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The muscular dystrophies (MDs) are genetic disorders of muscle degeneration due to mutations in genes that encode a wide variety of proteins. Dysferlinopathy encompasses a large variety of neuromuscular diseases characterized by the absence of dysferlin in skeletal muscle and an autosomal recessive mode of inheritance. Dysferlinopathy can manifest as limb girdle muscular dystrophy type 2B (LGMD 2B), Miyoshi myopathy (MM) or distal myopathy with anterior tibial onset (DMAT). The first symptoms usually appear during the second or third decade of life as clumsiness when running, fatigue when walking long distances and difficulty in climbing stairs. Progression of the disease eventually leads to a loss of ambulation. A deficit in membrane-repair machinery in dysferlinopathy suggested a direct role for dysferlin in the Ca2+-dependent membrane-repair process. Recently, dysferlin has also been implicated in the process of chemotaxis. Evidence exists that free radical mediated injury contributes to the pathogenesis of muscle necrosis in the muscular dystrophies. The imbalance of free radical synthesis and antioxidant capacity has been suggested to contribute to the necrotic process. It is therefore imperative to explore the effect of antioxidant supplementation in the MDs. The present study followed a novel approach in investigating the cellular effects afforded by the supplementation of the SJL/J mouse model for dysferlinopathy with the antioxidants, Coenzyme Q10 (CoQ10) and resveratrol. The study aimed to determine, at cellular level, the histopathology and ultrastructural changes in the SJL/J mouse model following a 90 day trial with antioxidant supplementation. In addition to studying the morphology, the study paid attention to nonspecific parameters. The study mainly focused on the histopathology and ultrastructural alterations in the SJLL/J mouse. In addition the oxidative stress index of the affected quadriceps muscle was determined. The outcome provides evidence that increased oxidative stress levels are present in the SJL/J mouse. Antioxidant supplementation with CoQ10 at 120mg/kg/day or a resveratrol/CoQ10 combination supplementation at 40 and 60mg/kg/day, decreased the levels of oxidative stress and dystrophic markers at a cellular level. In addition, increased physical strength was observed. This thesis provides evidence to create a new platform for combination therapeutic strategies. / Thesis (PhD)--University of Pretoria, 2010. / Anatomy / unrestricted

As distrofias musculares são doenças genéticas causadas por mutações em diferentes genes caracterizadas por degeneração muscular, prejuízos locomotores e, geralmente, morte precoce. Dentre elas, a de Duchenne, causada por mutações no gene que codifica para a proteína distrofina, é a mais comum e grave, tendo os camundongos MDX como modelo experimental mais utilizado. O objetivo do presente estudo foi testar quatro abordagens terapêuticas potencias neste modelo animal, divididas em dois experimentos: 1. treinamento físico voluntário em roda de atividade e/ou drogas agonistas das proteínas AMPK e PPAR em dias alternados (AICAR: 100 mg.Kg-1.dia-1, ip; GW 1516: 5 mg.Kg-1.dia-1, gavagem); 2. células-tronco estromais humanas provenientes de lipoaspiração (um milhão a cada injeção intravenosa; uma injeção a cada 10 dias nos dois primeiros meses de tratamento e injeções mensais nos quatro meses subsequentes) e/ou suplementação com os aminoácidos alanina e glutamina (10 mg.kg-1.dia-1, injeção diária intraperitoneal). Em relação ao primeiro experimento, o principal achado foi que os animais submetidos ao treinamento físico associado às drogas apresentaram índices de função muscular superiores aos outros grupos. Já em relação ao segundo grupo de análises, foi observado que os animais submetidos à terapia celular apresentaram tempo de vida significativamente maior quando comparados aos animais não tratados e aos tratados com ambas as terapias. Tais resultados, nunca demonstrados previamente pela literatura científica, podem contribuir para o entendimento da fisiopatologia das distrofias musculares e para o avanço de potenciais abordagens terapêuticas. / Muscular dystrophies are genetic diseases caused by mutations in different genes. They