As distrofias musculares são doenças genéticas causadas por mutações em diferentes genes caracterizadas por degeneração muscular, prejuízos locomotores e, geralmente, morte precoce. Dentre elas, a de Duchenne, causada por mutações no gene que codifica para a proteína distrofina, é a mais comum e grave, tendo os camundongos MDX como modelo experimental mais utilizado. O objetivo do presente estudo foi testar quatro abordagens terapêuticas potencias neste modelo animal, divididas em dois experimentos: 1. treinamento físico voluntário em roda de atividade e/ou drogas agonistas das proteínas AMPK e PPAR em dias alternados (AICAR: 100 mg.Kg-1.dia-1, ip; GW 1516: 5 mg.Kg-1.dia-1, gavagem); 2. células-tronco estromais humanas provenientes de lipoaspiração (um milhão a cada injeção intravenosa; uma injeção a cada 10 dias nos dois primeiros meses de tratamento e injeções mensais nos quatro meses subsequentes) e/ou suplementação com os aminoácidos alanina e glutamina (10 mg.kg-1.dia-1, injeção diária intraperitoneal). Em relação ao primeiro experimento, o principal achado foi que os animais submetidos ao treinamento físico associado às drogas apresentaram índices de função muscular superiores aos outros grupos. Já em relação ao segundo grupo de análises, foi observado que os animais submetidos à terapia celular apresentaram tempo de vida significativamente maior quando comparados aos animais não tratados e aos tratados com ambas as terapias. Tais resultados, nunca demonstrados previamente pela literatura científica, podem contribuir para o entendimento da fisiopatologia das distrofias musculares e para o avanço de potenciais abordagens terapêuticas. / Muscular dystrophies are genetic diseases caused by mutations in different genes. They are characterized by muscle degeneration, motor prejudices and, generally, early death. Among them, Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and severe form and it is caused by mutations in the dystrophin gene. The most widely used animal model of DMD is the MDX mouse. The aim of this study was to test four potential therapeutic approaches assigned in two experiments: 1. voluntary exercise training in activity road and/or AMPK and PPAR agonists drugs every other day in MDX mice (AICAR: 100 mg.Kg-1.day-1, IP; GW 1516: 5 mg.Kg-1.day-1, gavage); 2. Intravenous injection of stromal stem cells from human adipose tissue (106 cells every 10 days in the first two months and monthly injections in the following four months) and/or alanine and glutamine amino acids supplementation (10 mg.Kg-1.day-1, daily IP injections). In the first experiment we demonstrated that mdx mice submitted to exercise training associated to drugs presented improved muscle function when compared to the other groups. In the second experiment, on the other hand, it was observed that the animals submitted to cell therapy presented increased survival when compared to non injected animals and animals treated with both approaches. These results, here demonstrated for the first time, can contribute to understand the physiopathology of muscular dystrophies and may give insights for future therapeutic approaches

As distrofias musculares são doenças genéticas causadas por mutações em diferentes genes caracterizadas por degeneração muscular, prejuízos locomotores e, geralmente, morte precoce. Dentre elas, a de Duchenne, causada por mutações no gene que codifica para a proteína distrofina, é a mais comum e grave, tendo os camundongos MDX como modelo experimental mais utilizado. O objetivo do presente estudo foi testar quatro abordagens terapêuticas potencias neste modelo animal, divididas em dois experimentos: 1. treinamento físico voluntário em roda de atividade e/ou drogas agonistas das proteínas AMPK e PPAR em dias alternados (AICAR: 100 mg.Kg-1.dia-1, ip; GW 1516: 5 mg.Kg-1.dia-1, gavagem); 2. células-tronco estromais humanas provenientes de lipoaspiração (um milhão a cada injeção intravenosa; uma injeção a cada 10 dias nos dois primeiros meses de tratamento e injeções mensais nos quatro meses subsequentes) e/ou suplementação com os aminoácidos alanina e glutamina (10 mg.kg-1.dia-1, injeção diária intraperitoneal). Em relação ao primeiro experimento, o principal achado foi que os animais submetidos ao treinamento físico associado às drogas apresentaram índices de função muscular superiores aos outros grupos. Já em relação ao segundo grupo de análises, foi observado que os animais submetidos à terapia celular apresentaram tempo de vida significativamente maior quando comparados aos animais não tratados e aos tratados com ambas as terapias. Tais resultados, nunca demonstrados previamente pela literatura científica, podem contribuir para o entendimento da fisiopatologia das distrofias musculares e para o avanço de potenciais abordagens terapêuticas. / Muscular dystrophies are genetic diseases caused by mutations in different genes. They are characterized by muscle degeneration, motor prejudices and, generally, early death. Among them, Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common and severe form and it is caused by mutations in the dystrophin gene. The most widely used animal model of DMD is the MDX mouse. The aim of this study was to test four potential therapeutic approaches assigned in two experiments: 1. voluntary exercise training in activity road and/or AMPK and PPAR agonists drugs every other day in MDX mice (AICAR: 100 mg.Kg-1.day-1, IP; GW 1516: 5 mg.Kg-1.day-1, gavage); 2. Intravenous injection of stromal stem cells from human adipose tissue (106 cells every 10 days in the first two months and monthly injections in the following four months) and/or alanine and glutamine amino acids supplementation (10 mg.Kg-1.day-1, daily IP injections). In the first experiment we demonstrated that mdx mice submitted to exercise training associated to drugs presented improved muscle function when compared to the other groups. In the second experiment, on the other hand, it was observed that the animals submitted to cell therapy presented increased survival when compared to non injected animals and animals treated with both approaches. These results, here demonstrated for the first time, can contribute to understand the physiopathology of muscular dystrophies and may give insights for future therapeutic approaches

