As distrofias musculares constituem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A fraqueza muscular se manifesta quanto existe um desequilíbrio entre os ciclos de degeneração e regeneração, com subseqüente substituição por tecido conjuntivo e adiposo das fibras musculares eliminadas. Diversos fatores estão implicados nestes processos, e as vias de atuação de cada um deles ainda não são totalmente conhecidas. Os mais importantes marcadores da via miogênica são os fatores Myf5, MyoD, Myf6 e miogenina. Os marcadores da degeneração, por sua vez, são o TGFβ-1, citocina inflamatória provavelmente envolvida no processo de fibrose do músculo distrófico, e o aumento da expressão do próprio colágeno, componente da matriz extracelular. O objetivo do presente projeto consistiu em estudar os fatores relacionados com as vias de degeneração e regeneração em modelos murinos distróficos com diferentes defeitos nas proteínas musculares, para elucidação dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos, visando terapias. Para tal, foram estabelecidas três abordagens: 1-) Estudar o potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais de medulas óssea, nos modelos Lama2dy-2J/J (deficiente para a proteína α2-laminina) e Largemyd (defeito de glicosilação); 2-) Estudar a expressão relativa dos genes envolvidos nas vias de degeneração e regeneração nos diferentes modelos murinos para distrofias musculares; 3-) Estudar o papel da distrofina e α2-laminina na organização do complexo distrofina-glicoproteínas associadas no músculo esquelético, através da produção de um camundongo duplo-mutante deficiente para estas duas proteínas. Na primeira abordagem, células-tronco mesenquimais de medula, expressando a proteína eGFP, foram injetadas por via sistêmica em camundongos Lama2dy-2J/J e Largemyd, mas não foram localizadas posteriormente no músculo dos animais testados. Testes complementares mostraram que células MSC e C2C12 expressando eGFP permanecem por curtos períodos de tempo no tecido injetado, sugerindo que são eliminadas do músculo distrófico em virtude da expressão permanente de eGFP. Análise funcional realizada nestes animais mostrou uma grande heterogeneidade de resposta nos diversos testes aplicados, compatível com a variabilidade clínica também observada em pacientes humanos. Na segunda abordagem, analisamos a expressão dos genes da cascata de degeneração e regeneração nos modelos distróficos mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J e Largemyd, e correlacionamos estes resultados com o padrão histopatológico de cada modelo. Os resultados observados sugerem que o gene TGFβ-1 é ativado pelo processo distrófico em qualquer grau de degeneração, enquanto a ativação da expressão do gene PCOL possivelmente ocorre nos estágios iniciais deste processo. Observou-se também que cada mecanismo patofisiológico atuou de forma diversa na ativação da regeneração, com diferenças na indução da proliferação das células-satélite, mas sem alterações no estimulo à diferenciação. Assim, a disfunção na população de células-satélite pode representar um mecanismo importante na patogênese das distrofias musculares. Na terceira abordagem, um modelo murino duplo-mutante para as proteínas distrofina e α2-laminina foi gerado a partir de cruzamentos das linhagens mdx e Lama2dy-2J/J, com a proporção mendeliana esperada, sendo, portanto, viável. O animal duplo-afetado está apresentando fraqueza muscular mais acentuada que os modelos parentais. Estudos complementares de proteínas musculares serão ainda realizados neste novo modelo para verificar a presença ou não das demais proteínas do DGC e sua relação com o padrão de degeneração/regeneração muscular. / The muscular dystrophies are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscles. Muscle weakness is the consequence of an imbalance between successive cycles of degeneration and regeneration, with further replacement of the degraded muscle fibers by adipose and connective tissues. Several factors are involved these processes and the respective functional pathways are still not well known. Myf5, MyoD, Myf6 and myogenin are important factors responsible for the myogenesis and regeneration in the muscle. One important marker for the degeneration is TGF-1, which is an inflammatory cytokine with a possible role in the stimulation of fibrosis in the dystrophic muscle through the activation of genes related to the expression of collagen. The main objective of this project was to study the factors involved in the degeneration and regeneration pathways, in mice models for muscular dystrophies, carrying different defects in muscle proteins, to better understand the involved pathophysiological mechanisms, aiming future therapies. This was done through three strategies: 1-) The study of the therapeutic potential of transplantation of bone marrow mesenchymal-eGFP transformed stem cells, in Lama2dy-2J/J (a2 laminin deficient mice) and Largemyd (mice with defect in the glycosilation of -DG) ; 2-) The analyses of the relative expression of genes involved in regeneration and degeneration, in different mice models for muscular dystrophies; 3-) The study of the roles of dystrophin and 