are characterized by muscle degeneration, motor prejudices and, generally, early death. Among them, Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and severe form and it is caused by mutations in the dystrophin gene. The most widely used animal model of DMD is the MDX mouse. The aim of this study was to test four potential therapeutic approaches assigned in two experiments: 1. voluntary exercise training in activity road and/or AMPK and PPAR agonists drugs every other day in MDX mice (AICAR: 100 mg.Kg-1.day-1, IP; GW 1516: 5 mg.Kg-1.day-1, gavage); 2. Intravenous injection of stromal stem cells from human adipose tissue (106 cells every 10 days in the first two months and monthly injections in the following four months) and/or alanine and glutamine amino acids supplementation (10 mg.Kg-1.day-1, daily IP injections). In the first experiment we demonstrated that mdx mice submitted to exercise training associated to drugs presented improved muscle function when compared to the other groups. In the second experiment, on the other hand, it was observed that the animals submitted to cell therapy presented increased survival when compared to non injected animals and animals treated with both approaches. These results, here demonstrated for the first time, can contribute to understand the physiopathology of muscular dystrophies and may give insights for future therapeutic approaches

As distrofias musculares são doenças genéticas causadas por mutações em diferentes genes caracterizadas por degeneração muscular, prejuízos locomotores e, geralmente, morte precoce. Dentre elas, a de Duchenne, causada por mutações no gene que codifica para a proteína distrofina, é a mais comum e grave, tendo os camundongos MDX como modelo experimental mais utilizado. O objetivo do presente estudo foi testar quatro abordagens terapêuticas potencias neste modelo animal, divididas em dois experimentos: 1. treinamento físico voluntário em roda de atividade e/ou drogas agonistas das proteínas AMPK e PPAR em dias alternados (AICAR: 100 mg.Kg-1.dia-1, ip; GW 1516: 5 mg.Kg-1.dia-1, gavagem); 2. células-tronco estromais humanas provenientes de lipoaspiração (um milhão a cada injeção intravenosa; uma injeção a cada 10 dias nos dois primeiros meses de tratamento e injeções mensais nos quatro meses subsequentes) e/ou suplementação com os aminoácidos alanina e glutamina (10 mg.kg-1.dia-1, injeção diária intraperitoneal). Em relação ao primeiro experimento, o principal achado foi que os animais submetidos ao treinamento físico associado às drogas apresentaram índices de função muscular superiores aos outros grupos. Já em relação ao segundo grupo de análises, foi observado que os animais submetidos à terapia celular apresentaram tempo de vida significativamente maior quando comparados aos animais não tratados e aos tratados com ambas as terapias. Tais resultados, nunca demonstrados previamente pela literatura científica, podem contribuir para o entendimento da fisiopatologia das distrofias musculares e para o avanço de potenciais abordagens terapêuticas. / Muscular dystrophies are genetic diseases caused by mutations in different genes. They are characterized by muscle degeneration, motor prejudices and, generally, early death. Among them, Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and severe form and it is caused by mutations in the dystrophin gene. The most widely used animal model of DMD is the MDX mouse. The aim of this study was to test four potential therapeutic approaches assigned in two experiments: 1. voluntary exercise training in activity road and/or AMPK and PPAR agonists drugs every other day in MDX mice (AICAR: 100 mg.Kg-1.day-1, IP; GW 1516: 5 mg.Kg-1.day-1, gavage); 2. Intravenous injection of stromal stem cells from human adipose tissue (106 cells every 10 days in the first two months and monthly injections in the following four months) and/or alanine and glutamine amino acids supplementation (10 mg.Kg-1.day-1, daily IP injections). In the first experiment we demonstrated that mdx mice submitted to exercise training associated to drugs presented improved muscle function when compared to the other groups. In the second experiment, on the other hand, it was observed that the animals submitted to cell therapy presented increased survival when compared to non injected animals and animals treated with both approaches. These results, here demonstrated for the first time, can contribute to understand the physiopathology of muscular dystrophies and may give insights for future therapeutic approaches

