Orientador: Jorg Kobarg / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T01:48:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lanza_DanielCarlosFerreira_D.pdf: 39179290 bytes, checksum: cbd84a5b7ba74e985bc1fc48595debd6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A proteína FEZ1 foi caracterizada inicialmente como um ortólogo da proteína UNC76 de C. elegans, responsável pelo desenvolvimento e fasciculação neuronal nesse verme. Estudos subsequentes demonstraram sua atuação em processos de desenvolvimento neuronal, polarização celular, mecanismos de transporte associado à kinesinas e transporte de vesículas e mitocôndrias. Outros trabalhos demonstraram que a superexpressão de FEZ1 interfere no ciclo de vida de alguns tipos de vírus como HIV e JCV. FEZ1 é capaz de interagir com mais de 51 proteínas diferentes, e participa em muitos processos celulares. Observamos que FEZ1 apresenta ausência de estrutura molecular rígida, sendo pertencente à classe das natively unfolded proteins, e é capaz de formar dímeros em solução. Essa observação condiz com sua extrema capacidade de interagir com muitas proteínas diferentes. A capacidade de FEZ1 interagir com outras proteínas é influenciada pela fosforilação da sua região C-terminal por diferentes isoformas de PKC. FEZ1 interage e colocaliza com NEK1 e com CLASP2 em células de mamífero, em uma região candidata ao centrossomo. Essas interações são dependentes da região coiled-coil presente na parte C-terminal de FEZ1, e ocorrem em regiões coiled-coil de CLASP2 e NEK1. A interação com CLASP2 é rompida quando FEZ1 é fosforilada por PKC. A superexpressão de FEZ1 causa o fenótipo flower like observado em células de alguns tipos de leucemia. Nós observamos que FEZ1 interage e colocaliza com a e ?-tubulinas e que a formação desse fenótipo em células HEK293 ocorre devido a uma alteração na organização dos microtúbulos causada pelo excesso de FEZ1. A formação do fenótipo flower like é influenciada por ativação das vias de PKC e PI3K. Os dados obtidos durante o nosso trabalho indicam que FEZ1 é uma proteína intrinsecamente desenovelada, que atua em processos celulares associados ao citoesqueleto e centrossomo em conjunto com NEK1 e CLASP2, e que defeitos em sua regulação, possivelmente pelas vias de PKC ou PI3K, causam alteração da organização dos microtúbulos originando núcleos flower like. / Abstract: FEZ1 was identified first as a orthologue of C elegans UNC-76 protein, that plays functions related to neuronal development in this worm. Subsequent studies, shows FEZ1 functions in neuronal development process, cell polarization, transport mechanisms associated to kinesins and vesicular and mitochondrial transports. Other works showed that FEZ1 superexpression interfere in the life cycle of some viral types such as HIV and JCV. FEZ1 is able to interact with more than 51 different proteins and participates in several cellular processes. We observed that FEZ1 has a mobile molecular structure, is a member of the natively unfolded protein class, and can form dimers in solution. This observation is in agreement with its capacity to interact with a large number of different proteins. The capacity of FEZ1 to interact with other proteins is influenced by different PKC isoforms phosphorylation in its C-terminal region. FEZ1 interacts and co-localizes with NEK1 and CLASP2 in a centrossomal candidate region of mammalian cells. These interactions are dependent of a coiled coil inside the C-terminal region of FEZ1, and occur in dependence of coiled coil regions of NEK1 and CLASP2. The interaction between FEZ1 and CLASP2 is abolished after FEZ1 phosphorylation by PKC. The FEZ1 overexpression causes the flower like phenotype observed in cells of some leukemias. We observed that FEZ1 interacts and co-localizes with _ and _-tubulins and that the phenotype formation in HEK293 cells is mediated by an atypical organization of microtubule spindles, caused by overexpression of FEZ1. The flower like phenotype formation is influenced by activation of PKC and PI3K pathways. The data generated by our work indicate that FEZ1 is an intrinsically unfolded protein, that works in cellular processes associated to the cytoskeleton in conjunct with NEK1 and CLASP2, and that defects in its regulation, maybe via the PKC or PI3K pathways, causes alterations in microtubule organization and formation of the "flower like" nuclei. