Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-16T21:18:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_InibiçãoEsforçoReprodutivo.pdf: 3315413 bytes, checksum: bdd4f2348d303819ca1d0fc8847a06a8 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-26T11:49:23Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_InibiçãoEsforçoReprodutivo.pdf: 3315413 bytes, checksum: bdd4f2348d303819ca1d0fc8847a06a8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T11:49:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 22190 bytes, checksum: 19e8a2b57ef43c09f4d7071d2153c97d (MD5) DISSERTAÇÃO_InibiçãoEsforçoReprodutivo.pdf: 3315413 bytes, checksum: bdd4f2348d303819ca1d0fc8847a06a8 (MD5) Previous issue date: 2014 / SKN-1, fator de transcrição de C. elegans, ortólogo a Nrf1/2/3 em mamíferos, promove resistência contra o estresse oxidativo e longevidade ao ativar enzimas de detoxificação de Fase II e proteínas antioxidantes. Além disso, SKN-1 também contribui para a homeostase proteica, ativando genes relacionados à degradação ou enovelamento de proteínas em resposta à inibição de fatores de iniciação e elongação da tradução de proteínas. Análises conduzidas em animais transgênicos que expressam repetições anormais de poliglutamina (PoliQ), fundidas a uma proteína fluorescente amarela (YFP), demonstraram que o knockdown de skn-1 aumenta a formação de agregados PoliQ em células musculares do C. elegans, enquanto diminui a agregação em células intestinais. Há também um aumento progressivo de agregados PoliQ de acordo com a idade do animal. No entanto, o número de agregados nas células intestinais diminui em animais adultos de 8 dias, idade que caracteriza o fim do período reprodutivo do animal. Nesse trabalho, nós buscamos caracterizar a correlação entre o esforço reprodutivo e de SKN-1 com a homeostase de proteínas. Para investigar as possíveis interações do esforço reprodutivo no padrão de agregação de proteínas, animais com expressão PoliQ direcionada para o intestino foram tratados com 5-fluoro-2’-deoxiuridina (FUdR), uma droga que induz esterilidade parental. Também analisamos a expressão de genes relacionados à degradação proteica e a atividade proteassômica em animais knockdown (RNAi) contra skn-1. Nós observamos que todas as linhagens transgênicas tratadas com FUdR mostraram uma redução significativa no número de agregados PoliQ em todas as idades analisadas. A análise dos dados de expressão gênica de animais no estádio larval L4 demonstra que genes que codificam para subunidades proteassômicas e para a fumarilacetoacetase tiveram sua expressão significativamente reduzida em animais skn-1(RNAi). Além disso, a atividade proteassômica da quimiotripsina, medida in vitro através da utilização de um peptídeo fluorescente de animais skn-1(RNAi) também se mostrou reduzida no estádio L4. Além disso, nós investigamos os efeitos da inibição de duas das principas vias de degradação proteica – proteassomal e lisossomal - na formação de agregados PoliQ em animais que expressam 82 repetições poliglutamínicas nas células intestinais, adultos de 8 dias, tratados com skn-1(RNAi). Nós verificamos que tanto a inibição proteassômica por MG-132 quanto a inibição lisossômica por cloroquina fez com que o número de agregados PoliQ aumentasse em relação aos grupos não tratados. O knockdown simultâneo de skn-1 e daf-16, uma outra via que participa na remoção de agregados proteicos aumentou o número de agregados no intestino dos animais. Estes dados sugerem que a inibição da reprodução e de skn-1 é capaz de diminuir a taxa de formação de agregados proteicos no intestino do C. elegans. __________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: is also a progressive increase of polyQ aggregates according to the age of the animal. However, the number of aggregates decrease in the intestine of 8 day-old adult animals, an age which the animal reaches the end of its reproductive period. In this work, decided to further investigate the correlation between the reproductive effort and SKN-1 with protein homeostasis. To investigate possible interactions between reproduction and protein degradation, animals with polyglutamine expression in the intestine were treated with 5-fluoro-2’-deoxyuridin (FUdR), a drug that induces parental sterility. We also assessed the expression of genes related to protein degradation and the proteasomal activity in skn-1 knockdown animals. We observed that all transgenic lines treated with FUdR showed a significant reduction in the number of PolyQ aggregates in all analyzed ages. The analysis of gene expression data of animals in the L4 larval stage shows that genes related to proteasomal subunits and fumarilacetoacetasis had their expressions significantly reduced in skn-1(RNAi) animals. Besides that, the proteasomal activity, measured in vitro, was also decreased in skn-1(RNAi) animals in the L4 stage. We also investigated the effects of the inhibition of two major pathways of protein degradation – proteasome and lysosome – in the aggregation pattern of 8 day-old animals that express 82 polyQ repeats in the intestine treated with skn-1(RNAi). We observed that both the proteasome and lysosome inhibition increased the number of polyQ aggregates, when compared to control animals. These data suggest that the inhibition of both the reproduction and skn-1 can decrease the polyQ aggregation ratio in the intestine of C. elegans.