Introdução: As distrofias musculares de cinturas (limb-girdle muscular dystrophies - LGMD) são causadas por mutações em uma grande variedade de genes que codificam proteínas musculares, podendo ser herdadas de forma autossômica dominante ou recessiva. O diagnóstico é feito tanto através de exame de biópsia muscular que mostra um padrão histológico distrófico ao lado de deficiência específica de proteínas musculares quanto por estudo genético. Em alguns subtipos de LGMD não é possível fazer o diagnóstico específico pela biópsia muscular, tais como na deficiência da calpaína-3 (CAPN3) e da proteína relacionada a fukutina (FKRP). Nestes casos, portanto, o exame molecular é de grande valor para a confirmação do diagnóstico. Objetivos: Analisar os genes CAPN3 e FKRP em pacientes com diagnóstico histológico de LGMD e verificar a expressão proteica da CAPN3 nesses pacientes, correlacionando com as mutações identificadas e com o quadro clínico e histológico dos mesmos. Resultados: Fizeram parte deste estudo 36 pacientes com LGMD provenientes do ambulatório de miopatias do HC-FMUSP em que a biópsia muscular não identificou deficiência de distrofina, disferlina, caveolina-3 e sarcoglicanas. Destes, nove (25%) foram diagnosticados com LGMD2A, seis (17%) com LGMD2I e em 21 (58%) não foi possível identificar o subtipo específico. Foram encontradas mutações patogênicas no gene CAPN3 em oito pacientes, sendo em homozigose em dois casos, heterozigose composta em cinco casos e em heterozigose em um caso. Em um caso o diagnóstico de LGMD2A foi realizado baseado apenas na análise da expressão da proteína CAPN3 no tecido muscular. Em seis pacientes foram identificadas mutações patogênicas no FKRP, sendo em homozigose em cinco casos e em heterozigose em um caso. A maioria dos pacientes com LGMD2I (cinco casos) apresentava a mutação c.826C > A. Foi observada ausência total ou parcial da expressão da CAPN3 em pacientes com LGMD2A. Conclusões: O presente estudo mostrou que mutações nos genes CAPN3 e FKRP são frequentes em pacientes com diagnóstico clínico e histológico de LGMD. A análise da expressão da CAPN3 se mostrou como uma importante ferramenta no diagnóstico da LGMD2A / Introduction: The Limb-Girdle Muscular Dystrophies (LGMD) are caused by mutations on a wide variety of genes that encode muscular proteins which can be inherited in dominant or recessive autosomal forms. The diagnosis is made either by genetic study or by muscle biopsy which shows a dystrophic histologic pattern with specific deficiency of muscular proteins. On some LGMD subtypes such as calpain-3 (CAPN3) and fukutin related protein (FKRP) deficiencies it is not possible to make a specific diagnosis by muscle biopsy. In these cases, the molecular exam is of great value to confirm the diagnosis. Objectives: Analyze the CAPN3 and FKRP genes in patients with histological diagnoses of LGMD, and verify the protein expression of CAPN3 on these patients correlating it with the identified mutations and their clinical and histological pattern. Results: Thirty-six patients with LGMD, where the muscular biopsy did not identify deficiency of dystrophin, dysferlin, caveolin-3 and sarcoglycans, from the Muscle Ambulatory of HC-FMUSP took part in this study. Of these, nine (25%) were diagnosed with LGMD2A, six (17%) with LGMD2I, and on 21 of them (58%), it was not possible to identify the specific subtype. Pathogenic mutations on CAPN3 were found in eight patients, being homozygous in two cases, compound heterozygous in five cases and heterozygous in one case. The diagnosis of LGMD2A in one patient was done based exclusively by CAPN3 protein analysis on the muscle tissue. Pathogenic mutations on FKRP were found in six patients, being homozygous in five cases and heterozygous in one case. Most of the patients with LGMD2I (five cases) presented the mutation c.826C > A. It was observed total or partial absence of the CAPN3 expression in patients with LGMD2A. Conclusions: The study showed that mutations on CAPN3 and FKRP are frequent in patients with clinical and histological diagnosis of LGMD. The CAPN3 expression analysis proved as an important tool in the LGMD2A diagnosis

