La production de microparticules pendant le processus de cicatrisation par les myofibroblastes provenant de plaies est une nouvelle voie de recherche dans le domaine de la communication intercellulaire. À notre connaissance, l’étude de microparticules produites par les cellules de tissus est une première. Les microparticules sont perçues comme étant des cargos transporteurs de signaux. Afin de déterminer le type d’information que les microparticules produites par les myofibroblastes cicatriciels transportent, leur contenu protéique a été caractérisé. Trois techniques d’extraction des protéines couplées à l’analyse par spectrométrie de masse ont été utilisées : le 2D-DIGE, la méthode du Disc SDS-PAGE améliorée ainsi qu’un lysat total précipité à l’acétone. La liste de protéines obtenue a permis d’identifier l’implication potentielle des microparticules dans plusieurs voies signalétiques. La caractérisation du protéome des microparticules produites par les myofibroblastes cicatriciels permettra une meilleure compréhension de la communication intercellulaire qui se produit pendant le processus de cicatrisation. / Production of microparticles by myofibroblasts during wound healing process is a new finding in the field of cellular communication. To our knowledge, study of microparticles secreted by cell tissue is a premiere. Microparticles are thought to be carriers for signaling. To determine information carried by wound healing myofibroblast microparticles, their protein content has been characterized. Three means of protein extraction followed by mass spectrometry have been used : 2D-DIGE, improved Disc SDS-PAGE and acetone precipitation. The obtained list of proteins allows the identification of potential implication of microparticles in several pathways. Wound healing myofibroblast microparticles proteome characterization will help to better understand intercellular communication during wound healing.

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La production de tissus par génie tissulaire est un domaine dont la finalité clinique est en pleine expansion. De nombreux facteurs restent cependant à améliorer afin de permettre leur utilisation extensive. Nos objectifs étaient d’évaluer la capacité d’extraits d’algue et des molécules isolées de sérum à optimiser différentes étapes de la production des tissus par génie tissulaire. Nos hypothèses étaient que l'ajout des extraits d’algue diminue le temps de fabrication des peaux reconstruites en stimulant la production et le dépôt de matrice alors que les protéines isolées du sérum stimulent la production de microparticules (MP) par les cellules du derme, ces MP ayant été démontrées avoir une action sur la croissance des cellules endothéliales et donc sur la vascularisation des greffons. / Skin production by tissue engineering method is a field whose clinical purpose is expanding. However, many factors need to be improved to enable their extensive use. Our objectives were to evaluate the ability of seaweed extracts and serum molecules to optimize different stages of tissue-engineered skin production. Our hypotheses were that adding seaweed extracts reduces the manufacturing time of reconstructed skin by stimulating the production and the deposition of the extracellular matrix while serum- isolated proteins stimulate the production of microparticles (MP) by the dermal cells, the MP stimulating growth of endothelial cells and thus, potentially, vascularization of the grafts.

Suite à une lésion de la peau, des cellules spécialisées nommées myofibroblastes (Wmyo) apparaissent au niveau de la plaie pour participer au processus de cicatrisation. Ces Wmyo produisent des microvésicules (MV) comme signal paracrine. Les MV peuvent transférer des informations biologiques sur de courtes ou longues distances affectant des processus biologiques. Nous avons précédemment démontré que ces MV stimulent *in vitro* l'angiogenèse et le remodelage tissulaire, deux étapes clés de la cicatrisation. Par contre, les études *in vitro* ne prennent pas en compte les mécanismes de diffusion des MV dans les tissus solides. La matrice extracellulaire (MEC) et la barrière endothéliale (BE) sont deux obstacles qui peuvent affecter le transport des MV et donc moduler leur action. Nous avons énoncé l'hypothèse que la MEC peut être impliquée dans la diffusion des MV lors de la cicatrisation cutanée et que les MV pourront diffuser à travers la BE favorisant ainsi une signalisation endocrinienne. L'objectif de cette étude est d'explorer les mécanismes de diffusion des MV dans leur environnement cicatriciel, à travers différentes molécules de la MEC et la BE. Ici, nous présentons un modèle d'hydrogels et de Transwell® pour étudier la diffusion des MV. Le transport des MV ainsi que les mécanismes liés à ce phénomène ont été analysés. Nos résultats montrent que les MV diffusent librement à travers les hydrogels composés de fibrine ou de collagène de type III, deux molécules prédominantes au début de la cicatrisation. Par contre, elles lient le collagène de type I, molécule prédominante en fin de cicatrisation, grâce à l'intégrine α2β1 présente à leur surface. Nos résultats indiquent aussi que les MV peuvent traverser la BE dans des conditions semblables à celles d'une plaie cutanée. Nos résultats suggèrent que la biodisponibilité des MV ainsi que leur action lors de la cicatrisation normale de la peau pourraient être dictées par l'organisation locale de la MEC et l'état de la BE. Cette étude permet une meilleure compréhension du devenir des MV au cours du processus de la cicatrisation et pourrait aider au développement de vésicules modifiées utilisées pour l'administration de médicaments. / Myofibroblasts (Wmyo) are specialized cells that appear in the skin after a lesion to participate in the healing process. Wmyo produce microvesicles (MVs) as a signaling mechanism to transfer biological information and influence biological processes over both short and long distances. Our previous research has shown that these MVs can stimulate angiogenesis and tissue remodeling, which are crucial steps in wound healing. However, *in vitro* studies do not account for MV diffusion in solid tissues, where the extracellular matrix (ECM) and the endothelial barrier (EB) may impede MV transport and modulate their effects. We hypothesized that the ECM may be involved in MV diffusion during skin