University, Diss., 2003--Kiel.

L‘objectif général du présent travail est la conception et le développement d‘un procédé original de culture de microalgues pour la production à grande échelle d‘huiles végétales à faible coût pour le marché du biodiesel. Une procédure multicritères de sélection de souches a d‘abord été mise au point afin d‘identifier la souche la plus susceptible de répondre favorablement aux paramètres du procédé préalablement déterminés. Cette procédure permet d‘inclure un grand nombre de critères et de considérer l‘importance relative de chacun de ces critères dans le pointage final accordé aux souches présélectionnées. Elle peut aussi être transposée à d‘autres contextes techniques et géographiques pour la sélection de souches destinées à diverses applications commerciales. Par la suite, l‘évaluation de la croissance et de la productivité lipidique de la souche sélectionnée a été effectuée au laboratoire, en mode nutritionnel mixotrophe, en présence d‘un important coproduit de l‘industrie laitière : le perméat de lactosérum. Le profil lipidique de la souche privilégiée, ainsi que sa capacité à hydrolyser le lactose, mise au jour pour la première fois, ont permis de démontrer le potentiel du procédé. Une méthode de suivi de consommation et d‘hydrolyse du lactose contenu dans le perméat de lactosérum a été développée par l‘intermédiaire de la technologie « spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier » couplée à une sonde externe avec « prisme à réflectance totale atténuée » (FT-IR/ATR) ainsi que la conception de modèles univariés et multivariés de type « régression des moindres carrés partiels (PLS) ». Ce type de modèle est plus précis que ceux déjà existants pour le suivi des sucres dissous par la méthode infrarouge car l'utilisation de régressions PLS permet de tenir compte du phénomène d‘additivité des spectres lorsque différents analytes pouvant absorber dans une même région du spectre sont présents dans la solution. De plus la méthode développée permet d‘envisager un suivi in situ de la consommation des sucres dans une culture de microorganismes à l‘échelle industrielle. La méthode des surfaces de réponse (RSM) a ensuite été utilisée afin d‘optimiser les conditions de pH et de densité de biomasse permettant de provoquer une accumulation de lipides à l‘intérieur de cultures de microalgues carencées en azote. Des modèles prédictifs ont été construits pour trois souches différentes et ce en modes nutritifs photoautotrophe et hétérotrophe. Ces travaux ont permis de démontrer l‘existence d‘une interaction entre ces deux facteurs. De plus, certaines différences spécifiques ont pu être mises en évidence en comparant les réponses entre les souches. À la lumière des résultats obtenus, certains paramètres d‘optimisation devront être considérés dans le cadre d‘un procédé de production de biomasse microalgale oléagineuse en deux phases; la première phase permettant d‘obtenir une productivité en biomasse maximale par une stratégie d‘augmentation du taux d‘hydrolyse du lactose; la seconde phase permettant une accumulation de lipides grâce à l‘imposition de conditions environnementales spécifiques. L‘augmentation des connaissances disponibles sur les microalgues ainsi que l‘amélioration et la standardisation des techniques de génie génétique nous permettront d‘aborder ces problématiques d‘un point de vue différent dans le futur.