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Recentemente, associaram-se defeitos do mecanismo de glicosilação da proteína α-DG com diversos tipos de distrofias musculares graves. Alterações nesse processo constituem, portanto um novo mecanismo patogenético nas doenças neuromusculares, abrindo novas possibilidades de estudo. Neste sentido, foram objetivos deste trabalho avaliar o perfil de expressão dos genes envolvidos na glicosilação da proteína α-DG em modelos murinos e em pacientes, e tentar relacionar com os diferentes processos distróficos. Verificamos que tanto camundongos normais como distróficos expressam os genes codificantes das glicosiltransferases na seguinte ordem: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, em todas as idades e em todas as linhagens estudadas, sugerindo um mecanismo constante de regulação gênica, independente do crescimento, envelhecimento ou processo distrófico. Também observamos que a sua expressão não é influenciada pelo processo de degeneração/regeneração, uma vez que não houve concordância entre os animais com músculos mais afetados e degenerados (Largemyd e Lama2dy2J/J) e aqueles com músculos menos degenerados (Dmdmdx e SJL/J), e esse padrão se mantém quando se comparam músculos com graus de degeneração diferentes. Nos animais recém-nascidos, verificou-se um aumento de expressão significativo nas linhagens Dmdmdx e Largemyd e uma queda nas linhagens Lama2dy2J/J e SJL/J. Já nos animais adultos, verificou-se maior semelhança ao perfil dos camundongos controles normais da mesma idade, com exceção do gene Large que apresentou expressão diminuída em quase todos os animais em estudo. No músculo humano, observamos uma ordem do nível de expressão diferente do observado em camundongos, com POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE. Os pacientes com DMD apresentaram um aumento da expressão de todos os genes estudados, de forma similar ao observado no grupo de camundongos Dmdmdx recém-nascidos, sugerindo uma associação com a falta de distrofina. Os pacientes LGMD 2I não apresentaram redução significativa da expressão de FKRP, sugerindo que o processo de transcrição é normal, mas a tradução ou a função/atividade da enzima deve estar comprometida. Nos pacientes CMD 1A, onde a deficiência primária da α2-laminina não está associada a defeito de glicosilação da α-DG, observou-se redução na expressão de POMT1 e FKRP, sugerindo que, a deficiência dessas enzimas possivelmente não altera este processo. Na análise de proteínas, não se observou uma correlação direta com os resultados da expressão gênica das glicosiltrasferases, sugerindo mais uma vez que, por serem enzimas, essas proteínas funcionam de forma diferenciada quando comparadas a proteínas estruturais. Entretanto, nas reações com os anticorpos Anti-POMT1 e Anti-FKRP, os camundongos recém-nascidos apresentaram bandas adicionais de peso molecular maior, sugerindo que essas enzimas estão ligadas a outras proteínas ou entre si nos estágios iniciais de desenvolvimento muscular / Muscular Dystrophies (MD) are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscle. Recently, defects in α-DG glycosylation have been associated with different types of severe forms of muscular dystrophies. Therefore, alteration in this mechanism has been considered an important pathogenetic cause of muscle degeneration, opening new avenues for therapies. The main objective of this study is to evaluate the expression cascade of genes involved in the glycosylation of α-DG in murine models and in patients with different molecular defects causing MD. We found that both normal and dystrophic mice express the glycosyltransferases genes in the following quantitative order: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, in all ages and in all studied strains, suggesting a constant mechanism of gene regulation, independent of growth, aging or dystrophic process. We also observed that this pattern of expression is not related to the degeneration/regeneration process, since there was no concordance between the animals with the most degenerated muscles (Largemyd and Lama2dy2J/J) or the less degenerated muscles (Dmdmdx and SJL/J). Additionally, both gastrocnemius (less degenerated in Dmdmdx) and diaphragm (more degenerated in Dmdmdx) presented the same pattern of expression. In newborn animals, a significant increased expression was observed in Dmdmdx and Largemyd and a decrease in Lama2dy2J/J and SJL/J. In adult animals, the expression profile of Pomt1, Pomgnt1 and Fkrp was similar in normal and affected mice, while Large showed a decreased expression in almost all affected animals. In human muscle, the quantitative order of expression of the 4 genes was: POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE, different from the mice. DMD patients showed an increased expression of all the studied genes, in a pattern similar as the observed in the newborns group of the murine Dmdmdx model, suggesting an association with the lack of protein dystrophin. LGMD 2I patients showed no significant reduction in FKRP expression, indicating a normal transcriptional process. In CMD 1A patients, there was a reduction in POMT1 and FKRP expression, in spite of a normal α-DG glycosylation observed in this disease, suggesting that the deficiency of these enzymes may not alter this process. At the protein level, we did not observe a direct correlation between protein quantities of glicosiltrasferases and gene expression, suggesting that enzymes regulation functions differently as compared with structural proteins. Interestingly, antibodies for POMT1 and FKRP detected, in newborn mice, additional bands of higher molecular weight, suggesting that these enzymes are linked to each other or with other proteins in the early stages of muscle development

As Distrofias Musculares Progressivas constituem um grupo heterogêneo de doenças genéticas caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. Recentemente, associaram-se defeitos do mecanismo de glicosilação da proteína α-DG com diversos tipos de distrofias musculares graves. Alterações nesse processo constituem, portanto um novo mecanismo patogenético nas doenças neuromusculares, abrindo novas possibilidades de estudo. Neste sentido, foram objetivos deste trabalho avaliar o perfil de expressão dos genes envolvidos na glicosilação da proteína α-DG em modelos murinos e em pacientes, e tentar relacionar com os diferentes processos distróficos. Verificamos que tanto camundongos normais como distróficos expressam os genes codificantes das glicosiltransferases na seguinte ordem: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, em todas as idades e em todas as linhagens estudadas, sugerindo um mecanismo constante de regulação gênica, independente do crescimento, envelhecimento ou processo distrófico. Também observamos que a sua expressão não é influenciada pelo processo de degeneração/regeneração, uma vez que não houve concordância entre os animais com músculos mais afetados e degenerados (Largemyd e Lama2dy2J/J) e aqueles com músculos menos degenerados (Dmdmdx e SJL/J), e esse padrão se mantém quando se comparam músculos com graus de degeneração diferentes. Nos animais recém-nascidos, verificou-se um aumento de expressão significativo nas linhagens Dmdmdx e Largemyd e uma queda nas linhagens Lama2dy2J/J e SJL/J. Já nos animais adultos, verificou-se maior semelhança ao perfil dos camundongos controles normais da mesma idade, com exceção do gene Large que apresentou expressão diminuída em quase todos os animais em estudo. No músculo humano, observamos uma ordem do nível de expressão diferente do observado em camundongos, com POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE. Os pacientes com DMD apresentaram um aumento