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5215_1.pdf: 1381913 bytes, checksum: 3a78f7ed849513c01bc3e4ced1760801 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O ácido úsnico é um metabólito de líquen que apresenta uma grande variedade de atividades biológicas, dentre as quais, citotoxidade frente a células oriundas de tumores malignos humanos. Apesar da existência de revisões recentes sobre a atividade citotóxica do ácido úsnico, o mecanismo de ação desta droga ainda não foi completamente elucidado. Não existe na literatura referência ao envolvimento do gene supressor de tumor p53 com os efeitos do ácido úsnico. Na sua forma normal, a proteína p53 atua em resposta a diferentes estresses celulares levando à transcrição de genes que induzem a retenção do ciclo celular ou apoptose. Entre as formas de atuação do p53 está a repressão de genes que codificam proteínas associadas à polimerização e estabilização de microtúbulos. Estas funções são perdidas quando ocorrem mutações em sua via metabólica, o que acontece em mais de 50% dos tumores cancerosos humanos. O objetivo deste trabalho foi investigar se o mecanismo da ação anticancerígena do ácido úsnico envolve a ativação da via metabólica p53. Para estudos da sensibilidade de linhagens cancerígenas ao ácido úsnico, foram realizados ensaios pelo método colorimétrico do MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide], utilizando-se várias concentrações do fármaco (1 a 60 μM) por 72h, frente às seguintes linhagens de células malignas humanas: MCF7(câncer de mama, positiva para receptores de estrogênio, p53 normal), MDA-MB-231(câncer de mama, negativa para receptores de estrogênio, p53 inativo), H1299 (câncer de pulmão, nula para p53). Para determinar o envolvimento do p53 na ação citotóxica do ácido úsnico, os níveis das proteínas p53 e p21 (um inibidor de quinases dependentes de ciclinas cuja expressão é controlada pelo p53) em células MCF7 tratadas com 29 μM de ácido úsnico por 24h foram determinados utilizando-se ensaios western blot com o anticorpo monoclonal DO-12 (específico para p53) e WAF1 (específico para p21). Para verificar se a ação anticancerígena do ácido úsnico resulta em dano ao DNA celular, a fosforilação da SER15 do p53 (um marcador para danos em DNA) foi investigada, após tratamento de células MCF7 com 29 μM de ácido úsnico por 24h. Nestes estudos, ensaios western blot foram realizados com o anticorpo policlonal FOSFO-SER15, específico para serina fosforilada. Para verificar se o aumento nos níveis da proteína p53 detectados após o tratamento com ácido úsnico eram acompanhados por um aumento em sua atividade transcricional, foram executados ensaios com ß-Gal. Nesta metodologia utilizaram-se fibroblastos T22 de camundongos, portadores do plasmídeo RGDFos-LacZ (contendo o resíduo de 36 pb do sítio de ligação para o p53), tratados com diferentes concentrações de ácido úsnico. Para a investigação dos efeitos do ácido úsnico na formação e estabilização de microtúbulos, células MCF7 foram tratadas com 29 μM de ácido úsnico por 24h, fixadas em metanol e tratadas com anticorpo monoclonal anti-ß-tubulina. O ácido úsnico mostrou atividade citotóxica frente às várias linhagens celulares oriundas de tumores malignos humanos, promovendo elevação nos níveis das proteínas p53 e p21. Entretanto, este aumento não foi acompanhado de incremento na atividade transcricional nem da fosforilação da SER15 do p53. Também não foram detectadas modificações na formação dos microtúbulos. As propriedades anticancerígenas do ácido úsnico como agente não genotóxico que atua de uma forma independente do p53 fazem dele um candidato em potencial para novas terapias de câncer