2-laminin proteins in the organization of the dystrophin-glycoprotein complex in muscle sarcolemma through the generation of a new mouse model, double-mutant for these two proteins. In the first approach, bone marrow mesenchymal stem cells expressing eGFP protein were intravenously injected in Lama2dy-2J/J and Largemyd mice, but these cells were not localized in the muscle of the tested animals after 3 months of experiment. Complementary studies showed that MSC and C2C12 cells expressing eGFP, when directly injected in the muscle of these models, were retained for only a few days, suggesting a rejection against cells expressing eGFP in the dystrophic muscle. Functional analysis showed a high variability among the tested mice, which is similar to the significant clinical variability observed in human patients with muscular dystrophies. In the second approach we quantified the expression of genes involved in degeneration and regeneration pathways in the dystrophic models mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J and Largemyd, and correlated these data with muscle histopathological pattern of each model. The result suggests that TGFβ-1 gene is activated in the dystrophic process in all the stages of degeneration while the activation of the expression of the PCOL gene possibly occurs in earliest stages of this process. We also observed that each physiopathological mechanism acted differently in the activation of regeneration, with differences in the induction of proliferation of satellite cells, but with no alterations in stimulation to differentiation. Dysfunction of satellite cells can therefore be an important additional mechanism of pathogenesis in the dystrophic muscle. In the third approach we generated a new dystrophic mouse model, carrying two simultaneous deficiencies of the proteins dystrophin and 2-laminin, by crossing mdx and Lama2dy-2J/J strains. In the offspring, the proportion of affected double-mutant mice was within the expected mendelian proportion, showing therefore, the viability of these defects with life. Only 4 alive animals were obtained up to the present date, and they are being followed for clinical characterization. The phenotype of this double-mutant mouse is very severe, presenting significant weakness, starting earlier and progressing faster that the parental strains. When more affected animals will be available, additional protein studies will be done to verify the effect of these two deficiencies in the organization of the DGC complex and its effect on the cascades of muscle degeneration and regeneration.

As distrofias musculares formam um grupo amplo e heterogêneo de doenças genéticas, caracterizado basicamente pela degeneração e fraqueza muscular. Ao longo das últimas décadas muitos estudos vêm sendo realizados para a identificação dos genes causadores dessas doenças. Entretanto, apesar da identificação da mutação responsável pela grande maioria das formas descritas, os processos moleculares subjacentes ao defeito genético primário são muito complexos e ainda precisam ser melhor compreendidos. E a compreensão dos mecanismos de cada uma das formas é muito importante para o desenvolvimento adequado de terapias. A avaliação da expressão gênica global por microarranjos de DNA é uma ferramenta bastante poderosa, capaz de produzir uma grande quantidade de dados, delineando o panorama geral do estado do transcriptoma de um determinado tecido ou célula. Assim, os objetivos desse trabalho foram estudar os perfis de expressão do músculo de três linhagens de camundongos modelos de formas distintas de distrofia muscular (Dmdmdx, Largemyd-/- e Dmdmdx/Largemyd-/-) em diferentes fases da progressão da doença (21 dias, três meses e seis meses de idade), com o intuito de caracterizar o processo distrófico e como o perfil de expressão varia com a progressão da idade e a depender da mutação genética. Em cada um dos modelos e idades estudados identificamos um grande número de genes diferencialmente expressos (GDEs), refletindo a complexidade dessas doenças. A análise dos processos e vias biológicas nas quais esses genes estão envolvidos mostrou o forte envolvimento de componentes do sistema imunológico e inflamação, e também de genes relacionados com os processos de degeneração/regeneração e remodelamento da matriz extracelular. De modo geral, as funções biológicas alteradas são bem semelhantes entre as linhagens, sugerindo que apesar de as mutações serem em genes distintos, com funções diferentes, os processos moleculares que são afetados em decorrência dessas mutações são praticamente os mesmos. As maiores diferenças foram vistas na idade de 21 dias, especialmente na linhagem Dmdmdx que apresentou uma grande quantidade de GDEs, dos quais grande parte relacionada com a maior capacidade regenerativa dessa linhagem e, assim, são genes que podem explicar o porquê desses animais apresentarem um fenótipo benigno em relação aos pacientes humanos. A caracterização do modelo duplo-mutante Dmdmdx/Largemyd-/- mostrou que a junção das duas mutações não ocasiona alterações no transcriptoma distintas das obsevadas nas linhagens parentais, sendo que o perfil do duplo-mutante é mais próximo ao de