da expressão de todos os genes estudados, de forma similar ao observado no grupo de camundongos Dmdmdx recém-nascidos, sugerindo uma associação com a falta de distrofina. Os pacientes LGMD 2I não apresentaram redução significativa da expressão de FKRP, sugerindo que o processo de transcrição é normal, mas a tradução ou a função/atividade da enzima deve estar comprometida. Nos pacientes CMD 1A, onde a deficiência primária da α2-laminina não está associada a defeito de glicosilação da α-DG, observou-se redução na expressão de POMT1 e FKRP, sugerindo que, a deficiência dessas enzimas possivelmente não altera este processo. Na análise de proteínas, não se observou uma correlação direta com os resultados da expressão gênica das glicosiltrasferases, sugerindo mais uma vez que, por serem enzimas, essas proteínas funcionam de forma diferenciada quando comparadas a proteínas estruturais. Entretanto, nas reações com os anticorpos Anti-POMT1 e Anti-FKRP, os camundongos recém-nascidos apresentaram bandas adicionais de peso molecular maior, sugerindo que essas enzimas estão ligadas a outras proteínas ou entre si nos estágios iniciais de desenvolvimento muscular / Muscular Dystrophies (MD) are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscle. Recently, defects in α-DG glycosylation have been associated with different types of severe forms of muscular dystrophies. Therefore, alteration in this mechanism has been considered an important pathogenetic cause of muscle degeneration, opening new avenues for therapies. The main objective of this study is to evaluate the expression cascade of genes involved in the glycosylation of α-DG in murine models and in patients with different molecular defects causing MD. We found that both normal and dystrophic mice express the glycosyltransferases genes in the following quantitative order: Pomgnt1>Large>Fkrp>Pomt1, in all ages and in all studied strains, suggesting a constant mechanism of gene regulation, independent of growth, aging or dystrophic process. We also observed that this pattern of expression is not related to the degeneration/regeneration process, since there was no concordance between the animals with the most degenerated muscles (Largemyd and Lama2dy2J/J) or the less degenerated muscles (Dmdmdx and SJL/J). Additionally, both gastrocnemius (less degenerated in Dmdmdx) and diaphragm (more degenerated in Dmdmdx) presented the same pattern of expression. In newborn animals, a significant increased expression was observed in Dmdmdx and Largemyd and a decrease in Lama2dy2J/J and SJL/J. In adult animals, the expression profile of Pomt1, Pomgnt1 and Fkrp was similar in normal and affected mice, while Large showed a decreased expression in almost all affected animals. In human muscle, the quantitative order of expression of the 4 genes was: POMT1>POMGnT1>FKRP>LARGE, different from the mice. DMD patients showed an increased expression of all the studied genes, in a pattern similar as the observed in the newborns group of the murine Dmdmdx model, suggesting an association with the lack of protein dystrophin. LGMD 2I patients showed no significant reduction in FKRP expression, indicating a normal transcriptional process. In CMD 1A patients, there was a reduction in POMT1 and FKRP expression, in spite of a normal α-DG glycosylation observed in this disease, suggesting that the deficiency of these enzymes may not alter this process. At the protein level, we did not observe a direct correlation between protein quantities of glicosiltrasferases and gene expression, suggesting that enzymes regulation functions differently as compared with structural proteins. Interestingly, antibodies for POMT1 and FKRP detected, in newborn mice, additional bands of higher molecular weight, suggesting that these enzymes are linked to each other or with other proteins in the early stages of muscle development

A distrofia muscular de cintura 2B (LGMD2B) é uma doença neuromuscular causada pela redução ou ausência da proteína sarcolemal disferlina. A disferlina está envolvida no reparo de membrana por atuar no tráfego e fusão de vesículas após estresse mecânico e, quando deficiente, as alterações nesta via levam à degeneração progressiva e irreversível das fibras musculares. A disferlina também tem sido implicada na inflamação e na miogênese durante a degeneração e regeneração muscular. Recentemente, identificou-se um tricomplexo formado pela disferlina com duas proteínas citoplasmáticas, FAM65B e HDAC6, no início da diferenciação de mioblastos. Investigar a regulação destas interações é importante para avançar na compreensão das funções da disferlina e seu papel na função muscular. Neste estudo, a miogênese e o reparo muscular foram investigados in vivo e in vitro em modelos com deficiência de disferlina. Para estudar o processo regenerativo in vivo, utilizamos um modelo de eletroporação para induzir degeneração/regeneração no músculo distrófico levemente afetado do camundongo disferlina-deficiente SJL/J. A avaliação histopatológica e a expressão relativa dos genes Pax7, Myf5, MyoD e miogenina foram acompanhadas durante a recuperação muscular em diferentes tempos após a lesão. Além disso, investigamos os efeitos da deficiência de disferlina na expressão dos genes Fam65b e Hdac6. Observamos um curso de tempo alterado do processo de degeneração e regeneração, com notável capacidade regenerativa nos camundongos disferlina-deficientes, caracterizada por uma resposta mais rápida e eficaz nos primeiros dias após a lesão, em comparação com os camundongos normais. Além disso, Fam65b e Hdac6 foram ativados nos estágios iniciais da regeneração muscular, também com expressão mais elevada de ambos os genes no camundongo SJL/J. Esses resultados podem estar relacionados à uma possível condição pré-ativada do processo regenerativo no músculo de camundongos distróficos jovens. Para os experimentos in vitro, utilizamos células musculares humanas de pacientes com LGMD2B, com deficiência total de disferlina. A diferenciação muscular induziu a formação de miotubos mais finos e com menor frequência de núcleos por miotubo, sugerindo uma progressão retardada da formação de miotubos em células com LGMD2B. A expressão de mRNA de MYOD e FAM65B não foi aparentemente afetada pela deficiência de disferlina durante a diferenciação, enquanto HDAC6 apresentou um pico transitório após 24 horas, apenas nas células normais. Além disso, o pico da miogenina ocorreu mais cedo nas células normais. Portanto, sugerimos que a disferlina estaria menos envolvida nos eventos iniciais de formação de pequenos miotubos, mas poderia desempenhar um papel importante nos estágios posteriores de diferenciação, que envolvem crescimento e alongamento de miotubos. Estes resultados fornecem dados interessantes para investigações adicionais de como a deficiência de disferlina afeta os reguladores miogênicos durante a diferenciação. Em conjunto, nossos dados sugerem que a deficiência de disferlina provoca alterações temporais na progressão dos eventos de regeneração muscular