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Recentemente, associaram-se defeitos do mecanismo de glicosilação da proteína α-DG com diversos tipos de distrofias musculares graves. Alterações nesse processo constituem, portanto um novo mecanismo patogenético nas doenças neuromusculares, abrindo novas possibilidades de estudo. Neste sentido, foram objetivos deste trabalho avaliar o perfil de expressão dos genes envolvidos na glicosilação da proteína α-DG em modelos murinos e em pacientes, e tentar relacionar com os diferentes processos distróficos. Verificamos que tanto camundongos normais como distróficos expressam os genes codificantes das glicosiltransferases na seguinte ordem: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, em todas as idades e em todas as linhagens estudadas, sugerindo um mecanismo constante de regulação gênica, independente do crescimento, envelhecimento ou processo distrófico. Também observamos que a sua expressão não é influenciada pelo processo de degeneração/regeneração, uma vez que não houve concordância entre os animais com músculos mais afetados e degenerados (Largemyd e Lama2dy2J/J) e aqueles com músculos menos degenerados (Dmdmdx e SJL/J), e esse padrão se mantém quando se comparam músculos com graus de degeneração diferentes. Nos animais recém-nascidos, verificou-se um aumento de expressão significativo nas linhagens Dmdmdx e Largemyd e uma queda nas linhagens Lama2dy2J/J e SJL/J. Já nos animais adultos, verificou-se maior semelhança ao perfil dos camundongos controles normais da mesma idade, com exceção do gene Large que apresentou expressão diminuída em quase todos os animais em estudo. No músculo humano, observamos uma ordem do nível de expressão diferente do observado em camundongos, com POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE. Os pacientes com DMD apresentaram um aumento da expressão de todos os genes estudados, de forma similar ao observado no grupo de camundongos Dmdmdx recém-nascidos, sugerindo uma associação com a falta de distrofina. Os pacientes LGMD 2I não apresentaram redução significativa da expressão de FKRP, sugerindo que o processo de transcrição é normal, mas a tradução ou a função/atividade da enzima deve estar comprometida. Nos pacientes CMD 1A, onde a deficiência primária da α2-laminina não está associada a defeito de glicosilação da α-DG, observou-se redução na expressão de POMT1 e FKRP, sugerindo que, a deficiência dessas enzimas possivelmente não altera este processo. Na análise de proteínas, não se observou uma correlação direta com os resultados da expressão gênica das glicosiltrasferases, sugerindo mais uma vez que, por serem enzimas, essas proteínas funcionam de forma diferenciada quando comparadas a proteínas estruturais. Entretanto, nas reações com os anticorpos Anti-POMT1 e Anti-FKRP, os camundongos recém-nascidos apresentaram bandas adicionais de peso molecular maior, sugerindo que essas enzimas estão ligadas a outras proteínas ou entre si nos estágios iniciais de desenvolvimento muscular / Muscular Dystrophies (MD) are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscle. Recently, defects in α-DG glycosylation have been associated with different types of severe forms of muscular dystrophies. Therefore, alteration in this mechanism has been considered an important pathogenetic cause of muscle degeneration, opening new avenues for therapies. The main objective of this study is to evaluate the expression cascade of genes involved in the glycosylation of α-DG in murine models and in patients with different molecular defects causing MD. We found that both normal and dystrophic mice express the glycosyltransferases genes in the following quantitative order: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, in all ages and in all studied strains, suggesting a constant mechanism of gene regulation, independent of growth, aging or dystrophic process. We also observed that this pattern of expression is not related to the degeneration/regeneration process, since there was no concordance between the animals with the most degenerated muscles (Largemyd and Lama2dy2J/J) or the less degenerated muscles (Dmdmdx and SJL/J). Additionally, both