Elektrocheminiai matavimai atlikti kambario temperatūroje, trijų elektrodų celėje, kuri matavimų metu buvo laikyta tamsoje (FMS jautrus šviesai). Darbiniu elektrodu panaudotas sukurtas iš mielių ląstelių biojutiklis, pagalbiniu Pt – elektrodas ir sidabro chloridinis – kaip palyginamasis elektrodas. Potenciodinaminiu bei potenciostatiniu metodais ištirti įvairių modifikacijų jutikliai. Gauti duomenis fiksuojami kompiuteriu programoje BAS Epsilon EC-2000-XP ( Ver.1,50,69_XP) ir analizuojami. Parinkome labiausiai tinkantį jutiklio modifikacijos būdą L-pieno rūgšties nustatymui ir įvertinome įvairių veiksnių įtaką oksidacinių srovių stipriui bei rezultatų stabilumui. Ištyrėme biojutiklio veikimą natūralioje aplinkoje. Kaip natūralius L-pieno rūgšties šaltinius panaudojome tokius pieno produktus, kaip jogurtas ir kefyras. Tyrimų metu nustatyta, kad optimaliausios sąlygos biologinio jutiklio veikimui yra: Econst.0 V, sausos mielių ląstelės iš suspensijos adsorbuotos ant jutiklio pavir��iaus, 0,2 mmol/l FMS tirpalas fosfatiniame buferyje, pH7,2. Darbo privalumas yra tas, kad jutiklių kūrimui panaudotas pigus fermento flavocitochromo b2 šaltinis – mielių ląstelės. Trūkumas – stiprus triukšmingumas, kas padidina jutiklio nustatymo ribas ( jutiklis tampa jautrus kitiems substratams) ir ilgas laikas, kol pasiekiamas stabilus rezultatas. / Electrochemical measurements were performed in a three-electrode cell arranged with a magnetic stirrer. Carbon paste electrode served as a working electrode. Platinum wire and Ag/ AgCl, 3 NaCl were, respectively, counter and reference electrodes. All measurements were performed with BAS-Epsilon Bioanalytical system. This work presents investigation of carbon paste electrodes modified with commercially available yeasts as amperometric biosensors for lactic acid using a mediator phenazine methosulphate (PMS). Sensitivity to lactic acid was tested using various configurations of the electrodes (yeast layer on the top of the electrode, yeast in the bulk carbon paste, PMS in solution or in the bulk carbon paste). The optimal operational conditions of the electrodes were: an operating potential 0.0 V, solution pH 7.2, concentration of phenazine methosulphate in solution 0.2 mmol/l, and yeast layer on the top of the electrode. The suitability of yeast-modified electrodes for determination of L-lactic acid in milk and dairy products such as kefir and yoghurt was also tested. The advantages of the electrodes were the simple preparation from the cheap source of the enzyme flavocytochrome b2. The disadvantages of the electrodes were long time to achieve reproducible results, high noise level, thus, high detection limit and sensitivity to other metabolites.