seu parental Largemyd-/-, não apresentando a mesma capacidade regenerativa que o Dmdmdx / The muscular dystrophies form a large and heterogeneous group of genetic diseases, characterized mainly by progressive muscular degeneration and weakness. In the last decades, many studies have been carried on in order to identify the involved genes in these disorders. However, despite the identification of responsible mutations of the majority of the described forms, the underlying molecular processes to the primary mutation are very complex and are not fully understood. And to understand the mechanisms of each form is of major importance to the development of therapies. Global gene expression profiling by DNA microarrays is a powerful tool, able to yield a huge quantity of data, outlining the general landscape of the transcriptome of a given tissue or cell. In this sense, the objectives of this work were to study the expression profile of the muscles from three mice lineages, models for different forms of muscular dystrophy (Dmdmdx, Largemyd-/- and Dmdmdx/Largemyd-/-) in different phases of disease progression (21-day-old, three-month-old and six-month-old), in order to characterize the dystrophic process and how the expression profile changes according to aging and depending on the genetic mutation. In each model and age studied we identified a substantial number of differentially expressed genes (DEGs), reflecting the diseases\' complexity. The analysis of the biological processes and pathways in which these genes are implicated showed a strong involvement of immune system and inflammation components, and also genes related to degeneration/regeneration and extracellular matrix remodeling processes. Altogether, the altered biologic functions are very similar in lineages, suggesting that although mutations are in different genes, with diverse functions, the affected molecular processes due to these mutations are basically the same. The most notable differences were seen on 21-day-old, especially on Dmdmdx lineage that showed a great quantity of DEGs, many of which are related to the better regenerative capacity this lineage exhibits and, thus, they are genes that could explain why these animals manifest a mild phenotype in comparison to human patients. The characterization of the double mutant Dmdmdx/Largemyd-/- showed that the union of both mutations does not bring on alterations on the transcriptome different from those seen in the parental lineages, with the double mutant profile closer to its parental Largemyd-/-, not bearing the same regenerative capacity that Dmdmdx

As distrofias musculares constituem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A fraqueza muscular se manifesta quanto existe um desequilíbrio entre os ciclos de degeneração e regeneração, com subseqüente substituição por tecido conjuntivo e adiposo das fibras musculares eliminadas. Diversos fatores estão implicados nestes processos, e as vias de atuação de cada um deles ainda não são totalmente conhecidas. Os mais importantes marcadores da via miogênica são os fatores Myf5, MyoD, Myf6 e miogenina. Os marcadores da degeneração, por sua vez, são o TGFβ-1, citocina inflamatória provavelmente envolvida no processo de fibrose do músculo distrófico, e o aumento da expressão do próprio colágeno, componente da matriz extracelular. O objetivo do presente projeto consistiu em estudar os fatores relacionados com as vias de degeneração e regeneração em modelos murinos distróficos com diferentes defeitos nas proteínas musculares, para elucidação dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos, visando terapias. Para tal, foram estabelecidas três abordagens: 1-) Estudar o potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais de medulas óssea, nos modelos Lama2dy-2J/J (deficiente para a proteína α2-laminina) e Largemyd (defeito de glicosilação); 2-) Estudar a expressão relativa dos genes envolvidos nas vias de degeneração e regeneração nos diferentes modelos murinos para distrofias musculares; 3-) Estudar o papel da distrofina e α2-laminina na organização do complexo distrofina-glicoproteínas associadas no músculo esquelético, através da produção de um camundongo duplo-mutante deficiente para estas duas proteínas. Na primeira abordagem, células-tronco mesenquimais de medula, expressando a proteína eGFP, foram injetadas por via sistêmica em camundongos Lama2dy-2J/J e Largemyd, mas não foram localizadas posteriormente no músculo dos animais testados. Testes complementares mostraram que células MSC e C2C12 expressando eGFP permanecem por curtos períodos de tempo no tecido injetado, sugerindo que são eliminadas do músculo distrófico em virtude da expressão permanente de eGFP. Análise funcional realizada nestes animais mostrou uma grande heterogeneidade de resposta nos diversos testes aplicados, compatível com a variabilidade clínica também observada em pacientes humanos. Na segunda abordagem, analisamos a expressão dos genes da cascata de degeneração e regeneração nos modelos distróficos mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J e Largemyd, e correlacionamos estes resultados com o padrão histopatológico de cada modelo. Os