Introduction: Methamphetamine is a drug frequently abused by drug-addicted pregnant women and also one of the mostcommonly used drugs in the CzechRepublic. This drug passes easily through a placental barrier into the fetus. Thus it can negatively affect not only the mother but also the prenatal development of her offspring. Objectives: In the framework of the grant project GA CR: 14-03708S, the long-term effects of prenatal exposure to methamphetamine were detected. It was determined whether the prenatal methamphetamine exposure affects the generation of offspring of exposed females at the level of gene expression of genes in specific regions of the brain, striatum, hippocampus and prefrontal cortex. Methods: In the selected parts of the brain, which were removed from the rat, the microarray hybridization and the real-time PCR to express changes in expression of selected genes were performed. Results: Statistical analysis of microarray hybridization did not show the significantly altered gene expression in tested genes significantly. Only boundary values for 13 genes were measured, which were further tested by real-time PCR.After a statistic evaluation of real-time PCR, the significantly altered expression was found in 2 genes. The significantly changed expression of DRD3 and TACR3 genes was found...

Introduction: Methamphetamine is a drug frequently taken by drug-addicted pregnant women and happens to be one of the most commonly used drugs in the Czech Republic. This drug passes easily through a placental barrier into the fetus. Thus it can negatively affect not only the mother but also the prenatal development of her offspring. Objectives: This research aims to provide a general screening of gene expression in selected regions of the F1 generation of the brain prenatally affected by methamphetamine, to verify whether exposure to methamphetamine affects the generation of offspring of exposed females at the level of gene expression in selected regions of the brain, and to valuate possible changes in gene expression. Methods: In selected parts of the brain, collected from a rat, the microarray hybridization and the real-time PCR were set to evaluate express changes in the expression of selected genes. Results: Statistical analysis of the microarray hybridization did not show a significantly altered gene expression in the tested genes. Only boundary values for 13 genes were measured, which were further tested by the real-time PCR. After a statistic evaluation of the real-time PCR, the significantly altered expression was found in 2 genes. The notably changed expression of DRD3 and TACR3 genes...

Die humorale Immunantwort eines Organismus auf ein Pathogen äußert sich in einer Veränderung des Antikörperrepertoires. Eine quantitative Untersuchung dieses Prozesses erfordert aufgrund der enormen Komplexität des Immunsystems, die Verwendung von Hochdurchsatztechniken, wie Peptid-Mikroarrays. Bisher gibt es nur wenige Studien, die die Verlässlichkeit von Mikroarray-Bindungsmessungen untersuchen. In dieser Arbeit werden Bewertungskriterien für die Qualität von Antikörper-Peptid-Bindungsstudien unter Verwendung der Peptid-Mikroarraytechnologie herausgearbeitet, mit dem Ziel, diese Hochdurchsatzmethode für qualitative und quantitative Antikörper-Peptid-Bindungsmessungen zu optimieren. Anhand eines Modellsystems, das aus dem monoklonalen anti-p24 (HIV-1) Antikörper CB4-1 und 26 verschiedenen Peptiden, die mit unterschiedlicher Affinität an CB4-1 binden, besteht, werden systematisch die Bindungsdissoziationskonstanten der jeweiligen Antikörper-Peptid-Komplexe mit den durch Peptid-Mikroarray-Bindungsmessungen erhaltenen Signalintensitäten verglichen. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit die Messung von Serumantikörperbindungsprofilen gegenüber Zufallspeptidbibliotheken als Methode der serologischen Diagnostik verwendet. Anhand dreier Beispieldatensätze wird die serologische Diagnose von Infektionskrankheiten, Autoimmunkrankheiten und von Krebs mittels Zufallspeptid-Mikroarrays demonstriert. Mithilfe von Merkmalsselektion werden Peptide selektiert, die besonders geeignet sind, um zwischen gesunden und kranken Individuen zu unterscheiden. Besondere Bedeutung wird der Untersuchung der Robustheit der Methode gegenüber schwankenden experimentellen Bedingungen beigemessen. Die vorliegende Arbeit gibt Aufschluss über vorhandene Probleme der Mikroarray-Technologie, stellt Lösungsansätze vor und arbeitet bedeutende Weiterentwicklungen auf dem Weg hin zu einer minimal-invasiven serologischen Diagnostik heraus, die kein a priori Wissen über Antigene voraussetzt. / The humoral immune response to a pathogen is associated with specific changes in the antibody repertoire. Because of the enormous complexity of the immune system, a quantitative determination of this process requires high-throughput measuring tools, such as the peptide microarray technology. There are only few reports that determine the technological reliability of peptide microarray studies. By using a model system, composed of the anti-p24 (HIV-1) monoclonal antibody CB4-1 and an array of 26 different peptides for which the CB4-1 binding affinity has independently been measured, the dissociation constants of antibody-peptide complexes are systematically compared with obtained signal intensities. The assignment of serum-antibody binding profiles using random peptide microarrays for the purpose of serological diagnostics constitutes a major part of this work. By means of three sample data sets, the ability of random peptide microarrays to serve as method of serological diagnosing infectious diseases, autoimmune diseases and cancer is demonstrated. By means of feature selection, the peptides that are exceptionally appropriate to discriminate between the investigated groups are identified. This study attaches special importance to the reliability and robustness of extracted microarray data. This thesis indicates present problems of the peptide microarray technology and presents further developments on the way to minimal-invasive serological diagnostics that do not require any a priori knowledge about antigens, and thus about the investigated diseases.