e de miogênese. A identificação de uma possível regulação dos componentes do tricomplexo pela disferlina pode indicar novas direções para investigar esta via como um potencial alvo para terapias / Limb girdle muscular dystrophy 2B (LGMD2B) is a neuromuscular disease caused by reduction or absence of the sarcolemmal protein dysferlin. Dysferlin is involved in membrane repair by acting on vesicular traffic and fusion after mechanical stress and, when deficient, changes in this pathway lead to progressive and irreversible degeneration of muscle fibers. Dysferlin has also been implicated in inflammation and myogenesis during muscle degeneration and regeneration. Recently, a tricomplex formed by dysferlin with two cytoplasmic proteins, FAM65B and HDAC6, was identified at the earlier stages of myoblast differentiation. Investigating the regulation of these interactions is important to advance in the understanding of the functions of dysferlin and its role in muscle function. In this study, myogenesis and muscle repair were investigated in vivo and in vitro in models with dysferlin deficiency. To study this effect in the regenerative process of muscle in vivo, we used a model of electroporation inducing muscle degeneration/regeneration in the mildly affected dystrophic muscle of dysferlin-deficient SJL/J mouse. The histopathological evaluation and the relative expression of the genes Pax7, Myf5, MyoD and myogenin were accompanied during muscle recovery at different time points after injury. In addition, we investigated the effects of dysferlin deficiency in the expression of genes Fam65b and Hdac6. We observed an altered time course of the degeneration and regeneration process, with remarkable regenerative capacity in dysferlin-deficient mice, characterized by a faster and effective response in the first days after injury, as compared to normal mice. Moreover, Fam65b and Hdac6 were activated at the early stages of muscle regeneration, also with higher expression of both genes in the SJL/J mouse. These results may have been due to a possible pre-activated condition of the regenerative process in the muscle of young dystrophic mice. For the in vitro experiments, we used human muscle cells from patients with LGMD2B, with total deficiency of dysferlin. The muscular differentiation induced the formation of thinner myotubes and reduced frequency of myonuclei per myotube, suggesting a delayed progression of myotube formation in LGMD2B cells. mRNA expression of MYOD and FAM65B was not apparently affected by dysferlin deficiency during differentiation, while HDAC6 exhibited a transient peak, only in healthy cells, after 24 hours. In addition, the myogenin peak occurred earlier in healthy cells. Thus, we suggested that dysferlin would be less involved in the first events of formation of early small myotubes, but could play an important role in the later stages of differentiation, which involves myotube growth and elongation. These results provide interesting data for further investigation of how dysferlin deficiency affects myogenic regulators during differentiation. Taken together, our data suggest that dysferlin deficiency causes temporal changes in the progression of the muscle regeneration and myogenesis events. The identification of possible regulation of tricomplex components by dysferlin may indicate new directions for investigating this pathway as a potential target for therapies

A partir dos resultados do trabalho (de 2006 a 2011) na Clínica de Psicanálise do Centro do Genoma Humano da Universidade de São Paulo USP, que atende prioritariamente afetados de doenças neuromusculares de origem genética, empreendemos uma pesquisa cuja hipótese de trabalho é aquela segundo a qual o diagnóstico de uma alteração genética pode funcionar para a pessoa como um insulto etimologicamente: saltar sobre - e, consequentemente, fixá-la como queixosa, triste, desinteressada do mundo etc. Assim, a pesquisa foi idealizada a partir da compreensão de que, para além da evolução natural da doença degenerativa, a pessoa piora porque, paradoxalmente, busca se relocalizar no insulto. Mostramos que, com o tratamento psicanalítico, ela pode reinventar sua vida singularmente, confrontada à surpresa do diagnóstico. Detectamos um vírus social que nomeamos de RC, as iniciais de Resignação e Compaixão. Com grande frequência, notamos que, após um primeiro momento de revolta do paciente, ele vai da raiva à resignação enquanto, sua família, do choro à compaixão. Essas duas reações, contrárias ao paciente, são, no entanto, muito valorizadas socialmente. Nosso trabalho, indo na contra vertente do RC, teve como objetivo geral discutir: a) como os pacientes da medicina do futuro, aquela que não diz o que lhe aconteceu, ou o que está lhe acontecendo, mas o que pode ou vai lhe acontecer, podem reagir à ocorrência do sofrimento humano de uma forma que piora o seu estado atual e futuro; e b) como a psicanálise pode ser um instrumento importante para o tratamento dessas pessoas, restituindo a elas a responsabilidade pela singularidade de suas vidas, tendo como consequência, não só uma evidente melhora, bem como, por causa disso, eventualmente atrasar o progredir da doença, ganhando tempo para que os avanços na pesquisa genética venham quiçá a beneficiá-los. Especificamente, estuda os efeitos que aproximadamente quinze semanas de tratamento psicanalítico podem ter sobre: a) uma população que teve o diagnóstico de portador de doença degenerativa confirmado; e b) uma população composta por não portadores de doenças degenerativas, mas que, de algum modo, dada a íntima relação estabelecida (parentesco, amorosa ou de amizade) com o portador, poderia influenciar, direta e estreitamente, no dia-a-dia do doente. Para tanto, toma como sujeitos 42 portadores de doenças degenerativas e 22 pessoas que se relacionam com eles a quem foram oferecidas 15 semanas de tratamento psicanalítico. Cada paciente foi avaliado duas vezes (no início e no fim) por meio da utilização de uma adaptação da versão brasileira de uma escala de impressão clínica de mudança. Os seguintes fatos destacaram-se em cada categoria. Geral: 80% dos casos de alteração para melhor na relação do paciente com a doença. Estado mental/cognitivo: quase 50% da população melhorou a possibilidade de se expressar. Comportamento: 72% da população apresentou melhora nos sentimentos depressivos. Vida amorosa: notável melhora em todos os domínios. Posição subjetiva: quase 80% da população passou a se responsabilizar pela própria vida. Concluímos que, o tratamento psicanalítico proporciona alto índice de melhoria imediata do paciente, e pode, ao menos potencialmente, alargar o tempo de instalação da lesão / From the results of the project (2006 to 2011) at the Psychoanalysis Clinic of the Human Genome Center at the University of São Paulo (USP), which gives priority to those suffering from neuromuscular diseases of genetic origin, we undertook a study whose hypothesis is that the diagnosis of a genetic change may act as an insult leaping