Mielių (Saccharomyces cerevisiae) taikymas biologiniuose jutikliuose ar biokatalizėje ribojamas jų ląstelės sienelės struktūros, kuri apsunkina reikiamų medžiagų transportą. Todėl darbo tikslas – ištirti mielių ląstelių mechaninių savybių ir plazminės membranos bei sienelės pralaidumo pakitimus, veikiant mielių ląsteles cheminėmis medžiagomis bei mikro- ir nanosekundžių trukmės didelės galios impulsais naudojant atominių jėgų mikroskopą bei tetrafenilfosfonio katijonų elektrocheminę analizę. Nustatyta, kad ditiotreitolis (DTT) keisdamas mielių sienelių pralaidumą, pakeičia mielių ląstelių mechanines savybes. Esant didelėms deformacijoms mielių ląstelių tamprumo modulis (Young‘o) padidėjo nuo 1,00 ± 0,04 MPa nepaveiktoms iki 2,14 ± 0,1 MPa DTT paveiktoms mielėms. Tiriant impulsinio elektrinio lauko (IEL) poveikį mielių sienelės pralaidumui, impulso trukmių nuo mikrosekundžių iki nanosekundžių diapazone stebima tiesinė TPP+ absorbcijos greičio priklausomybė nuo impulso energijos. Nustatyta, kad veikiat mieles 60 ns trukmės impulsais ląstelių pralaidumas TPP+ molekulėms, nepažeidžiant mielų gyvybingumo, padidėjo iki 65 kartų lyginant su nepaveiktomis elektriniu lauku mielių ląstelėmis, t.y. 3,5 karto daugiau negu mieles paveikus 150 μs impulsais. Tyrimų rezultatai rodo, kad IEL galima didinti visos ląstelės biologinių jutiklių spartą ir atrankumą. / The application of yeast (Saccharomyces cerevisiae) in the biosensors or in the biocatalysis is limited due to the structure of their cell walls, which complicates the transport of necessary materials. The aim of this work was to investigate the mechanical properties of the yeast cells and the changes of permeability of cell plasma membrane and cell wall, after the impact of chemical compounds on the cell wall permeability and after their exposure of pulsed electric field (PEF) in the range from microsecond till nanosecond pulse duration. For analysis the atomic force microscopy and the electrochemical detection of tetraphenylphosphonium ions were used. Dithiothreitol (DTT) modifies the yeast cell wall permeability changing the mechanical properties of the cells and for high indentations Young modulus increasing from 1.00 ± 0.04 MPa for intact cells to 2.14 ± 0.1 MPa for DTT treated ones. The linear relation between TPP+ absorption rate and pulse energy was determined after investigations of PEF effect to the yeast cell permeability in the range of pulse duration from microseconds to nanoseconds. The obtained 65 time increase of yeast cell wall permeability to TPP+ molecules after the exposure of 60 ns PEF, which does not affect the cell viability, comparing with the intact yeast cells. Such permeability increment was 3.5 times higher in comparison to the yeast cells exposure to 150 µs duration PEF. The finding can be useful for the enhancement of selectivity and response of... [to full text]

The application of yeast (Saccharomyces cerevisiae) in the biosensors or in the biocatalysis is limited due to the structure of their cell walls, which complicates the transport of necessary materials. The aim of this work was to investigate the mechanical properties of the yeast cells and the changes of permeability of cell plasma membrane and cell wall, after the impact of chemical compounds on the cell wall permeability and after their exposure of pulsed electric field (PEF) in the range from microsecond till nanosecond pulse duration. For analysis the atomic force microscopy and the electrochemical detection of tetraphenylphosphonium ions were used. Dithiothreitol (DTT) modifies the yeast cell wall permeability changing the mechanical properties of the cells and for high indentations Young modulus increasing from 1.00 ± 0.04 MPa for intact cells to 2.14 ± 0.1 MPa for DTT treated ones. The linear relation between TPP+ absorption rate and pulse energy was determined after investigations of PEF effect to the yeast cell permeability