In vielen humanen Neoplasien findet sich eine erhöhte Aktivität des Raf-Mek-Erk-Signaltransduktionsweges. Zunächst wurde davon ausgegangen, dass diese erhöhte Aktivität hauptsächlich durch die Ras-Onkogene hervorgerufen wird. Doch mittlerweile konnten auch Mutationen der Raf Gene in humanen Neoplasien nachgewiesen werden. Gegen Raf und Mek konnten eine Anzahl von Enzyminhibitoren entwickelt werden. Der Nachteil vieler dieser Inhibitoren ist, dass sie nicht zwischen den einzelnen Kinaseisoformen unterscheiden können. In dieser Arbeit ist es nun das erste Mal gelungen, jede Komponente des Raf-Mek-Erk-Signaltransduktionsweges einzeln mittels RNA Interferenz effizient zu inhibieren. Dabei konnte die Rolle der verschiedenen Isoformen in der Proliferation, Morphologie und Genex-pression von transformierten Zellen definiert werden. In den NIH3T3-pEJ Zellen konnte A-Raf erstmals eine antiapoptotische Rolle zugewiesen werden. Diese Hemmung der Apoptose läuft möglicherweise über einen Mek2-abhängigen Weg und ist an die Mitochondrien gekoppelt. Für die beiden Mek Kinasen konnten unter-schiedliche Funktionen in der Signalweiterleitung gezeigt werden. Mek2 spielt die Hauptrolle in der Aktivierung der beiden Substratkinasen Erk1 und Erk2. Der Verlust der Mek1 Isoform wird dagegen möglicherweise durch eine erhöhte Expression von Mek2 kompensiert und wirkt sich nicht so stark auf die Phosphorylierung von Erk1/2 aus. Durch die Verwendung von Erk1 und Erk2 spezifischen siRNAs konnte eine Trennung zwischen der Proliferationsre-gulation und der Kontrolle der morphologischen Transformation herausgearbeitet werden. Durch die Verwendung von Mikroarrays ist es gelungen, beiden Phänotypen ein Genexpres-sionsprofil zuzuordnen. Neben Unterschieden zwischen den verschiedenen Kinaseisoformen konnten neue, potentielle Feedbacks beschrieben werden. / In many human neoplasia an increased activity of the RAF/MEK/ERK- signaling pathway is found. First it was assumed that this raised activity is caused primarily by the RAS onco-genes. However, meanwhile mutations in the RAF genes could be also proved in human neo-plasia. A number of enzyme inhibitors have been developed against the RAF and MEK pro-teins. The disadvantage of many of these inhibitors is that they cannot distinguish between the different kinase isoforms. In this work it has succeeded the first time to inhibit every compo-nent of the RAF/MEK/ERK- signaling pathway individually by means of interference RNA. Beside this, the role of the different isoforms in the proliferation, morphology and genetic profile of transformed cells could be defined. For the first time A-Raf could be assigned an anti-apoptotic role in NIH3T3-pEJ cells. This inhibition of the apoptosis possibly runs through a Mek2-dependent way and is coupled to the mitochondria. For both Mek kinases different functions could be shown in the downstream signaling. Mek2 plays the leading role in the activation of both downstream kinases Erk1 and Erk2. The loss of the Mek1 isoform expression is possibly compensated through an increased expression of Mek2 and does not affect the phosphorylation of Erk1 / 2 so strongly. A discri-mination between the regulation of proliferation and the control of the morphological trans-formation could be worked out by the use of Erk1 and Erk2 specific siRNAs. By the use of micorarray an expression profile of both phenotypes has assigned. Beside differences between the different kinases new, potential feedback pathways could be described.