upon at the patient (insult comes from the Latin insultare to assail, jump upon) and can result in the patient complaining and becoming morose and disinterested in the world. This study was conceived from the awareness that, in addition to the natural progression of the degenerative disease, the patient deteriorates because, paradoxically, they attempt to relocate themselves within the insult. We show that with the help of psychoanalytic treatment, the patient, faced with the surprise of the diagnosis, can reinvent their life in a singular way. We have detected a social virus which we call RC, Resignation and Compassion and have frequently observed that, after initial anger, the patient moves towards resignation while the family changes from weeping to showing compassion. Both reactions, which do not help the patient, are, nevertheless, highly valued socially. Our study, which goes against this RC element, discusses: a) how the patients in the medicine of the future, which does not say what happened, or what is happening, but what may or will happen, can react to the occurrence of human suffering in a way that deteriorates their present and future condition; and b) how psychoanalysis can be an important tool in the treatment of these patients, giving back to them responsibility for the singularity of their lives, resulting in not only a clear improvement but also, as a result of this, a possible delay in the progress of the disease, gaining time during which advances in genetic research may benefit them. We specifically study the effects that approximately fifteen weeks of psychoanalytic treatment may have on: a) a population that had the diagnosis of degenerative diseases confirmed; and, b) a population made up of people not suffering from degenerative diseases, but who, given their close relationship (family, affectionate or friendship) with the patient, could closely affect their day-to-day lives. In order to do so¸ 42 subjects suffering from degenerative diseases, and 22 people who had relationships with them, were offered 15 weeks of psychoanalytic treatment. Each patient was evaluated twice (at the beginning and end) by using an adaptation of the Brazilian version of a scale of clinical impression of change. The following results can be emphasized in each category. General: 80% of patients improved. Mental / cognitive state: almost 50% improved their ability to express themselves. Behavior: 72% improved their depressive tendencies. Love life: remarkable improvements in all areas. Subjective position: almost 80% of the population started to take responsibility for their own lives. We conclude that psychoanalytic treatment has a high rate of immediate improvement in the patient and can, at least potentially, extend the period the degenerative disease requires to take effect

As distrofias musculares constituem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A fraqueza muscular se manifesta quanto existe um desequilíbrio entre os ciclos de degeneração e regeneração, com subseqüente substituição por tecido conjuntivo e adiposo das fibras musculares eliminadas. Diversos fatores estão implicados nestes processos, e as vias de atuação de cada um deles ainda não são totalmente conhecidas. Os mais importantes marcadores da via miogênica são os fatores Myf5, MyoD, Myf6 e miogenina. Os marcadores da degeneração, por sua vez, são o TGFβ-1, citocina inflamatória provavelmente envolvida no processo de fibrose do músculo distrófico, e o aumento da expressão do próprio colágeno, componente da matriz extracelular. O objetivo do presente projeto consistiu em estudar os fatores relacionados com as vias de degeneração e regeneração em modelos murinos distróficos com diferentes defeitos nas proteínas musculares, para elucidação dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos, visando terapias. Para tal, foram estabelecidas três abordagens: 1-) Estudar o potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais de medulas óssea, nos modelos Lama2dy-2J/J (deficiente para a proteína α2-laminina) e Largemyd (defeito de glicosilação); 2-) Estudar a expressão relativa dos genes envolvidos nas vias de degeneração e regeneração nos diferentes modelos murinos para distrofias musculares; 3-) Estudar o papel da distrofina e α2-laminina na organização do complexo distrofina-glicoproteínas associadas no músculo esquelético, através da produção de um camundongo duplo-mutante deficiente para estas duas proteínas. Na primeira abordagem, células-tronco mesenquimais de medula, expressando a proteína eGFP, foram injetadas por via sistêmica em camundongos Lama2dy-2J/J e Largemyd, mas não foram localizadas posteriormente no músculo dos animais testados. Testes complementares mostraram que células MSC e C2C12 expressando eGFP permanecem por curtos períodos de tempo no tecido injetado, sugerindo que são eliminadas do músculo distrófico em virtude da expressão permanente de eGFP. Análise funcional realizada nestes animais mostrou uma grande heterogeneidade de resposta nos diversos testes aplicados, compatível com a variabilidade clínica também observada em pacientes humanos. Na segunda abordagem, analisamos a expressão dos genes da cascata de degeneração e regeneração nos modelos distróficos mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J e Largemyd, e correlacionamos estes resultados com o padrão histopatológico de cada modelo. Os resultados observados sugerem que o gene TGFβ-1 é ativado pelo processo distrófico em qualquer grau de degeneração, enquanto a ativação da expressão do gene PCOL possivelmente ocorre nos estágios iniciais deste processo. Observou-se também que cada mecanismo patofisiológico atuou de forma diversa na ativação da regeneração, com diferenças na indução da proliferação das células-satélite, mas sem alterações no estimulo à diferenciação. Assim, a disfunção na população de células-satélite pode representar um mecanismo importante na patogênese das distrofias musculares. Na terceira abordagem, um modelo murino duplo-mutante para as proteínas distrofina e α2-laminina foi gerado a partir de cruzamentos das linhagens mdx e Lama2dy-2J/J, com a proporção mendeliana esperada, sendo, portanto, viável. O animal duplo-afetado está apresentando fraqueza muscular mais acentuada que os modelos parentais. Estudos complementares de proteínas musculares serão ainda realizados neste novo modelo para verificar a presença ou não das demais proteínas do DGC e sua relação com o padrão de degeneração/regeneração muscular. / The muscular dystrophies are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscles. Muscle weakness is the consequence of an imbalance between successive cycles of degeneration and regeneration, with further replacement of the degraded muscle fibers by adipose and connective tissues. Several factors are involved these processes and the respective functional pathways are still not well known. Myf5, MyoD, Myf6 and myogenin are important factors responsible for the myogenesis and regeneration in the muscle. One