La mixotrophie (la combinaison de la phototrophie et de l’hétérotrophie chez un même organisme) est une stratégie nutritive très courante chez les protistes planctoniques et son importance pour le fonctionnement des écosystèmes aquatiques a récemment été mise en évidence. La plupart des modèles biogéochimiques décrivant les écosystèmes aquatiques sont cependant encore basés sur le paradigme traditionnel d’une séparation stricte entre les protistes phototrophes (le phytoplancton) et les protistes hétérotrophes (le nano/microzooplancton).Dans la première partie, la thèse de doctorat propose deux modèles mathématiques mécanistiques permettant de décrire l’ensemble des stratégies nutritives déployées par les protistes planctoniques et pouvant être implémentés dans les modèles biogéochimiques. Le premier modèle décrit la capacité des protistes phototrophes à utiliser le phosphore organique dissous (DOP) lorsqu’ils sont limités en phosphate. Le second modèle décrit la mixotrophie stricte (phototrophie + phagotrophie) et permet de représenter les grands types de mixotrophies observés dans les milieux aquatiques: la mixotrophie constitutive et la mixotrophie non-constitutive.Dans la seconde partie du travail, les modèles mécanistiques sont implémentés dans le modèle MIRO (Lancelot et al. 2005) décrivant l’écosystème planctonique de la Baie Sud de la Mer du Nord, avec l’objectif d’étudier le rôle de la mixotrophie sur le fonctionnement d’un écosystème côtier eutrophisé.Les résultats montrent que lorsque les apports en nutriments par les rivières (Seine et Escaut) sont élevés et enrichis en N par rapport au P, le DOP devient une source importante en P pour les protistes phototrophes (surtout pour les colonies de l’espèce nuisible Phaeocystis) ;ne pas en tenir compte mènerait à une sous-estimation de la production primaire (jusqu’à 32%), de la sédimentation (jusqu’à 20%), de la reminéralisation en ammonium (jusqu’à 13%), des émissions de diméthylsulfure (DMS ;jusqu’à 97%), et de la capacité de l’écosystème à absorber le CO2 atmosphérique (avec, certaines années, un changement du rôle de l’écosystème, passant de source à puits de CO2). La production secondaire n’est, par contre, pas affectée par le DOP. Les mixotrophies constitutive et non-constitutive ont en général peu d’impact sur la production primaire, la production secondaire, la sédimentation, et la reminéralisation dans l’écosystème étudié. L’effet de la mixotrophie non-constitutive dépend cependant de la lumière disponible ;les printemps/été caractérisés par des intensités lumineuses élevées, la mixotrophie non-constitutive induit une augmentation de tous les processus étudiés, en particulier la production secondaire (jusqu’à 23%). / Doctorat en Sciences agronomiques et ingénierie biologique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les diatomées jouent un rôle primordial dans l'écologie de la planète, car elles sont responsables du 20-40% de la productivite mondial d’oxygène. Elles figurent parmi les organismes à fort potentiel biotechnologique pour des applications biocarburant. Les diatomées sont des organismes symbiotiques issus de la fusion d'un ancêtre hétérotrophe avec une ou plusieurs micro-algues photosynthétiques. Grace à cette histoire évolutive complexe, les diatomées ont un métabolisme très flexible. Comme la plus part des microalgues elles peuvent utiliser la photosynthèse pour leur croissance, mais aussi la mixotrophie, i.e. la capacité de croître en présence de lumière et d’une source de carbone réduit. L'utilisation simultanée de la photosynthèse et de la respiration peut augmenter la productivité de la biomasse des microalgues et réduire ainsi le coût de leur exploitation industrielle. Dans cette thèse j’ai étudié le mécanisme et les conséquences du métabolisme mixotrophique chez la diatomée modèle Phaeodactylum tricornutum. J’ai contribué à étudier le mécanisme moléculaire à la base des interactions énérgétiques entre chloroplaste et mitochondrie. Dans ce travail, nous avons démontré que le NADPH généré dans le chloroplaste est exporté vers la mitochondrie pour générer de l’ATP requis pour la fixation du CO2 dans le chloroplaste. Cette interaction entre les deux organites cellulaires augmente la croissance de diatomées, et suggère que l'utilisation simultanée d’une source de carbone et de l'énergie lumineuse (mixotrophie) devrait augmenter la productivité de la biomasse chez les diatomées. Cette hypothèse a été testée dans la deuxième partie de ma thèse, où j’ai etudié les conséquences de la mixotrophie sur le métabolisme de Phaeodactylum. Grace à une approche métabolomique, transcriptomique, lipidomiques et de physiologie j’ai contribué à éclaircir les principales voies métaboliques (métabolisme centrale, métabolisme des lipides, métabolisme des polymères de réserve) concerné la mixotrophie. Dans la dernière partie de ce travail j’ai optimisé les conditions de culture et la composition du milieu afin d’améliorer la productivité en croissance mixotrophe chez Phaeodactylum. Ce résultat a été validé dans des photobioréacteurs à l'échelle labo pour tester le potentiel de l'exploitation industrielle de cet organisme. / Diatoms are photosynthetic organisms with a strong influence on the global biogeochemistry. Moreover, they are extremely interesting as potential feedstocks for the production