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Développement d'une méthode de préconcentration de phosphopeptides sur phase monolithique en puce

Ayed, Ichraf 27 September 2012 (has links) (PDF)
La phosphorylation de protéines est un régulateur clé de voies de signalisation cellulaire. Elle est impliquée dans la plupart des événements cellulaires et contrôle les processus biologiques tels que la prolifération, la différenciation et l'expression des gènes. Une phosphorylation anormale de protéines peut être observée dans diverses maladies comme certains cancers ou maladies neurodégénératives. Ces protéines constituent donc des biomarqueurs potentiels pour le développement d'outils de diagnostic. Cependant les phosphoprotéines peuvent être présentes à faibles concentrations dans les liquides biologiques et des techniques d'enrichissement sélectif des protéines phosphorylées doivent être développées en amont des analyses. L'une des approches les plus courantes est basée sur la chromatographie d'affinité de type IMAC. Le but de ce travail de thèse était de développer un microsystème contenant un monolithe en tant que support solide d'extraction pour réaliser une préconcentration sélective de phosphopeptides par IMAC. La polymérisation par UV et la caractérisation (perméabilité, porosité et surface spécifique) d'un monolithe à base de phosphate de méthacrylate d'éthylène glycol dans des capillaires de silice ont été d'abord réalisées. Puis, nous avons tenté d'optimiser les différentes étapes de l'IMAC (immobilisation du métal, chargement de l'échantillon, lavage et élution). Une immobilisation efficace de zirconium sur le monolithe phosphaté a été démontrée par des mesures de FEO dans un capillaire et a été par la suite confirmée par la rétention d'un phosphopeptide modèle. Nous avons démontré que le monolithe phosphaté était également un support d'échange de cations vis-à-vis de peptides fortement basiques. Les protocoles de chargement et d'élution ont également été étudiés, mais nécessitent encore d'être améliorés. La transposition de l'enrichissement de phosphopeptides par IMAC sur un système miniaturisé a ensuite été envisagée. Nous avons choisi deux matériaux pour la puce : le PDMS, qui est un polymère attractif pour son faible coût, sa facilité de microfabrication, ses excellentes propriétés en termes de biocompatibilité ainsi que ses nombreuses possibilités d'intégration (enrichissement, séparation, détection) et le verre plus communément employé pour développer des microsystèmes analytiques et possédant une bonne transparence aux UV. Toutefois, le PDMS présente deux inconvénients majeurs: son absorption élevée et sa perméabilité importante à l'oxygène qui inhibe la polymérisation radicalaire. A l'exception de quelques tentatives, ce matériau n'a jamais été employé avec succès comme support pour la polymérisation d'un monolithe. Afin de pouvoir surmonter ces problèmes, nous avons étudié plusieurs stratégies de traitement de surface du PDMS tels que le traitement par plasma d'oxygène ou encore le revêtement au borosilicate. Enfin, nous avons démontré que notre module d'IMAC fonctionnait correctement dans un microsystème en verre. Ce module miniaturisé devrait à l'avenir s'intégrer dans un microsystème d'analyse dédié au diagnostic de la maladie d'Alzheimer.

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