important marker for the degeneration is TGF-1, which is an inflammatory cytokine with a possible role in the stimulation of fibrosis in the dystrophic muscle through the activation of genes related to the expression of collagen. The main objective of this project was to study the factors involved in the degeneration and regeneration pathways, in mice models for muscular dystrophies, carrying different defects in muscle proteins, to better understand the involved pathophysiological mechanisms, aiming future therapies. This was done through three strategies: 1-) The study of the therapeutic potential of transplantation of bone marrow mesenchymal-eGFP transformed stem cells, in Lama2dy-2J/J (a2 laminin deficient mice) and Largemyd (mice with defect in the glycosilation of -DG) ; 2-) The analyses of the relative expression of genes involved in regeneration and degeneration, in different mice models for muscular dystrophies; 3-) The study of the roles of dystrophin and 2-laminin proteins in the organization of the dystrophin-glycoprotein complex in muscle sarcolemma through the generation of a new mouse model, double-mutant for these two proteins. In the first approach, bone marrow mesenchymal stem cells expressing eGFP protein were intravenously injected in Lama2dy-2J/J and Largemyd mice, but these cells were not localized in the muscle of the tested animals after 3 months of experiment. Complementary studies showed that MSC and C2C12 cells expressing eGFP, when directly injected in the muscle of these models, were retained for only a few days, suggesting a rejection against cells expressing eGFP in the dystrophic muscle. Functional analysis showed a high variability among the tested mice, which is similar to the significant clinical variability observed in human patients with muscular dystrophies. In the second approach we quantified the expression of genes involved in degeneration and regeneration pathways in the dystrophic models mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J and Largemyd, and correlated these data with muscle histopathological pattern of each model. The result suggests that TGFβ-1 gene is activated in the dystrophic process in all the stages of degeneration while the activation of the expression of the PCOL gene possibly occurs in earliest stages of this process. We also observed that each physiopathological mechanism acted differently in the activation of regeneration, with differences in the induction of proliferation of satellite cells, but with no alterations in stimulation to differentiation. Dysfunction of satellite cells can therefore be an important additional mechanism of pathogenesis in the dystrophic muscle. In the third approach we generated a new dystrophic mouse model, carrying two simultaneous deficiencies of the proteins dystrophin and 2-laminin, by crossing mdx and Lama2dy-2J/J strains. In the offspring, the proportion of affected double-mutant mice was within the expected mendelian proportion, showing therefore, the viability of these defects with life. Only 4 alive animals were obtained up to the present date, and they are being followed for clinical characterization. The phenotype of this double-mutant mouse is very severe, presenting significant weakness, starting earlier and progressing faster that the parental strains. When more affected animals will be available, additional protein studies will be done to verify the effect of these two deficiencies in the organization of the DGC complex and its effect on the cascades of muscle degeneration and regeneration.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:41:07Z : No. of bitstreams: 1 souza_ap_dr_jabo.pdf: 811812 bytes, checksum: 25bce5312ab6b25601cdee2a32e17491 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) é uma doença genética recessiva e hereditária, ligada ao cromossomo X, caracterizada pela ausência ou insuficiência da proteína distrofina no sarcolema das fibras musculares. É uma doença muscular progressiva, que afeta um em cada 3.500 meninos. Atualmente, os cães da raça Golden Retriever, portadores da distrofia muscular do Golden Retriever (GRMD), que exibem mudanças musculares, patogenia, bem como o fenótipo, comparáveis aos vistos nos casos de DMD, vêm sendo considerados o melhor modelo animal para o estudo da DMD. Nos GRMDs a fraqueza muscular inicia-se a partir do segundo mês de vida e é progressiva, portanto, a expectativa de vida destes cães é muito reduzida. Histologicamente, os músculos mostram necrose, fibrose e regeneração. As manifestações patológicas da GRMD já se iniciam na vida intra-uterina com o desenvolvimento de lesões nos músculos da língua. A hipertrofia da língua está associada com disfunção da faringe e do esôfago, o que resulta em disfagia, regurgitação e sialorréia. A pesquisa com células-tronco tem um potencial para avanços significativos no nosso conhecimento da diferenciação celular com a promessa de excitantes e inovadoras aplicações terapêuticas para desordens genéticas e degenerativas incuráveis... / Duchenne’s Muscular Dystrophy (DMD) is a lethal childhood disease, a X-linked recessive disorder, caused by mutations of the dystrophyn gene, a protein that has a vital role in maintaining muscle structure and function. DMD is a progressive muscular disease, that affects 1:3500 born boys. At this moment, the dogs with Golden Retriever Muscular Dystrophy (GRMD), is the best animal model to study DMD. GRMD dog exhibits muscle changes, pathogenesis and phenotype comparable with the DMD boys. In GRMDs the muscular weakness beginning with 60 days of life and this is progressive. Histologically, the muscles show necrosis, fibrosis, degeneration and regeneration. The pathogenesis manifests in utero with the development of lingual muscle lesions. The tongue hypertrophy is associated with pharyngeal and esophageal dysfunction, and results in dysphagia, regurgitation and drooling. The research with steam-cells has a great potential to significative advances in owner knowledge about cellular differentiation, with the promise of therapeutic applications in genetic disorders and in degenerative or incurable diseases...(Complete abstract, click electronic access below)