of high-value molecules and biofuel. They are endosymbiotic organisms originated by the fusion of a heterotrophic ancestor with one or more photosynthetic microalgae. This has led to an extremely flexible cell metabolism. Like other microalgae, diatoms are able to grow in the presence of both light and of a reduced carbon source. The simultaneous use of photosynthesis and respiration can increase biomass productivity and reduce the energy cost of the industrial exploitation of diatoms.In this project, the mechanism and the consequences of mixotrophic metabolism have been studied in the model diatom Phaeodactylum tricornutum. In the first part, I have studied the molecular mechanism governing the interactions between chloroplast and mitochondrion. We have demonstrated that the NADPH generated in the plastid is exported to the mitochondrion to generate additional ATP, which, once back to the plastid, is used for carbon fixation. Overall, this work shows that the interaction between these two organelles increases carbon fixation and growth in diatoms. We hence suggest that the simultaneous use of carbon and light energy sources (i.e. mixotrophy) should enhance biomass productivity in diatoms. This hypothesis has been tested in the second part of my thesis, where I focused on the consequences of mixotrophy on metabolism. By combining metabolomic, transcriptomic, lipidomic and physiology approaches, I have contributed to elucidate the main pathways targeted by mixotrophy (central carbon, lipid and storage carbon metabolism). In the last part of this work, I have worked on improving the culture conditions and medium composition to boost microalgal productivity by mixotrophy. These conditions have been scaled-up in lab scale photobioreactors, revealing the industrial exploitation potential of Phaeodactylum.

Les espèces protistes ont été traditionnellement classifiées comme des plantes ou des animaux en raison de l’absence ou présence des chloroplastes. L’état actuel de la connaissance indique qu’un grand nombre d’espèces protistes portent des chloroplastes mais que physiologiquement elles sont capables d’utiliser l’autotrophie (photosynthèse) ou l’hétérotrophie pour se nourrir. La combinaison de ces deux modes trophiques par une même cellule est nommée mixotrophie. Chez les protistes l’hétérotrophie peut s’effectuer soit par la consommation des particules par phagocytose, e.g. des proies bactériennes, ou bien par l’absorption des composants organiques dissouts, i.e. osmotrophie. La mixotrophie est de plus en plus décrit chez les protistes dans tous les habitats aquatiques. Les écologistes du plancton constatent la récurrence de la mixotrophie chez les formes traditionnelles « phyto»plancton et micro »zoo »plancton. Cependant, identifier et quantifier la mixotrophie reste toujours un défi méthodologique. Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la mixotrophie chez les espèces phytoplanctoniques marines, en particulier à leur nutrition phagotrophique de proies bactériennes. Nous avons testé des techniques modernes afin d’identifier la mixotrophie dans des cellules phytoplanctoniques. La technique cytogénétique d’hybridation in situ Card-FISH en utilisant de sondes d’ARN ribosomique 16S a été effectuée suivant des protocoles existant pour des bactéries et des protistes. Cette technique s’est avérée être un outil précieux pour visualiser des groupes phylogénétiques bactériens en association avec le phytoplancton à l’aide de la microscopie à épifluorescence, sans avoir besoin d'un isolement préalable des cellules ou des interférences avec l'association microbienne. Cependant, la méthode a échoué pour visualiser mixotrophie chez le phytoplancton car la sonde eubactérienne générale(EUB338) combine une large gamme d'espèces phytoplanctoniques, ce qui rend impossible de discriminer les signaux fluorescents provenant de tissus bactérienne ou phytoplanctonique. Le contexte de ces études est le phytoplancton et les bactéries hétérotrophes lesquels constituent des principaux concurrents pour les nutriments inorganiques dissouts. Dans le cas où la croissance bactérienne est limitée par le carbone, l'augmentation de la concentration de carbone organique dissous(DOC) renforce la croissance bactérienne et la consommation de nutriments dissous et ainsi affecte négativement la croissance du phytoplancton autotrophe. Cependant, les consommateurs de bactéries, i.e.phytoflagellés mixotrophes, peuvent être favorisés dans de telles situations car la hausse de DOC donne lieu à l'abondance plus élevé des proies bactériennes.En outre, nos résultats indiquent un potentiel effet positif de la température sur le mode de nutrition hétérotrophe de l’espèce, ainsi qu’une croissante contribution des espèces mixotrophes au sein des communautés de phytoplancton dans des conditions des hautes températures des eaux de surface de la mer. / Protist species were traditionally classified morphologically as either „plants“ or „animals“, based on the absence or presence of chloroplasts. State of science is that a high number of protist species carrychloroplasts but are nutritionally able to employ both autotrophy (photosynthesis) and heterotrophywithin a single cell. This combination of autotrophic and heterotrophic mode of nutrition within a single species is named mixotrophy. In protists, heterotrophy