Orientador: Milton Ruiz Alves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-07-25T03:55:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Holzchuh_Nilo_D.pdf: 22618534 bytes, checksum: d3f6976da50d6a0325448c884a00600d (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: O objetivo desta presente pesquisa foi avaliar os efeitos do uso tópico da mitomicina C a 0,02%, no epitélio íntegro da córnea de coelhos, sob o ponto de vista clínico, histopatológico e imuno-histoquímico. A mitomicina C (olhos esquerdo) e água destilada (olhos direito, controle) foram instiladas, 4 vezes ao dia, por 14 dias, nos olhos de 28 coelhos, em superfície ocular íntegra. A superfície ocular foi avaliada por exames biomicroscópicos seriados, durante os dias de instilação da droga. Os animais foram sacrificados no 15°, 50° e 100° dia de experimento. O exame histopatológico do epitélio corneano foi complementado por análise morfométrica, que pelo método de contagens de pontos, estudou área do epitélio, número de núcleos, relação núcleo-citoplasma, área da célula epitelial, área do núcleo e área do citoplasma, na região do limbo e central da córnea. O exame imuno-histoquímico do epitélio corneano foi realizado pelo emprego dos anticorpos monoclonais (AE1 e AE5) que reagem com as citoceratinas do epitélio da córnea. O uso de mitomicina C desencadeou discreta hiperemia conjuntival após o terceiro dia de instilação, desaparecendo 7 dias após a suspensão da droga. Não apresentou outro sinal clínico detectável na biomicroscopia. Não desencadeou alterações histopatológicas no epitélio corneano, observando-se a continuidade do epitélio, as células epiteliais se apresentaram dispostas de maneira ordenada, com número de camadas obedecendo a maturação normal e ausência de atipia celular. A análise morfométrica determinou alterações significativas em diferentes estruturas do epitélio, na região do limbo e central da córnea, principalmente nas áreas estimadas do epitélio, do citoplasma e do número de núcleos, verificando-se uma hipertrofia da célula epitelial, redução da relação núcleo-citoplasma e diminuição do número de núcleos. Estes valores voltaram próximos ao nível controle no 100° dia de avaliação. O uso da mitomicina C a 0,02%, não influenciou no padrão de diferenciação da célula epitelial da córnea. Os resultados desta investigação demonstraram baixo potencial tóxico do uso da mitomicina C, em superfície ocular íntegra de coelhos, nessa dosagem e concentração / Abstract: This study was performed to evaluate the effects of mitomycin C eye drops (0,2mg/ml) on the corneal epithelium of rabbits. It was investigated the changes in clinical examination, histopathologic and immunohistochemical analysis. Mitomycin C and distilled water (controls) were instilled 4 times daily for 14 consecutive days in the eyes with intact ocular surface. The ocular surface was evaluated by slit-lamp examination, during the days of the drug instillation. The animals in the 15th, 50th and 100th day of the experiment were sacrificed. The histopathologic analysis of the corneal epithelium was complemented by morphometry. It was studied the epithelium area, number of nuclei, number of round nuclei, nucleus-cytoplasm relation, epithelial cells area (nucleus and cytoplasm). The immunohistochemical studies used monoclonal antibodies to cytokeratins (AE1 and AE5). During the use of mitomycin C eye drops mild conjunctival hyperemia was detected. It disappeared 7 days after the drug suspension. There was no other clinical sign by slit-lamp examination. It didn't detect histopathologic alterations in the corneal epithelium, it was considered the epithelium continuity, maturation and atypical cells presence. The morphometric analysis was performed by point counting under light microscopy. It showed variations characterized by alteration of the epithelium area, the nucleus area and cytoplasm area, increase of the epithelial cell, alteration of the nucleus-cytoplasm relation and decrease of the nuclei number. The use of mitomycin C 0,02%, it didn't influence in the differentiation pattern of the cornea epithelial cell. The results of this investigation, in this study conditions, showed that mitomycin C 0,02%, instilled 4 times daily for 14 consecutive days, it was showed low toxic potential in intact ocular surface / Doutorado / Doutor em Ciências Médicas