in the range of pulse duration from microseconds to nanoseconds. The obtained 65 time increase of yeast cell wall permeability to TPP+ molecules after the exposure of 60 ns PEF, which does not affect the cell viability, comparing with the intact yeast cells. Such permeability increment was 3.5 times higher in comparison to the yeast cells exposure to 150 µs duration PEF. The finding can be useful for the enhancement of selectivity and response of... [to full text] / Mielių (Saccharomyces cerevisiae) taikymas biologiniuose jutikliuose ar biokatalizėje ribojamas jų ląstelės sienelės struktūros, kuri apsunkina reikiamų medžiagų transportą. Todėl darbo tikslas – ištirti mielių ląstelių mechaninių savybių ir plazminės membranos bei sienelės pralaidumo pakitimus, veikiant mielių ląsteles cheminėmis medžiagomis bei mikro- ir nanosekundžių trukmės didelės galios impulsais naudojant atominių jėgų mikroskopą bei tetrafenilfosfonio katijonų elektrocheminę analizę. Nustatyta, kad ditiotreitolis (DTT) keisdamas mielių sienelių pralaidumą, pakeičia mielių ląstelių mechanines savybes. Esant didelėms deformacijoms mielių ląstelių tamprumo modulis (Young‘o) padidėjo nuo 1,00 ± 0,04 MPa nepaveiktoms iki 2,14 ± 0,1 MPa DTT paveiktoms mielėms. Tiriant impulsinio elektrinio lauko (IEL) poveikį mielių sienelės pralaidumui, impulso trukmių nuo mikrosekundžių iki nanosekundžių diapazone stebima tiesinė TPP+ absorbcijos greičio priklausomybė nuo impulso energijos. Nustatyta, kad veikiat mieles 60 ns trukmės impulsais ląstelių pralaidumas TPP+ molekulėms, nepažeidžiant mielų gyvybingumo, padidėjo iki 65 kartų lyginant su nepaveiktomis elektriniu lauku mielių ląstelėmis, t.y. 3,5 karto daugiau negu mieles paveikus 150 μs impulsais. Tyrimų rezultatai rodo, kad IEL galima didinti visos ląstelės biologinių jutiklių spartą ir atrankumą.

The aims of the study were to determine the reasons for unsuccessful expression of measles virus hemaglutinin (MeH) in the yeast cells and to generate a stable yeast strains with integrated genes of protein secretory pathway of human cells and to examine influence of coded human proteins on MeH maturation. For the firs time, overexpression of MeH in yeast S. cerevisiae and P. pastoris was described. It was demonstrated that mechanisms of cotranslational translocation into the endoplasmic reticulum (ER) and protein maturation in the ER of yeast cells are not adapted to deal with for such complex virus glycoproteins. Proteomic analysis revealed, that overexpression of human virus surface protein precursors induces cytosolic unfolded protein response (UPR-cyto) in the yeast S. cerevisiae. A key feature of this response is the formation of extremely large aggregates involving macromolecular structures of eEF1A. Efficient mammalian like cotranslational translocation pathway was attempted to reconstitute in yeast cells by transferring human SRP, Sec61 complexes and TRAM1 protein. Human chaperones BiP, clanexin, calreticulin, ERp57 and PDI were transferred to the yeast cells to create suitable environment for maturation of MeH in the ER. Even though yeast strains, able to produce biologically active MeH protein, were not generated during this study, results show, that humanization of yeast secretory pathway, designed for producing active virus glycoproteins, is possible. / Baigiamojo darbo tikslai – nustatyti neefektyvios žmogaus virusų glikobaltymų raiškos mielėse priežastis ir sukurti mielių kamienus su integruotais žmogaus ląstelių sekrecinio kelio genais bei ištirti jų įtaką glikobaltymų sintezei ir brendimui mielėse. Darbo eigoje pirmą kartą buvo aprašytos tymų viruso hemagliutinino (TVH) sintezės galimybės mielėse Saccharomyces cerevisiae ir Pichia pastoris. Parodyta, kad mielių ko-transliacinio baltymų perkėlimo į endoplazminį tinklą (ET) ir ET baltymų sulankstymo mechanizmai nėra pritaikyti sudėtingų virusinių baltymų brendimui, todėl klasikinės mielių