Resumo: O objetivo deste trabalho é investigar a localização de energia e o aprisionamento do breather no modelo de Peyrard Bishop com o potencial original de Morse, potencial simétrico de Morse e potenciais quárticos em cadeias homogêneas e não homogêneas usando o Teorema do limite anticontinuum. No caso não homogêneo, a impureza é introduzida pela profundidade do potencial. Foi observado que o modelo SPB apresenta pequenas amplitudes e menor densidade de energia comparada com o modelo PB. Para potenciais quárticos simétricos e assimétricos foi verificado numericamente que não temos transição de fase usando o conceito de amplitude média das vibrações. Entretanto, um potencial híbrido formado por um quártico e Morse pode fornecer uma grande amplitude de vibração das fitas de DNA . Finalmente, no sistema não homogêneo, se verificou a hipótese de aprisionamento por meio de uma simulação de interação do breather móvel com a região de TATA box para uma cadeia longa de DNA, correspondente à seqüencia de nucleotídeos que codifica a insulina. Este resultado deve ajudar a estender a aplicação dos breathers discretos a sistemas biológicos que levam em conta reações bioquímicas localizadas (como, por exemplo, reações enzimáticas) em macromoléculas biológicas. O modelo PB pode ser modificado para explicar a existência de movimentos localizados de grande amplitude. O decaimento da função potencial para valores grandes mostraram uma vibração localizada no equilíbrio de grande amplitude. Isso é feito alterando o potencial on site. / Abstract: The objective of this work is to investigate the energy localization and the breather trapping in the Peyrard-Bishop model with the original Morse potential, symmetric Morse potential and quartics potentials in homogeneous and inhomogeneous chains. In the inhomogeneous case, the impurity is introduced by the depth of the potential. It was observed that the SPB model shows small amplitude and lower density of energy compared with the PB model. Quartics potentials, for symmetric and asymmetric cases, do not show phase transition. It is verified by numerical calculation using the concept of mean amplitude of the vibrations. Meanwhile, a potential hybrid formed by a quartic and Morse is ideal for DNA applications. Finally, it was verified the trapping hypotheses through the simulation of interaction of mobile breather with the region of TATA box for a long chain of DNA corresponding to the nucleotide sequence that encodes the insulin. This result should help to extend the application of discrete breathers the biological systems that take into account located biochemical reactions (such as enzymatic reactions) in biological macromolecules. In addition, the PB model can be modified to explain the existence of highly localized large amplitudes motions of the base pairs in DNA. We do this change the on site potential. / Orientador: Elso Drigo Filho / Coorientador: José Roberto Ruggiero / Banca: Gerald Weber / Banca: Regina Maria Ricotta / Banca: Jayme Vicente de Luca Filho / Banca: Masayoshi Tsuchida / Doutor

Resumo: Mastoparanos são uma família de peptídeos líticos, extraídos do saco de veneno de vespas sociais, que apresentam moderada a intensa atividade antimicrobiana e alguns são hemolíticos e citotóxicos. Embora o mecanismo de ação destes peptídeos não seja bem compreendido ainda, aceita-se que envolva desestabilização da fase lipídica da membrana celular. Acredita-se que a carga líquida do peptídeo e sua hidrofobicidade média contribuam na modulação da atividade lítica e na seletividade. Nesta dissertação apresentamos um estudo de quatro peptídeos mastoparanos que possuem resíduos ácidos e básicos resultando em uma carga elétrica líquida variando de +1 a +4. Este estudo envolve a análise conformacional destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas e aniônicas por dicroísmo circular. Suas atividades líticas foram avaliadas usando espectroscopia de fluorescência monitorando a recuperação da intensidade de fluorescência devido à liberação de marcador fluorescente encapsulado em vesículas. As constantes de partição destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas foram também determinadas por espectroscopia de fluorescência usando um método de análise que é independente de modelo. Com o objetivo de entender a influência de resíduos ácidos e a carga líquida dos peptídeos e sua hidrofobicidade na interação peptídeo-lipídio, foram estimadas as contribuições energéticas eletrostáticas e não eletrostática. Para alcançar este objetivo, os resultados obtidos nas isotermas de ligação por fluorescência foram associados com medidas de potencial zeta. Foi observado que a afinidade destes peptídeos em vesículas zwitteriônicas decresce com a carga líquida do peptídeo e as curvas de dose-resposta são mais cooperativas para os dois peptídeos com as cargas mais baixas. Os peptídeos