Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Les mécanismes moléculaires impliqués dans la fusion membranaire ont été amplement étudiés au cours des trente dernières années. Notre compréhension actuelle de ce phénomène est principalement basée sur des résultats obtenus par (1) le développement de modèles physiques décrivant la fusion des membranes biologiques, (2) l’étude mécanistique et structurale des protéines de fusion membranaire des virus à enveloppe et (3) l’étude des évènements de fusion intracellulaire médiés par les protéines SNARES dans les cellules eucaryotes. La découverte du complexe SNARE fut l’aboutissement de travaux interdisciplinaires qui ont exigés un large éventail de techniques tel que la génétique de la levure, l’électrophysiologie, la biologie moléculaire, la biochimie cellulaire, la biophysique expérimentale et l’imagerie. Tirant parti des paradigmes et techniques biophysiques qui ont émergés de ces études, nous avons examiné les fonctions et mécanismes de régulation des domaines « coiled-coil » dans les processus de fusion intracellulaire impliquant des protéines de la famille des Longin-SNAREs ou des Mitofusines, deux machineries protéiques de fusion dont le mode d’action exact reste encore peu clair. La conception exacte des mécanismes moléculaires de la fusion membranaire requiert la reconstitution in vitro des protéines de fusion dans un large spectre d’environnement membranaire avec des propriétés biophysiques définies et facilement modulables. Idéalement, ces systèmes membranaires devraient permettre à l’expérimentateur de contrôler la composition lipidique et protéique, ainsi que la topologie membranaire, afin de rendre compte de l’importante variabilité observée entre les différents compartiments de fusion cellulaire. La reconstitution dans des liposomes offre une incroyable flexibilité avec la possibilité de faire varier la plupart des paramètres clefs et de créer un environnement minimal dans lequel les facteurs solubles et/ou membranaires peuvent être ajoutés, seuls ou en combinaison, pour dévoiler leur rôle avec clarté. Nous avons mis au point des systèmes in vitro de reconstitution de protéines dans des plateformes membranaires artificielles pour nos deux systèmes d’études (les deux protéines Longin-SNAREs TI-VAMP et Sec 22b, ainsi que les domaines « coiled-coil » des Mitofusines) et nous avons réalisé des expériences biochimiques pour caractériser le mode d’action de ces protéines. L’objectif à long-terme de ce projet est de comparer les mécanismes moléculaires des machineries de fusion associés aux protéines SNAREs et Mitofusines, et ainsi de dévoiler des similitudes structurelles et fonctionnelles entre (1) leur protéines de fusion principales et (2) leur facteurs régulateurs. / The molecular mechanisms involved in membrane fusion have been extensively studied for the past thirty years. Our current understanding of this phenomenon is mainly based on results obtained by (i) the development of physical models describing the fusion of membranes, (ii) structural and mechanistic investigations on fusion proteins of enveloped viruses and (iii) studies of SNARE protein-mediated intracellular fusion events of eukaryotic cells. Discovery of the SNARE complex was the outcome of interdisciplinary works which involved a wide range of techniques including yeast genetics, electrophysiology, molecular biology, cell-free biochemistry, adhesion/fusion biophysics and imaging. Taking advantage of the paradigms and biophysical techniques that emerged from these studies, we investigated the function and regulation of coiled-coil domains in intracellular fusion processes involving Longin-SNAREs or Mitofusins, two fusion protein machineries whose exact mode of action still remains unclear. A comprehensive understanding of the molecular mechanisms of membrane fusion requires the in vitro reconstitution of fusion proteins into a wide variety of membrane environments with defined and tunable biophysical properties. Ideally, these membrane systems should allow the experimentalists to control the lipid and protein composition as well as the membrane topology, to account for the variability observed across cellular fusing compartments. Reconstitution into liposomes offers amazing flexibility with the capacity to vary most of these relevant parameters, and to create a minimal environment in which membrane and/or soluble factors can be added, one at a time or in combination, to reveal their role with clarity. We have set up the in vitro reconstitution of proteins into various artificial membrane platforms for both systems (the Longin-SNAREs TI-VAMP and Sec22b and the coiled-coil domains of Mitofusins) and performed biochemical assays to gain insight into how these proteins execute their functions. The long-term goal of this project is to compare the molecular mechanisms of SNARE and Mitofusin fusion machineries and thus reveal structural and functional similitudes between (i) their core fusion proteins, and (ii) their regulatory factors.

Les mitochondries sont des organites dynamiques dont la morphologie dépend de l’équilibre fusion/fission de leurs membranes. Ce processus essentiel à la survie cellulaire est nommé dynamique mitochondriale et sa dérégulation est associée à des troubles neurologiques. Cependant les mécanismes précis régissant la dynamique mitochondriale ne sont pas élucidés. Cette thèse porte sur la protéine Fzo1p, une grande GTPase de la superfamille des Dynamin-related-Protein. C’est un élément clé impliqué dans la fusion mitochondriale de la membrane externe de la levure. Sa structure et sa dynamique ont été étudiées par modélisation et simulations de dynamiques moléculaires tout-atome dans une bicouche lipidique solvatée. Le modèle structural obtenu tient compte de données expérimentales, de template structuraux, et de modèles ab initio du domaine transmembranaire de Fzo1p. Ce modèle a été validé expérimentalement par mutagenèse dirigée. Des permutations de charges ont confirmé des ponts salins à longue distance prédits dans le modèle. En outre, des mutations ont montré que les domaines coiled-coil de Fzo1p, contrairement à sa partie N-terminale, sont indispensables à sa fonction. L’ensemble des résultats expérimentaux et in silico met en évidence l’implication des domaines charnières dans le changement conformationnel de Fzo1p, ainsi que des résidus critiques affectant sa stabilité. Les précisions atomiques obtenues sur l’interaction de Fzo1p avec le GDP permet de formuler des hypothèses sur le mécanisme moléculaire de la catalyse du GTP pour la fusion membranaire; voire à la compréhension de la dynamique mitochondriale. / Mitochondria are dynamic organelles whose morphology is determined by fusion and fission of their membranes. This essential process is known as mitochondrial dynamics. Defects in mitochondrial dynamics are associated with neurological disorders making the investigation of physiological relevance. However, the precise sequence of events that lead mitochondrial dynamics are still not well characterised. Fzo1p, a large GTPase of the Dynamin-Related Proteins superfamily, is a key component in mitochondrial outer membrane fusion in yeast. During this PhD project I built a model of the protein Fzo1p. The structure and dynamics of the model was investigated through molecular modelling and all-atom molecular dynamics simulation in a fully hydrated lipid bilayer environment. The Fzo1p structural model integrates information from several template structures, experimental knowledge, as well as ab initio models of the transmembrane segments. The model is validated experimentally through directed mutagenesis, for instance charge-swap mutations confirm predicted long-distance salt bridges. A series of mutants indicate that coiled-coil domains are required for protein function at variance with its N-terminal region. Overall, the experimental and in silico approaches pinpoint the hinge domains involved in the putative conformational change and identifies critical residues affecting protein stability. Finally, key Fzo1p-GDP interactions provide insights about the molecular mechanism of membrane fusion catalysis. The model provides insight on atomic level and proposes a structure that will be instructional to understanding mitochondrial membrane fusion.