gastrocnemius (less degenerated in Dmdmdx) and diaphragm (more degenerated in Dmdmdx) presented the same pattern of expression. In newborn animals, a significant increased expression was observed in Dmdmdx and Largemyd and a decrease in Lama2dy2J/J and SJL/J. In adult animals, the expression profile of Pomt1, Pomgnt1 and Fkrp was similar in normal and affected mice, while Large showed a decreased expression in almost all affected animals. In human muscle, the quantitative order of expression of the 4 genes was: POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE, different from the mice. DMD patients showed an increased expression of all the studied genes, in a pattern similar as the observed in the newborns group of the murine Dmdmdx model, suggesting an association with the lack of protein dystrophin. LGMD 2I patients showed no significant reduction in FKRP expression, indicating a normal transcriptional process. In CMD 1A patients, there was a reduction in POMT1 and FKRP expression, in spite of a normal α-DG glycosylation observed in this disease, suggesting that the deficiency of these enzymes may not alter this process. At the protein level, we did not observe a direct correlation between protein quantities of glicosiltrasferases and gene expression, suggesting that enzymes regulation functions differently as compared with structural proteins. Interestingly, antibodies for POMT1 and FKRP detected, in newborn mice, additional bands of higher molecular weight, suggesting that these enzymes are linked to each other or with other proteins in the early stages of muscle development

Les myopathies d’origine génétique sont des pathologies musculaires en rapport avec des anomalies génétiques. Les myopathies sont à l’origine d’un handicap physique majeur et affectent souvent la fonction respiratoire et parfois le cœur. Nous nous sommes intéressés à la caractérisation myocardique de 4 types de myopathies d’origine génétique à l’aide de l’échocardiographie Doppler : myopathie de Duchenne, sarcoglycanopathies, MELAS syndrome et maladie de Pompe.Nous avons analysé la fonction cardiaque dans 2 modèles murins de dystrophies musculaires: la souris mdx et la souris sgca null. En clinique, nous avons analysé la fonction cardiaque des sujets atteints de myopathie de Duchenne, de sarcoglycanopathies, de MELAS syndrome et de maladie de Pompe en échocardiographie Doppler.Dans les modèles animaux, nous avons retrouvé des anomalies myocardiques chez la souris mdx et chez la souris sgca null. Chez l’homme, l’atteinte myocardique est sévère chez les sujets atteints de myopathie de Duchenne et certains patients présentent un asynchronisme ventriculaire soulevant les indications éventuelles de resynchronisation myocardique. Les sujets atteints de gamma sarcoglycanopathies présentent de façon significative des anomalies de contraction du ventricule gauche comparativement aux sujets atteints d’alpha-sarcoglycanopathies. La fonction ventriculaire droite et gauche est préservée chez les sujets atteints de maladie de Pompe. Les sujets atteints de MELAS présentent des hypertrophies du ventricule gauche. L’analyse génétique retrouve une corrélation significative entre le taux d’hétéroplamie et la survenue d’événements cliniques. / Muscular dystrophies are genetic neuromuscular disorders that affect skeletal muscle. We sought to assess heat involvement in four genetic muscular disorders : Duchenne muscular dystrophy, sarcoglycanopathies, MELAS and adulte Pompe disease. In animal models, we sought to assess, using Echocardiography Doppler, mdx mice and sgca null mice. Myocardiac abnormalities were found in mdx mice and sgca null mice. Clinical studies found severe cardiac impairment in Duchenne muscular dystrophies and ventricular asynchrony was found in patients with severe heart failure. Patients with gamma sarcoglycanopathy have significant alteration of left ventricular function in comparison with patients with alpha sarcoglycanopathy. Left and right ventricular function were preserved in patients with Pompe disease. Left ventricular hypertrophy was found in patients with MELAS. Genetic analysis disclosed significant correlation between heteroplasmy and significant clinical events.

Diss. (sammanfattning) Uppsala : Univ., 2001. / Härtill 5 uppsatser.