com maior carga apresentaram uma maior afinidade... (Resumo completo clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Mastoparans are a family of lytic peptides extracted from the venom sac of wasps which present moderate to intense antimicrobial activity and some of them are hemolytic and cytotoxic. Although the mechanism of action of these peptides are still not completely understood, it is accepted that it involves the destabilization of the lipidic phase of the cell membrane. It is believed that both the peptide net electrical charge and its mean hydrophobicity contribute to modulate their lytic activity and selectivity. In this dissertation we present a study of four mastoparan peptides which have acidic and basic residues resulting in net electrical charges ranging from +1 to +4. This study involves the conformational analysis of these peptides in zwitterionic and anionic lipid vesicles by circular dichroism. Their lytic activities were evaluated using fluorescence spectroscopy by the release of fluorescent dye entrapped in these two types of vesicles. The partition constants of these peptides to zwitterionic vesicles were also determined by fluorescence spectroscopy using a method of analysis which is model independent. Aiming to understand the influence of acidic residues and of the peptides net charge and hydrophobocity on the peptide-lipid interaction, the electrostatic and non electrostatic energetic contributions were estimated. To achieve this goal it was used the association of the results of fluorescence binding isotherms and zeta potential measurements. It was observed that the affinity and lytic activity of these peptides in zwitterionic vesicles decrease with the peptides net electrical charges and the dose-response curves are more cooperative for the two peptides with lower net charges. The more charged peptides exhibit higher affinity and lytic activity in anionic vesicles. The most charged peptide displayed the higher selectivity for the vesicles studied. The present work... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: João Ruggiero Neto / Coorientador: Marcia Perez dos Santos Cabrera / Banca: Bibiana Monson de Souza / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Mestre

Orientador: Elso Drigo Filho / Banca: Makoto Yoshida / Banca: Gerald Weber / Banca: Jorge Chahine / Banca: João Ruggiero Neto / Resumo: O objetivo deste trabalho é investigar um modelo mecânico para a molécula de DNA. O modelo consiste de duas cadeias de osciladores harmônicos representando as tas do DNA. Esses osciladores são ligados por um potencial de Morse que simula as interações tipo pontes de hidrogênio, como no modelo original de Peyrard e Bishop. Entretanto, neste trabalho, os movimentos de rotação e de vibração de cada par de base podem ocorrer ao mesmo tempo. Neste contexto, propriedades estruturais e termodinâmicas são discutidas. / Abstract: The objective of this work is to investigate a mechanical model for the DNA molecule. The model consist in two chains of harmonic oscillators representing the ribbons of DNA linked by a Morse potential which represents the hydrogen bonds as in the Peyrard-Bishop's model. However, in this work, the rotation and vibration motion of each base pairs can be occur at the same time. In this context, thermodynamic and structural properties are discussed. / Doutor

Orientador: Marcio Francisco Colombo / Coorientador: Chien Ho / Banca: Marinônio Lopes Cornélio / Banca: Marcelo Andrés Fossey / Banca: Hamilton Cabral / Banca: Marcelo Matos Santoro / Resumo: A influência de ânions sobre as características estruturais e funcionais de hemoglobinas (Hb) vem sendo alvo de pesquisas de nosso laboratório nos últimos anos. Estudos anteriores mostraram que a ligação preferencial de ânions como o Cl- e fosfatos orgânicos (2,3-DPG, IHP) entre outros à desoxi-Hb humana (HbA), modula o equilíbrio entre dois estados alostéricos desoxigenados possíveis, estados To e Tx, livre e complexado com ânions, respectivamente. Medidas funcionais utilizando o método de estresse osmótico, que determina o número de moléculas de água que se liga a superfície da Hb, acompanhando a oxigenação, mostraram que o estado To é um estado com hidratação e afinidade ao oxigênio intermediárias ao Tx e ao oxi-R. Assim, a oxigenação da Hb demanda um modelo considerando estes três estados, To, Tx e R, modulados pela presença de ânions em solução. O íon cloreto é um dos ânions de maior importância fisiológica. A presença de sítios específicos para sua ligação, bem como seu sistema de ligação para a Hb, contudo, são controversos. Evidências estruturais e funcionais apontaram os resíduos arginina 141 e 92 da cadeia alfa como possíveis sítios de ligação de cloreto à Hb. Para investigar essa hipótese, realizamos estudos funcionais variando atividade de água e pH (efeito Bohr), em função da presença de cloreto com hemoglobinas mutantes para essas posições. As hemoglobinas selecionadas foram Chesapeake (R92L), J-Cape Town (R92Q), desArg (141Δ) e Chesapeake desArg (R92L,141Δ). Aspectos estruturais dessas Hbs foram obtidos através de espectroscopia 1H RMN. Todas as Hbs estudadas apresentaram afinidade maior ao oxigênio quando comparadas à HbA, para todas as condições experimentais. Estudos de variação da atividade de água em função da concentração de cloreto mostraram que a única... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The influence of anions on structural and functional properties of hemoglobins (Hb) has been studied by our research group for the last few years. Former studies have shown that the preferential binding of anions, such as Cl and organic phosphates (2,3-DPG, IHP) among others to human deoxy-Hb (HbA), modulates the equilibrium between two possible deoxy states: To and Tx, free and complexed with anions respectively. Functional measurements using the osmotic stress method, which allows the determination of the number of water molecules that binds to the protein surface upon the change in protein conformation induced by oxygenation, showed that To state has intrinsic affinity and hydration intermediate of those of Tx and oxy-R . Hence, Hb oxygenation requires a three state model, considering To, Tx and R, modulated by the presence of anions in solution. Chloride is one of the most important physiological ions and the presence of specific binding sites of this anions is controversial. Structural and functional evidence have pointed to Arginines 141 and 92 as possible binding sites for chloride to Hb. To investigate this hypothesis, we have performed functional studies, changing the water activity and pH (Bohr effect), in function of chloride concentration with recombinants Hbs for these positions. The selected hemoglobins are Chesapeake (R92L), J-Cape Town (R92Q), desArg (141Δ) eandChesapeake desArg (R92L,141Δ). Structural features were obtained through 1H NMR spectroscopy. All Hbs studied have higher affinity than HbA for all experimental conditions. Water activity studies in function of chloride concentration showed that the only Hb that can be adjusted with the three state model is Hb desArg, whereas the other Hbs don't present the Tx state, fact confirmed by the number of water molecules bound to each... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Patrícia Caetano de Souza / Banca: Luiz Henrique Florindo / Resumo: A Glutationa (GSH) é um tripeptídeo presente nas células, que em sua forma reduzida age como antioxidante, mantendo os grupamentos tiólicos nas proteínas em estado reduzido. Ao exercer função protetora, a glutationa é oxidada para sua forma dissulfeto, expondo quatro cargas negativas. A glutationa oxidada (GSSG) poderia interagir não covalentemente com moléculas capazes de ligar ânions, como a hemoglobina. Essa condição nos levou a investigar as possíveis mudanças estruturais e funcionais das hemoglobinas bovina, humana e majoritária do peixe matrinxã (Brycon cephalus) quando interagem alostericamente com a glutationa. As amostras de sangue bovina e humana foram purificadas e submetidas à eletroforese para verificação de pureza. As propriedades de ligação com oxigênio e controle alostérico foram analisados por tonometria a 20°C, calculando a afinidade de ligação com o O2 e a cooperatividade (n50). As condições experimentais adotadas foram, stripped, cloreto e glutationa oxidada (GSSG), nessas condições, as hemoglobinas bovina e humana apresentaram efeito Bohr alcalino. O cloreto induziu o maior efeito de diminuição da afinidade em praticamente todas as condições. As hemoglobinas apresentaram processo cooperativo de ligação de oxigênio, em todas as condições e em toda faixa de pH. No caso da hemoglobina bovina adulta, a GSSG aumentou a afinidade por O2, em toda a faixa de pH testada, enquanto para a humana isso ocorreu abaixo de pH 7,0. O cloreto capaz de diminuir a afinidade de forma efetiva em todas as condições. A hemoglobina bovina apresentou uma menor afinidade de ligação ao oxigênio em relação à hemoglobina humana. A glutationa oxidada atuou como efetor alostérico heterotrópico em hemoglobinas humana, bovina e matrinxã (Hb-II), aumentando a afinidade de ligação por oxigênio da hemoglobina. Entretanto, a glutationa na forma reduzida... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glutathione (GSH) is an intracellular tripeptide, which in its reduced form acts as an antioxidant, keeping the cysteines in the reduced state. When exerting protective function, glutathione is oxidized to form its disulfide, exposing four negative charges. The oxidized glutathione (GSSG) could interact with molecules covalently able to bind anions, such as hemoglobin. That motivated us to investigate the possible structural and functional changes of bovine, human and a fish hemoglobin from the fish 'matrinxã' (Brycon cephalus) when they interact allosterically with glutathione. Samples of human and cattle blood were purified and subject to electrophoresis to verify their purity. The functional properties of oxygen binding and allosteric control were analyzed by the tonometric method at 20°C, calculating the affinity of O2-binding and cooperativity (n50). The tested experimental conditions involved hemoglobin in the absence (stripped) and in the presence of chloride and oxidized glutathione (GSSG). Under those circumstances, the human and bovine hemoglobins displayed an alkaline Bohr effect. Chloride induced the greatest effect of reducing affinity in all conditions. For all the experimental sets oxygen binding was cooperative. For bovine adult hemoglobin GSSG increased O2-affinity for all the tested pH values, whereas it occurred for human Hb for pH values above 7.0. Bovine Hb displayed lower O2-affinity than its human counterpart. Oxidized glutahione acted as a heterotropic allosteric effector in all the tested hemoglobins, increasing O2-affinity. However, GSH decreased O2-affinity of human and bovine Hbs. We assume that there is a binding site for GSSG at the R state, increasing O2-affinity, and another one for GSH at the T state, stabilizing its conformation and therefore lowering O2-affinity. / Mestre

Orientador: Marinônio Lopes Cornélio / Banca: José Roberto Ruggiero / Banca: Luis Paulo Barbour Scott / Resumo: O α-tocoferol é a principal dentre as moléculas que desempenham o papel biológico de vitamina E, sendo a que apresenta maior biodisponibilidade e atividade. Além dos papéis como vitamina, o α-tocoferol tem diversas funções no organismo incluindo a inibição de proteínas da família PLA2. Esse trabalho apresenta a análise vibracional do α-tocoferol inteiro no vácuo seguido pela otimização geométrica da molécula em ambiente protéico. O estudo do tocoferol no vácuo foi realizado dentro do formalismo do DFT usando o funcional de correlação-troca B3LYP e a base de funções 6-311G**. A análise vibracional foi realizada em um programa desenvolvido pelo autor. Em ambiente protéico, o processo foi dividido em duas etapas: a otimização geométrica do sistema inteiro no formalismo da dinâmica molecular e a otimização somente do ligante e de um envelope protéico em DFT. Por dificuldades computacionais não foi possível a análise vibracional do sistema. / Abstract: The α-tocopherol is the most important molecule which has the biological role of vitamin E, having the greatest biodisponibility and activity. Besides its vitamin roles, the α- tocopherol has many functions in organisms including the inhibition of proteins of the PLA2 family. This work presents the vibrational analysis of the whole α-tocoferol in vacuum followed by the geometric optimization of the molecule in protein environment. The study of tocopherol in vacuum was done in the DFT framework using the B3LYP exchangecorrelation functional with the 6-311G** function basis and the vibrational analysis was done by a program developed by the author. The process was divided in two steps for the study in protein environment: the geometrical optimization of the whole system in the molecular dynamics framework and the optimization of the ligand and a protein envelope in DFT. Due to computational troubles it was not possible to perform the vibrational analysis of this system. / Mestre

Resumo: Esta tese tem como foco o estudo estrutural de uma lectina presente em sementes da espécie vegetal Lotus tetragonolobus (LTA). Inicialmente a LTA, previamente purificada, foi cristalizada. Os cristais foram obtidos a uma temperatura constante de 20ºC, durante 30 dias, utilizando a técnica de cristalização por difusão de vapor. Dois conjuntos de dados foram coletados a 2.00 e 2.35 Å de resolução, através da fonte de Raios X do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas - Brasil). Os cristais são monoclínicos e apresentam simetria do tipo P21, com parâmetros de cela de a=68.89, b=65.83 e c=102.53 Å. A substituição molecular foi feita utilizando-se o monômero da lectina presente na espécie Arachis Hypogae (Peanut). O homotetrâmero, produto da substituição, foi utilizado como ponto de partida para o refinamento cristalográfico. Diversos ciclos de refinamento por satisfação das restrições parciais foram feitos até a conversão total para valores satisfatórios de Rfree e Rfactor. A análise da estrutura revelou que a LTA possui uma forma tetramérica não identificada dentre outras lectinas de leguminosas. Sua estrutura é composta por dois dímeros, um deles semelhante ao dímero GS4 presente na lectina de Griffonia simplicifolia e outro que é único, caracterizado por ser um dímero do tipo LTA-dímero. Diversos fatores são responsáveis pela forma de tetramerização diferenciada da LTA, dentre os quais podemos destacar a influência da glicosilação no resíduo ASN4. Para investigarmos a estrutura da LTA em meio aquoso foi utilizada a técnica de espalhamento de Raios X a baixo ângulo (SAXS), que mostrou que a LTA possui a mesma forma tetramérica em solução da que foi observada no retículo cristalino... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The lectin, LTA, an agglutinin found in Lotus tetragonolobus seeds have been crystalized. Crystals grew at a temperature of 20º C during a month and were obtained using the vapor diffusion method. Two data sets were collected at 2.00 and 2.35 Å resolution using a sincrotron radiation source at Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (Campinas - Brasil). The LTA crystals are monoclinic belonging to the P21 space group with a=68.89, b=65.83 and c=102.53 Å. The Molecular replacement was performed using the Arachis Hypogae lectin monomer (Peanut) that yielded an homotetramer which was used to initiate the crystallographic refinement. Several steps of restrained refinement were performed to obtain the best values for Rfree and Rfactor. Structural analysis of the LTA showed that its tetramer adopts a new structural oligomerization in contrast of that observed for others legume lectins. Its structure contains two GS4-like dimers disposed in an unusual dimer-interface, named as LTA-dimer. Several properties are involved in the new mode of tetramerization adopted for LTA, which includes the glycosilation at ASN4. The LTA tetramer investigation at aqueous solution was perfomed by Small Angle XRay Scattering (SAXS), showing that LTA behaves as a tetramer in solution which corroborates with the crystalline structure. Our investigations suggest that the L-fucose binding sites of LTA are disposed in a conformation that permits to perform two dimensional type-2 cross-linking interaction with divalent L-fucosyloligosaccharides. / Orientador: Walter Filgueira de Azevedo Junior / Coorientador: Valmir Fadel / Banca: Fernanda Canduri / Banca: José Márcio Machado / Banca: Paulo Sérgio Lopes de Oliveira / Banca: José Ramon Beltran Abrego / Doutor

Orientador: Fernando Luís Barroso da Silva / Banca: Laurent Emmanuel Dardenne / Banca: Marco Antonio Alves da Silva / Banca: José Roberto Ruggiero / Banca: Marcio José Tiera / Resumo: O entendimento da formação de complexos compostos por polieletrólitos e macroíons é fundamental para o estudo de vários processos biológicos e tecnológicos. Neste trabalho foram investigados os aspectos eletrostásticos da complexação, verificando os efeitos da força iônica, da carga macromolecular e do grau de polimerização do políımero na estabilidade do complexo e nas características conformacionais da cadeia. Com o objetivo de obter conclusões gerais para este tipo de sistema, um modelo simplificado foi utilizado. O políımero foi representado por um conjunto de esferas ríıgidas carregadas conectadas por um potencial harmônico, enquanto o macroíıon seguiu um modelo esférico com distribuição de carga homogênea. A interação entre as espécies carregadas foi tratada de acordo com a aproximação de Debye-H¨uckel. Utilizando simulaçãoes Monte Carlo no ensemble canônico, verificou-se que a dissociação do complexo possui características de transição de fase. Condições críticas foram obtidas em concordância com o comportamento observado empiricamente. Resultados da interação de polieletrólitos com proteínas no seu ponto isoelétrico mostraram que a contribuição devido apenas a regulação de carga é suficiente para estabilizar o complexo e pode ser aumentada através de mutações que diminuam a heterogeneidade de carga da proteína. / Abstract: The understanding of macroíon-polielectrolyte complex formation is fundamental for the biological and technological process studies. In this work the electrostatic issues on the complexation were investigated, verifying the effects of ionic strenght, macromolecular charge, and degree of polimerization on the complex stability and the chain conformational features. With the purpose of obtain general conclusions for this system, a simplified model was adopted. The polymer was represented by a set of rigid charged spheres connected by a harmonic potential, and the macroion was represented by a rigid sphere with homogeneous charge distribution. The interaction among macromolecules was described by the Debye-H¨uckel theory. Using Monte Carlo simulations within the canonical ensemble, it was verified that complex dissociation has phase-like transition behaviour. Numerical values for critical conditions were obtained in agreement with the ones experimentally observed. Results of interaction among polyeletrolyte and proteins on their isoelectric point showed that the charge regulation contribuition only is sufficient to make the complex stable. Is is also shown that charge regulation contribution is increased by mutations which promote a lower protein charge density heterogenity. 14 / Doutor