resultados observados sugerem que o gene TGFβ-1 é ativado pelo processo distrófico em qualquer grau de degeneração, enquanto a ativação da expressão do gene PCOL possivelmente ocorre nos estágios iniciais deste processo. Observou-se também que cada mecanismo patofisiológico atuou de forma diversa na ativação da regeneração, com diferenças na indução da proliferação das células-satélite, mas sem alterações no estimulo à diferenciação. Assim, a disfunção na população de células-satélite pode representar um mecanismo importante na patogênese das distrofias musculares. Na terceira abordagem, um modelo murino duplo-mutante para as proteínas distrofina e α2-laminina foi gerado a partir de cruzamentos das linhagens mdx e Lama2dy-2J/J, com a proporção mendeliana esperada, sendo, portanto, viável. O animal duplo-afetado está apresentando fraqueza muscular mais acentuada que os modelos parentais. Estudos complementares de proteínas musculares serão ainda realizados neste novo modelo para verificar a presença ou não das demais proteínas do DGC e sua relação com o padrão de degeneração/regeneração muscular. / The muscular dystrophies are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscles. Muscle weakness is the consequence of an imbalance between successive cycles of degeneration and regeneration, with further replacement of the degraded muscle fibers by adipose and connective tissues. Several factors are involved these processes and the respective functional pathways are still not well known. Myf5, MyoD, Myf6 and myogenin are important factors responsible for the myogenesis and regeneration in the muscle. One important marker for the degeneration is TGF-1, which is an inflammatory cytokine with a possible role in the stimulation of fibrosis in the dystrophic muscle through the activation of genes related to the expression of collagen. The main objective of this project was to study the factors involved in the degeneration and regeneration pathways, in mice models for muscular dystrophies, carrying different defects in muscle proteins, to better understand the involved pathophysiological mechanisms, aiming future therapies. This was done through three strategies: 1-) The study of the therapeutic potential of transplantation of bone marrow mesenchymal-eGFP transformed stem cells, in Lama2dy-2J/J (a2 laminin deficient mice) and Largemyd (mice with defect in the glycosilation of -DG) ; 2-) The analyses of the relative expression of genes involved in regeneration and degeneration, in different mice models for muscular dystrophies; 3-) The study of the roles of dystrophin and 2-laminin proteins in the organization of the dystrophin-glycoprotein complex in muscle sarcolemma through the generation of a new mouse model, double-mutant for these two proteins. In the first approach, bone marrow mesenchymal stem cells expressing eGFP protein were intravenously injected in Lama2dy-2J/J and Largemyd mice, but these cells were not localized in the muscle of the tested animals after 3 months of experiment. Complementary studies showed that MSC and C2C12 cells expressing eGFP, when directly injected in the muscle of these models, were retained for only a few days, suggesting a rejection against cells expressing eGFP in the dystrophic muscle. Functional analysis showed a high variability among the tested mice, which is similar to the significant clinical variability observed in human patients with muscular dystrophies. In the second approach we quantified the expression of genes involved in degeneration and regeneration pathways in the dystrophic models mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J and Largemyd, and correlated these data with muscle histopathological pattern of each model. The result suggests that TGFβ-1 gene is activated in the dystrophic process in all the stages of degeneration while the activation of the expression of the PCOL gene possibly occurs in earliest stages of this process. We also observed that each physiopathological mechanism acted differently in the activation of regeneration, with differences in the induction of proliferation of satellite cells, but with no alterations in stimulation to differentiation. Dysfunction of satellite cells can therefore be an important additional mechanism of pathogenesis in the dystrophic muscle. In the third approach we generated a new dystrophic mouse model, carrying two simultaneous deficiencies of the proteins dystrophin and 2-laminin, by crossing mdx and Lama2dy-2J/J strains. In the offspring, the proportion of affected double-mutant mice was within the expected mendelian proportion, showing therefore, the viability of these defects with life. Only 4 alive animals were obtained up to the present date, and they are being followed for clinical characterization. The phenotype of this double-mutant mouse is very severe, presenting significant weakness, starting earlier and progressing faster that the parental strains. When more affected animals will be available, additional protein studies will be done to verify the effect of these two deficiencies in the organization of the DGC complex and its effect on the cascades of muscle degeneration and regeneration.