can be realized either by the uptake of food particles (e.g. bacterial prey) through phagocytosis or by the uptake of dissolved organic compounds (i.e.osmotrophy). Mixotrophy is globally and increasingly described in protists from all types of aquatic habitats. Plankton ecologists nowadays assess mixotrophy among the traditionally typified “phyto”plankton and mikro”zoo”plankton species as regularity. Nevertheless, detection and quantification of mixotrophy is still a methodological challenge. In this study, we focused on mixotrophy in marine phytoplankton species and put emphasis on its phagotrophic nutrition from heterotrophic bacterial prey. State of the art methodology was tested to visualize mixotrophy in single phytoplankton cells. Catalyzedreported deposition-fluorescence in situ hybridization (Card-FISH), using 16S ribosomal RNA probes,was employed based on existing protocols for bacteria and protists. The method proved to be a valuable tool to visualise bacterial phylogenetic groups in association with phytoplankton by epifluorescence microscopy without need for prior isolation of cells or interference with the microbial association.However, the method failed to visualize mixotrophy in phytoplankton since the general eubacterial probe(EUB338) hybridised a broad range of phytoplankton species making it impossible to discriminate fluorescent signals originating from bacterial or phytoplankton tissue. Background of these studies is phytoplankton and heterotrophic bacteria being major competitors for dissolved inorganic nutrients. In case that bacterial growth is carbon limited, increasing concentrations of degradable dissolved organic carbon (DOC) enhance bacterial growth and consumption of dissolved nutrients and there by negatively affect autotrophic phytoplankton growth. Bacteria consuming mixotrophic phytoflagellates, however, may gain in importance in such situations since DOC provokes higher bacterial prey supply.In addition, our results indicate a potential positive effect of temperature on O. minima´s heterotrophic nutrition mode, and indicate a potential increasing contribution of mixotrophic species to phytoplankton communities under increasing sea surface water temperatures.

Rampant increases in oil prices and detrimental effects of fossil fuels on the environment have been the main impetus for the development of environmentally friendly and sustainable energy sources. Amongst the many possibilities, microalgae have been proposed as a new alternative energy source to fossil fuels, as their growth is both sustainable and ecologically safe. By definition, microalgae are unicellular photosynthetic microorganisms containing chlorophyll a. These organisms are capable of producing large quantities of oils, surpassing that of traditional oil-seed crops, which can be transformed, through chemical processes, into biofuels such as biodiesel or bio-gasoline. Thus, recent research has gone into discovering high lipid producing algal strains, optimising growth media for increased lipid production and developing metabolic engineering to make microalgae a source of biofuel that is competitive to more traditional sources of biofuel and even to fossil fuel. In this context, the research reported here focused on using a mixotrophic growth mode as a way to increase lipid production for certain strains of microalgae. In addition, nitrogen starvation combined with mixotrophy was studied to analyse its effects on lipid production. Mixotrophy is the parallel usage of two trophic modes, in our case photoautotrophy and heterotrophy. Consequently, 12 algal strains were screened for mixotrophic growth, using glycerol as a carbon source. Glycerol is a waste product of the current biodiesel industry; it is a cheap and abundant carbon source present in many metabolic pathways. From this initial screening, several strains were chosen for subsequent experiments involving nitrogen starvation. Nitrogen starvation has been shown to induce lipid accumulation. The results obtained show that a mixotrophic growth mode, using glycerol as a carbon source, enhances lipid production for certain strains. Moreover, lipid enhancement was shown for nitrogen starvation combined with mixotrophic growth mode. This was dependant on time spent under nitrogen starvation and on initial concentrations of the nitrogen source. / L’augmentation effrénée des prix du pétrole et les effets néfastes des carburants fossiles sur l’environnement sont les raisons principales pour la recherche et le développement de nouvelles sources d’énergie durables et écologiques. Parmi de grands nombres de possibilités, les micro-algues sont proposées comme une source alternative d’énergie aux carburants fossiles, étant donné que leur croissance est durable et écologique. Les micro-algues sont des organismes unicellulaires et photosynthétiques détenant comme pigment essentiel la chlorophylle a. Ces organismes sont capables de produire de grandes quantités d’huile, parfois excédant celles des cultures agricoles traditionnellement utilisées pour les biocarburants. Ces huiles peuvent être transformées en biocarburants, tel que le biodiésel et le bio-essence, par certains procédés chimiques. La recherche actuelle est basée sur la découverte de souches d’algues capables de produire un haut rendement de lipides, l’optimisation