As distrofias musculares constituem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas por uma degeneração progressiva e irreversível da musculatura esquelética. A fraqueza muscular se manifesta quanto existe um desequilíbrio entre os ciclos de degeneração e regeneração, com subseqüente substituição por tecido conjuntivo e adiposo das fibras musculares eliminadas. Diversos fatores estão implicados nestes processos, e as vias de atuação de cada um deles ainda não são totalmente conhecidas. Os mais importantes marcadores da via miogênica são os fatores Myf5, MyoD, Myf6 e miogenina. Os marcadores da degeneração, por sua vez, são o TGFβ-1, citocina inflamatória provavelmente envolvida no processo de fibrose do músculo distrófico, e o aumento da expressão do próprio colágeno, componente da matriz extracelular. O objetivo do presente projeto consistiu em estudar os fatores relacionados com as vias de degeneração e regeneração em modelos murinos distróficos com diferentes defeitos nas proteínas musculares, para elucidação dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos, visando terapias. Para tal, foram estabelecidas três abordagens: 1-) Estudar o potencial terapêutico de células-tronco mesenquimais de medulas óssea, nos modelos Lama2dy-2J/J (deficiente para a proteína α2-laminina) e Largemyd (defeito de glicosilação); 2-) Estudar a expressão relativa dos genes envolvidos nas vias de degeneração e regeneração nos diferentes modelos murinos para distrofias musculares; 3-) Estudar o papel da distrofina e α2-laminina na organização do complexo distrofina-glicoproteínas associadas no músculo esquelético, através da produção de um camundongo duplo-mutante deficiente para estas duas proteínas. Na primeira abordagem, células-tronco mesenquimais de medula, expressando a proteína eGFP, foram injetadas por via sistêmica em camundongos Lama2dy-2J/J e Largemyd, mas não foram localizadas posteriormente no músculo dos animais testados. Testes complementares mostraram que células MSC e C2C12 expressando eGFP permanecem por curtos períodos de tempo no tecido injetado, sugerindo que são eliminadas do músculo distrófico em virtude da expressão permanente de eGFP. Análise funcional realizada nestes animais mostrou uma grande heterogeneidade de resposta nos diversos testes aplicados, compatível com a variabilidade clínica também observada em pacientes humanos. Na segunda abordagem, analisamos a expressão dos genes da cascata de degeneração e regeneração nos modelos distróficos mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J e Largemyd, e correlacionamos estes resultados com o padrão histopatológico de cada modelo. Os resultados observados sugerem que o gene TGFβ-1 é ativado pelo processo distrófico em qualquer grau de degeneração, enquanto a ativação da expressão do gene PCOL possivelmente ocorre nos estágios iniciais deste processo. Observou-se também que cada mecanismo patofisiológico atuou de forma diversa na ativação da regeneração, com diferenças na indução da proliferação das células-satélite, mas sem alterações no estimulo à diferenciação. Assim, a disfunção na população de células-satélite pode representar um mecanismo importante na patogênese das distrofias musculares. Na terceira abordagem, um modelo murino duplo-mutante para as proteínas distrofina e α2-laminina foi gerado a partir de cruzamentos das linhagens mdx e Lama2dy-2J/J, com a proporção mendeliana esperada, sendo, portanto, viável. O animal duplo-afetado está apresentando fraqueza muscular mais acentuada que os modelos parentais. Estudos complementares de proteínas musculares serão ainda realizados neste novo modelo para verificar a presença ou não das demais proteínas do DGC e sua relação com o padrão de degeneração/regeneração muscular. / The muscular dystrophies are a heterogeneous group of genetic diseases characterized by progressive and irreversible degeneration of skeletal muscles. Muscle weakness is the consequence of an imbalance between successive cycles of degeneration and regeneration, with further replacement of the degraded muscle fibers by adipose and connective tissues. Several factors are involved these processes and the respective functional pathways are still not well known. Myf5, MyoD, Myf6 and myogenin are important factors responsible for the myogenesis and regeneration in the muscle. One important marker for the degeneration is TGF-1, which is an inflammatory cytokine with a possible role in the stimulation of fibrosis in the dystrophic muscle through the activation of genes related to the expression of collagen. The main objective of this project was to study the factors involved in the degeneration and regeneration pathways, in mice models for muscular dystrophies, carrying different defects in muscle proteins, to better understand the involved pathophysiological mechanisms, aiming future therapies. This was done through three strategies: 1-) The study of the therapeutic potential of transplantation of bone marrow mesenchymal-eGFP transformed stem cells, in Lama2dy-2J/J (a2 laminin deficient mice) and Largemyd (mice with defect in the glycosilation of -DG) ; 2-) The analyses of the relative expression of genes involved in regeneration and degeneration, in different mice models for muscular dystrophies; 3-) The study of the roles of dystrophin and 2-laminin proteins in the organization of the dystrophin-glycoprotein complex in muscle sarcolemma through the generation of a new mouse model, double-mutant for these two proteins. In the first approach, bone marrow mesenchymal stem cells expressing eGFP protein were intravenously injected in Lama2dy-2J/J and Largemyd mice, but these cells were not localized in the muscle of the tested animals after 3 months of experiment. Complementary studies showed that MSC and C2C12 cells expressing eGFP, when directly injected in the muscle of these models, were retained for only a few days, suggesting a rejection against cells expressing eGFP in the dystrophic muscle. Functional analysis showed a high variability among the tested mice, which is similar to the significant clinical variability observed in human patients with muscular dystrophies. In the second approach we quantified the expression of genes involved in degeneration and regeneration pathways in the dystrophic models mdx, SJL/J, Lama2dy-2J/J and Largemyd, and correlated these data with muscle histopathological pattern of each model. The result suggests that TGFβ-1 gene is activated in the dystrophic process in all the stages of degeneration while the activation of the expression of the PCOL gene possibly occurs in earliest stages of this process. We also observed that each physiopathological mechanism acted differently in the activation of regeneration, with differences in the induction of proliferation of satellite cells, but with no alterations in stimulation to differentiation. Dysfunction of satellite cells can therefore be an important additional mechanism of pathogenesis in the dystrophic muscle. In the third approach we generated a new dystrophic mouse model, carrying two simultaneous deficiencies of the proteins dystrophin and 2-laminin, by crossing mdx and Lama2dy-2J/J strains. In the offspring, the proportion of affected double-mutant mice was within the expected mendelian proportion, showing therefore, the viability of these defects with life. Only 4 alive animals were obtained up to the present date, and they are being followed for clinical characterization. The phenotype of this double-mutant mouse is very severe, presenting significant weakness, starting earlier and progressing faster that the parental strains. When more affected animals will be available, additional protein studies will be done to verify the effect of these two deficiencies in the organization of the DGC complex and its effect on the cascades of muscle degeneration and regeneration.