As distrofias musculares formam um grupo amplo e heterogêneo de doenças genéticas, caracterizado basicamente pela degeneração e fraqueza muscular. Ao longo das últimas décadas muitos estudos vêm sendo realizados para a identificação dos genes causadores dessas doenças. Entretanto, apesar da identificação da mutação responsável pela grande maioria das formas descritas, os processos moleculares subjacentes ao defeito genético primário são muito complexos e ainda precisam ser melhor compreendidos. E a compreensão dos mecanismos de cada uma das formas é muito importante para o desenvolvimento adequado de terapias. A avaliação da expressão gênica global por microarranjos de DNA é uma ferramenta bastante poderosa, capaz de produzir uma grande quantidade de dados, delineando o panorama geral do estado do transcriptoma de um determinado tecido ou célula. Assim, os objetivos desse trabalho foram estudar os perfis de expressão do músculo de três linhagens de camundongos modelos de formas distintas de distrofia muscular (Dmdmdx, Largemyd-/- e Dmdmdx/Largemyd-/-) em diferentes fases da progressão da doença (21 dias, três meses e seis meses de idade), com o intuito de caracterizar o processo distrófico e como o perfil de expressão varia com a progressão da idade e a depender da mutação genética. Em cada um dos modelos e idades estudados identificamos um grande número de genes diferencialmente expressos (GDEs), refletindo a complexidade dessas doenças. A análise dos processos e vias biológicas nas quais esses genes estão envolvidos mostrou o forte envolvimento de componentes do sistema imunológico e inflamação, e também de genes relacionados com os processos de degeneração/regeneração e remodelamento da matriz extracelular. De modo geral, as funções biológicas alteradas são bem semelhantes entre as linhagens, sugerindo que apesar de as mutações serem em genes distintos, com funções diferentes, os processos moleculares que são afetados em decorrência dessas mutações são praticamente os mesmos. As maiores diferenças foram vistas na idade de 21 dias, especialmente na linhagem Dmdmdx que apresentou uma grande quantidade de GDEs, dos quais grande parte relacionada com a maior capacidade regenerativa dessa linhagem e, assim, são genes que podem explicar o porquê desses animais apresentarem um fenótipo benigno em relação aos pacientes humanos. A caracterização do modelo duplo-mutante Dmdmdx/Largemyd-/- mostrou que a junção das duas mutações não ocasiona alterações no transcriptoma distintas das obsevadas nas linhagens parentais, sendo que o perfil do duplo-mutante é mais próximo ao de seu parental Largemyd-/-, não apresentando a mesma capacidade regenerativa que o Dmdmdx / The muscular dystrophies form a large and heterogeneous group of genetic diseases, characterized mainly by progressive muscular degeneration and weakness. In the last decades, many studies have been carried on in order to identify the involved genes in these disorders. However, despite the identification of responsible mutations of the majority of the described forms, the underlying molecular processes to the primary mutation are very complex and are not fully understood. And to understand the mechanisms of each form is of major importance to the development of therapies. Global gene expression profiling by DNA microarrays is a powerful tool, able to yield a huge quantity of data, outlining the general landscape of the transcriptome of a given tissue or cell. In this sense, the objectives of this work were to study the expression profile of the muscles from three mice lineages, models for different forms of muscular dystrophy (Dmdmdx, Largemyd-/- and Dmdmdx/Largemyd-/-) in different phases of disease progression (21-day-old, three-month-old and six-month-old), in order to characterize the dystrophic process and how the expression profile changes according to aging and depending on the genetic mutation. In each model and age studied we identified a substantial number of differentially expressed genes (DEGs), reflecting the diseases\' complexity. The analysis of the biological processes and pathways in which these genes are implicated showed a strong involvement of immune system and inflammation components, and also genes related to degeneration/regeneration and extracellular matrix remodeling processes. Altogether, the altered biologic functions are very similar in lineages, suggesting that although mutations are in different genes, with diverse functions, the affected molecular processes due to these mutations are basically the same. The most notable differences were seen on 21-day-old, especially on Dmdmdx lineage that showed a great quantity of DEGs, many of which are related to the better regenerative capacity this lineage exhibits and, thus, they are genes that could explain why these animals manifest a mild phenotype in comparison to human patients. The characterization of the double mutant Dmdmdx/Largemyd-/- showed that the union of both mutations does not bring on alterations on the transcriptome different from those seen in the parental lineages, with the double mutant profile closer to its parental Largemyd-/-, not bearing the same regenerative capacity that Dmdmdx