healing and that MVs may diffuse through the EB thus promoting endocrine signaling. The purpose of this study is to examine how MVs diffuse within their scar surroundings, through various ECM molecules and the EB. Here, we present a model of hydrogels and transwell to study the diffusion of MVs. The transport of MVs as well as the mechanisms related to this phenomenon have been analyzed. Our results show that MVs diffuse freely through hydrogels composed of fibrin or type III collagen, two predominant molecules during the early stages of healing. In contrast, they bind to type I collagen, the predominant molecule during the final stages of healing, due to the presence of integrin α2β1 on their surface. Additionally, our results suggest that MVs can cross the EB under conditions that resemble those found in skin wounds. Our results suggest that the bioavailability of MVs as well as their action during normal skin healing could be influenced by the local organization of the ECM and the state of the EB. This study allows a better understanding of the behavior of MVs during the healing process and could help the development of modified vesicles used for drug delivery.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdorales, 2014-2015 / La media vasculaire est au coeur des processus physiopathologiques qui entraînent le développement de l’athérosclérose. L’utilisation d’une media reconstruite par génie tissulaire permet d’étudier les cellules musculaires lisses (CML) humaines dans un environnement plus physiologique que les cellules en culture monocouche. Les travaux présentés dans cette thèse sont orientés autour de la media vasculaire reconstruite par génie tissulaire comme modèle d’étude pharmacologique et prothèse vasculaire autologue. La première partie des travaux porte sur l’étude des interactions de cette tunique avec les microparticules (MP) circulantes. D’abord, nous avons montré que la présence de l’adventice modifie la réponse de la media aux MP produites in vitro à partir des lymphocytes T. Ensuite, l’étude de l’effet des MP isolées du sérum de patients en choc septique sur la media humaine a démontré que ces MP sont en mesure d’augmenter la contraction de la media par un mécanisme impliquant une diminution du NO et une augmentation de l’expression de l’ARN messager de l’interleukine-10. L’incubation de la media reconstruite avec cette cytokine anti-inflammatoire bloque l’hyporéactivité induite par les lipopolysaccharides. Le même phénomène a été reproduit in vivo, chez le rongeur. Ces résultats suggèrent que les SMP auraient un effet protecteur sur la fonction vasculaire, en potentialisant la contraction de la media. Ensuite, nous avons optimisé l’approche de reconstruction de prothèses vasculaires par auto-assemblage proposée initialement pour l’adapter au contexte particulier des CML. L’objectif principal était de permettre l’étude physiopathologique de la media à partir de toutes les lignées de CML; indépendamment de leur capacité de synthèse de matrice extracellulaire. Pour ce faire, nous avons développé un échafaudage de matrice extracellulaire produit par auto-assemblage à partir de fibroblastes humains. L’utilisation de cet échafaudage génère une media plus résistante et plus contractile que la technique initiale. Enfin, une anisotropie a été créée dans cet échafaudage pour permettre une orientation physiologique des CML. La media reconstruite devient ainsi plus résistante et plus contractile. Ces améliorations permettent de reconstruire des media à partir des cellules de plus de patients et mèneront à des études pharmacologiques plus représentatives de la population. Cet échafaudage facilitera la translation clinique de ce modèle de media reconstruite par génie tissulaire. / The pathological processes that result in the development of atherosclerostic lesions take place in the vascular media layer. This condition is responsible for half of cardiovascular associated fatalities. The development of a tissue-engineered blood vessel can contribute to the in vitro study of the human media in a 3-dimensional environment. This blood vessel can also be used as a prosthesis for arterial bypasses. The work presented here focus on the reconstructed vascular media as a pharmacological model and a potential vascular substitute. The vascular media reconstructed by self-assembly was used to study the interactions between this layer and circulating microparticles (MPs). We demonstrated that the adventitia layer can influence the response of the media to T-Lymphocytes derived MPs. Next, we investigated the influence of MPs isolated from whole blood of septic shock patients (SMPs), on the human engineered media. This study demonstrated that the SMPs decrease nitric oxide (NO) production and increase interleukin-10 (IL-10) messenger RNA in the media layer. Incubation of reconstructed media with this anti-inflammatory cytokine blocks the hyporeactivity induced by lipopolysaccharides. This finding was confirmed in vivo, in rodents. Therefore, the elevation of MP levels in sepsis is potentially probeneficial to the cardiovascular function in this pathology. We then investigated the feasibility of improving the reconstructed media in order to facilitate the physiopathological studies of this layer and improve the potential of a smooth muscle cell (SMC)-containing substitutes to be implanted in human. Therefore, the self-assembly approach was used to generate an extracellular matrix (ECM) scaffold, produced in vitro by fibroblasts, in which SMCs can be seeded. After a week of culture in a decellularised matrix scaffold, the SMC-containing sheets were rolled around a mandrel to form a media layer. This engineered media demonstrated an increase mechanical resistance and contractility as compared with the original technique. Finally, we created an anisotropic ECM scaffold that can direct the orientation of SMCs to reproduce the physiological orientation of that layer. Reconstructed media produced using those anisotropic scaffolds were more resistant and contractile than the ones reconstructed using isotropic scaffolds. These improvements will facilitate the reconstruction of a media layer using pathological cells from patients and could lead to more representative pharmacological study of this layer. Moreover, this scaffold will facilitate the clinical translation of the model from bench to bedside.