A partir dos resultados do trabalho (de 2006 a 2011) na Clínica de Psicanálise do Centro do Genoma Humano da Universidade de São Paulo USP, que atende prioritariamente afetados de doenças neuromusculares de origem genética, empreendemos uma pesquisa cuja hipótese de trabalho é aquela segundo a qual o diagnóstico de uma alteração genética pode funcionar para a pessoa como um insulto etimologicamente: saltar sobre - e, consequentemente, fixá-la como queixosa, triste, desinteressada do mundo etc. Assim, a pesquisa foi idealizada a partir da compreensão de que, para além da evolução natural da doença degenerativa, a pessoa piora porque, paradoxalmente, busca se relocalizar no insulto. Mostramos que, com o tratamento psicanalítico, ela pode reinventar sua vida singularmente, confrontada à surpresa do diagnóstico. Detectamos um vírus social que nomeamos de RC, as iniciais de Resignação e Compaixão. Com grande frequência, notamos que, após um primeiro momento de revolta do paciente, ele vai da raiva à resignação enquanto, sua família, do choro à compaixão. Essas duas reações, contrárias ao paciente, são, no entanto, muito valorizadas socialmente. Nosso trabalho, indo na contra vertente do RC, teve como objetivo geral discutir: a) como os pacientes da medicina do futuro, aquela que não diz o que lhe aconteceu, ou o que está lhe acontecendo, mas o que pode ou vai lhe acontecer, podem reagir à ocorrência do sofrimento humano de uma forma que piora o seu estado atual e futuro; e b) como a psicanálise pode ser um instrumento importante para o tratamento dessas pessoas, restituindo a elas a responsabilidade pela singularidade de suas vidas, tendo como consequência, não só uma evidente melhora, bem como, por causa disso, eventualmente atrasar o progredir da doença, ganhando tempo para que os avanços na pesquisa genética venham quiçá a beneficiá-los. Especificamente, estuda os efeitos que aproximadamente quinze semanas de tratamento psicanalítico podem ter sobre: a) uma população que teve o diagnóstico de portador de doença degenerativa confirmado; e b) uma população composta por não portadores de doenças degenerativas, mas que, de algum modo, dada a íntima relação estabelecida (parentesco, amorosa ou de amizade) com o portador, poderia influenciar, direta e estreitamente, no dia-a-dia do doente. Para tanto, toma como sujeitos 42 portadores de doenças degenerativas e 22 pessoas que se relacionam com eles a quem foram oferecidas 15 semanas de tratamento psicanalítico. Cada paciente foi avaliado duas vezes (no início e no fim) por meio da utilização de uma adaptação da versão brasileira de uma escala de impressão clínica de mudança. Os seguintes fatos destacaram-se em cada categoria. Geral: 80% dos casos de alteração para melhor na relação do paciente com a doença. Estado mental/cognitivo: quase 50% da população melhorou a possibilidade de se expressar. Comportamento: 72% da população apresentou melhora nos sentimentos depressivos. Vida amorosa: notável melhora em todos os domínios. Posição subjetiva: quase 80% da população passou a se responsabilizar pela própria vida. Concluímos que, o tratamento psicanalítico proporciona alto índice de melhoria imediata do paciente, e pode, ao menos potencialmente, alargar o tempo de instalação da lesão / From the results of the project (2006 to 2011) at the Psychoanalysis Clinic of the Human Genome Center at the University of São Paulo (USP), which gives priority to those suffering from neuromuscular diseases of genetic origin, we undertook a study whose hypothesis is that the diagnosis of a genetic change may act as an insult leaping upon at the patient (insult comes from the Latin insultare to assail, jump upon) and can result in the patient complaining and becoming morose and disinterested in the world. This study was conceived from the awareness that, in addition to the natural progression of the degenerative disease, the patient deteriorates because, paradoxically, they attempt to relocate themselves within the insult. We show that with the help of psychoanalytic treatment, the patient, faced with the surprise of the diagnosis, can reinvent their life in a singular way. We have detected a social virus which we call RC, Resignation and Compassion and have frequently observed that, after initial anger, the patient moves towards resignation while the family changes from weeping to showing compassion. Both reactions, which do not help the patient, are, nevertheless, highly valued socially. Our study, which goes against this RC element, discusses: a) how the patients in the medicine of the future, which does not say what happened, or what is happening, but what may or will happen, can react to the occurrence of human suffering in a way that deteriorates their present and future condition; and b) how psychoanalysis can be an important tool in the treatment of these patients, giving back to them responsibility for the singularity of their lives, resulting in not only a clear improvement but also, as a result of this, a possible delay in the progress of the disease, gaining time during which advances in genetic research may benefit them. We specifically study the effects that approximately fifteen weeks of psychoanalytic treatment may have on: a) a population that had the diagnosis of degenerative diseases confirmed; and, b) a population made up of people not suffering from degenerative diseases, but who, given their close relationship (family, affectionate or friendship) with the patient, could closely affect their day-to-day lives. In order to do so¸ 42 subjects suffering from degenerative diseases, and 22 people who had relationships with them, were offered 15 weeks of psychoanalytic treatment. Each patient was evaluated twice (at the beginning and end) by using an adaptation of the Brazilian version of a scale of clinical impression of change. The following results can be emphasized in each category. General: 80% of patients improved. Mental / cognitive state: almost 50% improved their ability to express themselves. Behavior: 72% improved their depressive tendencies. Love life: remarkable improvements in all areas. Subjective position: almost 80% of the population started to take responsibility for their own lives. We conclude that psychoanalytic treatment has a high rate of immediate improvement in the patient and can, at least potentially, extend the period the degenerative disease requires to take effect