rūšys ir standartiniai rekombinantinių baltymų raiškos ir gryninimo protokolai nėra tinkami diagnostikai ir vakcinų kūrimui reikalingo TVH baltymo gavimui. Proteominė S. cerevisiae ląstelių, sintetinančių TVH baltymą, analizė leido nustatyti kad, TVH sintezė mielėse sukelia neseniai literatūroje aprašytą citoplazminį nesusivyniojusių baltymų atsaką (UPR-cyto). Pagrindinis šiame darbe aprašyto atsako į stresą požymis yra ypatingai didelių baltymų agregatų, kurių šerdį sudaro TVH ir mielių eEF1A baltymai, susidarymas. Žmogaus tipo ko-transliacinį baltymų pernešimą į ET mielių ląstelėse bandyta atkurti perkeliant žmogaus SRP, Sec61 kompleksų ir TRAM1 baltymus, o siekiant sukurti tinkamas TVH baltymo brendimui sąlygas, mielių ląstelių ET buvo sintetinami pagrindiniai žmogaus ląstelių ET šaperonai – BiP, kalretikulinas, kalneksinas, PDI ir ERp57. Nors šiame darbe nepavyko sukurti mielių... [toliau žr. visą tekstą]

Baigiamojo darbo tikslai – nustatyti neefektyvios žmogaus virusų glikobaltymų raiškos mielėse priežastis ir sukurti mielių kamienus su integruotais žmogaus ląstelių sekrecinio kelio genais bei ištirti jų įtaką glikobaltymų sintezei ir brendimui mielėse. Darbo eigoje pirmą kartą buvo aprašytos tymų viruso hemagliutinino (TVH) sintezės galimybės mielėse Saccharomyces cerevisiae ir Pichia pastoris. Parodyta, kad mielių ko-transliacinio baltymų perkėlimo į endoplazminį tinklą (ET) ir ET baltymų sulankstymo mechanizmai nėra pritaikyti sudėtingų virusinių baltymų brendimui, todėl klasikinės mielių rūšys ir standartiniai rekombinantinių baltymų raiškos ir gryninimo protokolai nėra tinkami diagnostikai ir vakcinų kūrimui reikalingo TVH baltymo gavimui. Proteominė S. cerevisiae ląstelių, sintetinančių TVH baltymą, analizė leido nustatyti kad, TVH sintezė mielėse sukelia neseniai literatūroje aprašytą citoplazminį nesusivyniojusių baltymų atsaką (UPR-cyto). Pagrindinis šiame darbe aprašyto atsako į stresą požymis yra ypatingai didelių baltymų agregatų, kurių šerdį sudaro TVH ir mielių eEF1A baltymai, susidarymas. Žmogaus tipo ko-transliacinį baltymų pernešimą į ET mielių ląstelėse bandyta atkurti perkeliant žmogaus SRP, Sec61 kompleksų ir TRAM1 baltymus, o siekiant sukurti tinkamas TVH baltymo brendimui sąlygas, mielių ląstelių ET buvo sintetinami pagrindiniai žmogaus ląstelių ET šaperonai – BiP, kalretikulinas, kalneksinas, PDI ir ERp57. Nors šiame darbe nepavyko sukurti mielių... [toliau žr. visą tekstą] / The aims of the study were to determine the reasons for unsuccessful expression of measles virus hemaglutinin (MeH) in the yeast cells and to generate a stable yeast strains with integrated genes of protein secretory pathway of human cells and to examine influence of coded human proteins on MeH maturation. For the firs time, overexpression of MeH in yeast S. cerevisiae and P. pastoris was described. It was demonstrated that mechanisms of cotranslational translocation into the endoplasmic reticulum (ER) and protein maturation in the ER of yeast cells are not adapted to deal with for such complex virus glycoproteins. Proteomic analysis revealed, that overexpression of human virus surface protein precursors induces cytosolic unfolded protein response (UPR-cyto) in the yeast S. cerevisiae. A key feature of this response is the formation of extremely large aggregates involving macromolecular structures of eEF1A. Efficient mammalian like cotranslational translocation pathway was attempted to reconstitute in yeast cells by transferring human SRP, Sec61 complexes and TRAM1 protein. Human chaperones BiP, clanexin, calreticulin, ERp57 and PDI were transferred to the yeast cells to create suitable environment for maturation of MeH in the ER. Even though yeast strains, able to produce biologically active MeH protein, were not generated during this study, results show, that humanization of yeast secretory pathway, designed for producing active virus glycoproteins, is possible.