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Recentemente, associaram-se defeitos do mecanismo de glicosilação da proteína α-DG com diversos tipos de distrofias musculares graves. Alterações nesse processo constituem, portanto um novo mecanismo patogenético nas doenças neuromusculares, abrindo novas possibilidades de estudo. Neste sentido, foram objetivos deste trabalho avaliar o perfil de expressão dos genes envolvidos na glicosilação da proteína α-DG em modelos murinos e em pacientes, e tentar relacionar com os diferentes processos distróficos. Verificamos que tanto camundongos normais como distróficos expressam os genes codificantes das glicosiltransferases na seguinte ordem: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, em todas as idades e em todas as linhagens estudadas, sugerindo um mecanismo constante de regulação gênica, independente do crescimento, envelhecimento ou processo distrófico. Também observamos que a sua expressão não é influenciada pelo processo de degeneração/regeneração, uma vez que não houve concordância entre os animais com músculos mais afetados e degenerados (Largemyd e Lama2dy2J/J) e aqueles com músculos menos degenerados (Dmdmdx e SJL/J), e esse padrão se mantém quando se comparam músculos com graus de degeneração diferentes. Nos animais recém-nascidos, verificou-se um aumento de expressão significativo nas linhagens Dmdmdx e Largemyd e uma queda nas linhagens Lama2dy2J/J e SJL/J. Já nos animais adultos, verificou-se maior semelhança ao perfil dos camundongos controles normais da mesma idade, com exceção do gene Large que apresentou expressão diminuída em quase todos os animais em estudo. No músculo humano, observamos uma ordem do nível de expressão diferente do observado em camundongos, com POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE. Os pacientes com DMD apresentaram um aumento da expressão de todos os genes estudados, de forma similar ao observado no grupo de camundongos Dmdmdx recém-nascidos, sugerindo uma associação com a falta de distrofina. Os pacientes LGMD 2I não apresentaram redução significativa da expressão de FKRP, sugerindo que o processo de transcrição é normal, mas a tradução ou a função/atividade da enzima deve estar comprometida. Nos pacientes CMD 1A, onde a deficiência primária da α2-laminina não está associada a defeito de glicosilação da α-DG, observou-se redução na expressão de POMT1 e FKRP, sugerindo que, a deficiência dessas enzimas possivelmente não altera este processo. Na análise de proteínas, não se observou uma correlação direta com os resultados da expressão gênica das glicosiltrasferases, sugerindo mais uma vez que, por serem enzimas, essas proteínas funcionam de forma diferenciada quando comparadas a proteínas estruturais. Entretanto, nas reações com os anticorpos Anti-POMT1 e Anti-FKRP, os camundongos recém-nascidos apresentaram bandas adicionais de peso molecular maior, sugerindo que essas enzimas estão ligadas a outras proteínas ou entre si nos estágios iniciais de desenvolvimento muscular / Muscular Dystrophies (MD) are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscle. Recently, defects in α-DG glycosylation have been associated with different types of severe forms of muscular dystrophies. Therefore, alteration in this mechanism has been considered an important pathogenetic cause of muscle degeneration, opening new avenues for therapies. The main objective of this study is to evaluate the expression cascade of genes involved in the glycosylation of α-DG in murine models and in patients with different molecular defects causing MD. We found that both normal and dystrophic mice express the glycosyltransferases genes in the following quantitative order: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, in all ages and in all studied strains, suggesting a constant mechanism of gene regulation, independent of growth, aging or dystrophic process. We also observed that this pattern of expression is not related to the degeneration/regeneration process, since there was no concordance between the animals with the most degenerated muscles (Largemyd and Lama2dy2J/J) or the less degenerated muscles (Dmdmdx and SJL/J). Additionally, both gastrocnemius (less degenerated in Dmdmdx) and diaphragm (more degenerated in Dmdmdx) presented the same pattern of expression. In newborn animals, a significant increased expression was observed in Dmdmdx and Largemyd and a decrease in Lama2dy2J/J and SJL/J. In adult animals, the expression profile of Pomt1, Pomgnt1 and Fkrp was similar in normal and affected mice, while Large showed a decreased expression in almost all affected animals. In human muscle, the quantitative order of expression of the 4 genes was: POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE, different from the mice. DMD patients showed an increased expression of all the studied genes, in a pattern similar as the observed in the newborns group of the murine Dmdmdx model, suggesting an association with the lack of protein dystrophin. LGMD 2I patients showed no significant reduction in FKRP expression, indicating a normal transcriptional process. In CMD 1A patients, there was a reduction in POMT1 and FKRP expression, in spite of a normal α-DG glycosylation observed in this disease, suggesting that the deficiency of these enzymes may not alter this process. At the protein level, we did not observe a direct correlation between protein quantities of glicosiltrasferases and gene expression, suggesting that enzymes regulation functions differently as compared with structural proteins. Interestingly, antibodies for POMT1 and FKRP detected, in newborn mice, additional bands of higher molecular weight, suggesting that these enzymes are linked to each other or with other proteins in the early stages of muscle development