -75°C. La précision de la dilution de la fumée est linéaire et est fonction de l’abondance des analytes ainsi que de la concentration (RSD de 6,2 à 17,2 %) avec des quantités de 6 à 450 ng pour les composés de référence. Ces résultats démontrent que la machine à fumer Borgwaldt RM20S® est un outil fiable pour générer et acheminer de façon répétitive et linéaire la fumée de cigarette aux cultures cellulaires in vitro. Notre approche consiste en l’élaboration d’une méthodologie permettant de travailler avec un composé unique du tabac, pouvant être appliqué à des échantillons plus complexes par la suite ; ex : la phase vapeur de la fumée de cigarette. La méthodologie ainsi développée peut potentiellement servir de méthode de standardisation pour l’évaluation d’instruments ou de l’identification de produits dans l’industrie de tabac. / Tobacco smoke is an extremely complex aerosol composed of thousands of constituents distributed amongst the particulate and vapor phases. Toxicological effects have been linked to compounds present in both of these phases. Many biologically active compounds have been identified within tobacco smoke; however, there is a lack of studies correlating specific in vitro or in vivo biological responses to components within whole tobacco smoke. The goal of this research was to develop reliable and robust smoke fractionation methods using analytical separation and detection techniques in combination with in vitro toxicological assays. In a previous study by our collaborators, toxicological assessment of the particulate phase combustion products of twelve individual tobacco components revealed that the combustion products of chlorogenic acid were the most cytotoxic using the in vitro micronucleus test. Therefore, a preparative liquid chromatography method was developed in this work to fractionate the combustion products of chlorogenic acid to assess the bioactivity of these fractions and to identify the compounds responsible for the toxicity observed. The sub-fraction responsible for the most cytotoxic response comprised catechol, which was identified by liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry. Emerging studies have highlighted the toxicological significance of whole tobacco smoke and specifically the vapor phase, which shifted our focus to whole smoke analyses. The Borgwaldt RM20S® smoking machine in combination with British American Tobacco’s in vitro cell exposure chamber allow for the generation of fresh cigarette smoke in various doses and delivery to cell cultures. In vitro biological assays have a high degree of variability, thus, all other sources of variability must be accounted for to accurately assess toxicological endpoints; however, the reliability of dose delivery of the instrument had not been assessed until now. We have determined the reliability (RSD from 0.7-12%) of smoke generation and dilution by quantifying two reference standard gases (CH4 by flame ionization detection and CO by infrared absorption) and the tobacco particulate phase marker, solanesol (by high performance liquid chromatography-ultraviolet absorption detection). The relationship between dose and diluted vapor phase components found within the exposure chamber was then characterized by developing a headspace stir-bar sorptive extraction-gas chromatography/mass spectrometry method. The method repeatability gave an RSD from 10-13% for five reference compounds identified in the vapor phase of cigarette smoke. The maximal peak area response was obtained using the following experimental conditions: exposure-to-desorption time interval of 10  0.5 min, desorption temperature of 200 °C for 2 min, and a cryofocussing temperature of -75 °C. The dilution precision was found to yield a linear response of analyte abundance and was observed to be a function of concentration (RSD from 6.2-17.2 %) with quantities of 6-450 ng for the reference compounds. The findings obtained suggest the Borgwaldt RM20S® is a reliable tool to generate and deliver repeatable and linear doses of cigarette smoke to in vitro cell cultures. Our approach began with designing the methodology to work with an individual tobacco component, which could then be applied to a more complex sample, e.g., the vapor phase of cigarette smoke. The methodology developed can potentially serve as standardized methods for the assessment of instrumentation or screening of products for the Tobacco Industry.