de milieux de croissance pour accroitre la production lipidique et la manipulation génomique afin de créer des souches de micro-algues dont les rendements peuvent rivaliser avec l’agriculture tradionnelle et même les carburants fossiles. Dans ce contexte, notre recherche se concentre sur l’utilisation d’un mode de croissance mixotrophe afin d’induire une augmentation dans la production lipidique de certaines souches de micro-algues. De plus, des études sur la carence en azote combinée à la croissance mixotrophe ont été entreprises pour évaluer l’effet de ces paramètres sur la production lipidique. La mixotrophie est un mode de croissance qui utilise en parallèle deux modes trophiques différents, tel que l’hétérotrophie et l’autotrophie. De ce fait, 12 souches d’algues ont été examinées pour leur capacité à croitre dans un milieu mixotrophe. Le glycérol est un produit secondaire de l’industrie du biodiésel actuelle. Cette substance est à bas prix, abondante et peut être utilisé comme substrat dans plusieurs voies métaboliques. Du criblage initial, plusieurs souches ont été choisies pour des expériences subséquentes impliquant la carence en azote. La carence en azote à été démontrer comme un déclencheur de l’accumulation de lipide chez les micro-algues dans des recherches antérieures. Les résultats obtenus démontrent que la croissance mixotrophe permet d’augmenter la production de lipide chez certaines souches. De plus, la carence en azote combinée à la croissance mixotrophe a permis d’augmenter la production lipidique. Cependant, celle-ci dépendait du temps passer en carence et des concentrations initiales de source d’azote.

La production de microalgues en hétérotrophie présente plusieurs avantages pour la production de biocarburants par rapport à la production autotrophe, comme une productivité plus importante en termes de biomasse et de lipides. Cependant, le développement industriel de ce procédé est limité par les coûts de productions associés au substrat organique (i.e. glucose) et à ceux liés à la stérilisation des fermenteurs. Les effluents de fermentation sombre, composés principalement d’acétate et de butyrate, pourraient être utilisés comme milieux de culture peu onéreux pour la culture hétérotrophe ou mixotrophe de microalgues. Les objectifs de cette thèse étaient i) de mieux appréhender la croissance algale sur des mélanges variés d’acétate et de butyrate en fonction de la présence ou l’absence de lumière et de la température de croissance et ii) d’évaluer la faisabilité d’utiliser des effluents de fermentation non stérilisés pour soutenir la croissance de microalgues oléagineuses. Tout d’abord, un modèle basé sur des bilans de masse a été construit afin de caractériser la croissance hétérotrophe de Chlorella sorokiniana et Auxenochlorella protothecoides (taux de croissance et rendements) sur des mélanges d’acétate et de butyrate. Les résultats ont montré que le rapport acétate:butyrate et la concentration en butyrate étaient deux paramètres clés pour soutenir la croissance hétérotrophe. Puis, il a été démontré que la présence de lumière et l’utilisation d’une température suboptimale (30 °C) pour la croissance algale permettaient de réduire l’inhibition du butyrate en permettant une production de biomasse autotrophe ou en améliorant la croissance sur acétate. Enfin, il a été montré que les microalgues peuvent être compétitives sur l’acétate lors de la croissance sur des effluents bruts de fermentation sombre en présence de bactéries fermentaires, grâce à la croissance rapide des microalgues sur acétate (1.75 j-1) et à un changement drastique des conditions de culture peu favorables à la croissance des bactéries d’origine fermentaire. / Growing microalgae in heterotrophic mode present several advantages over autotrophic mode such as a higher productivity in terms of biomass and lipids for biofuels production. Nevertheless, this process is limited by the production cost associated with the organic substrate (i.e. glucose) and fermenters sterilization costs. Dark fermentation effluents, mainly composed of acetate and butyrate, could be used as a low-cost medium to grow microalgae heterotrophically or mixotrophically. The aims of this PhD were i) to optimize microalgae growth on various mixtures of fermentations metabolites using the presence or absence light and different cultivation temperatures and ii) to assess the feasibility of using unsterilized fermentation effluents. First, a model based on mass balance was built to characterize heterotrophic growth rates and yields when Chlorella sorokiniana and Auxenochlorella protothecoides were supplemented with different mixtures of acetate and butyrate. Results showed that the acetate:butyrate ratio and the butyrate concentration per se were two key parameters for promoting heterotrophic growth. Then, further studies showed that the presence of light and the use of suboptimal temperature (30 °C) could reduce the butyrate inhibition on growth by either triggering autotrophic production of biomass or enhancing growth on acetate. Finally, it was shown that microalgae could outcompete fermentation bacteria for acetate when growing on raw dark fermentation effluents, thanks to a fast algal growth on acetate (1.75 d-1) and a drastic change of culture conditions to the detrimental of bacterial growth.

La présente étude s’attache à étudier l’effet d’une source de carbone organique sélectionnée sur la croissance et la production de métabolites de la microalgue rouge Porphyridium marinum. Cette dernière s’est montrée incapable de se multiplier en hétérotrophie, en absence totale de lumière. Cependant, en condition mixotrophique la production de biomasse, lipides et de phycobiliprotéines par P. marinum a été améliorée en comparaison avec la condition autotrophique. Les teneurs en exopolysaccharides ont été presque similaires dans les deux conditions. Dans le but de valoriser ces métabolites, l’effet antioxydant, antibactérien, antibiofilm et anticancéreux ont été testés. L’exopolysaccharide de P. marinum ainsi que ses dérivés de faible poids moléculaire (EPS-2P et EPS-5P) ont tous présenté des activités antibactériennes et antibiofilm à différentes concentrations. Cependant l’EPS-2P et l’EPS-5P ont été jugés plus efficaces pour l’activité anticancéreuse contre les cellules de cancer de sein. D’autre part, la production du pigment majoritaire des microalgues rouges, la B-phycoerythrine (B-PE), a été optimisée moyennant des plans d’expériences adaptés. Une teneur de 40 mg/g MS a été obtenue en faisant varier la concentration en NaNO3, K2HPO4 et solution métallique ainsi que l’intensité lumineuse. Après purification, la molécule optimisée a montré une activité antioxydante en termes de piégeage des radicaux libres DPPH, chélation et réduction des ions de fer et inhibition de la décoloration du β-carotène. Nos données suggèrent alors que les métabolites produits par la microalgue rouge P. marinum peuvent être potentiellement utilisé dans plusieurs applications à savoir cosmétiques et pharmaceutiques. / The present study investigates the effect of a selected organic carbon source on the growth and production of metabolites of the red microalga Porphyridium marinum. The latter has been unable to multiply in heterotrophy, in total absence of light. However, in mixotrophic condition the productions of biomass, lipids and phycobiliproteins by P. marinum have been improved in comparison with the autotrophic condition. The contents of exopolysaccharide were almost similar under both conditions. In order to valorize these metabolites, the antioxidant, antibacterial, antibiofilm and anticancer effect were tested. The exopolysaccharide of P. marinum as well as its low molecular weight derivatives (EPS-2P and EPS-5P) have all exhibited antibacterial and antibiofilm activities at different concentrations. However, EPS-2P and EPS-5P were found to be more effective for anti-cancer activity against breast cancer cells. On the other hand, the production of the majority pigment of red microalgae, B-phycoerythrin (B-PE), has been optimized by means of adapted experimental plans. A content of 40 mg/g DW was obtained by varying the concentration of NaNO3, K2HPO4 and metal solution as well as the light intensity. After purification, the optimized molecule showed antioxidant activity in terms of free radical scavenging DPPH, chelation and reduction of iron ions and β-carotene bleachinginhibition. Our data suggest that the metabolites produced by the red microalga P. marinum may be potentially used in several applications namely cosmetic and pharmaceutical.