Contribuant à la pathophysiologie des maladies vasculaires comme dans le cas de l’hypertension, le remodelage vasculaire est associé à une altération de la croissance des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) (prolifération, taille, etc.). Or la prolifération des CMLV est augmentée par les peptides vasoactifs tels que l’angiotensine II (AngII) et l’endothéline-1 (ET-1). Ces peptides étant surexprimés lors de l’hypertension, cette étude fut entreprise pour déterminer leur contribution endogène ainsi que celles du facteur de croissance épidermique (EGF), du facteur de croissance insulinique (IGF-1) et du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) à la prolifération accrue des CMLV et aux mécanismes sous-jacents. Des CMLV A-10 et des CMLV de rats WKY et SHR âgés de 12 semaines ont été utilisées pour cette étude. La prolifération cellulaire fut déterminée par incorporation de [3H]thymidine. La phosphorylation de ERK 1/2 et du récepteur de EGF fut déterminée par immunobuvardage. Les CMLV de SHR, comparées à celles de WKY, ont montré une prolifération accrue qui fut atténuée par le losartan, un antagoniste du récepteur AT1 de l’AngII et par le BQ-123 et le BQ-788, antagonistes des récepteurs ETA et ETB de l’ET-1. La prolifération accrue des CMLV de SHR fut ramenée à celle des WKY par les inhibiteurs des récepteurs au PDGF (AG-1295), au IGF-1 (AG-1024) et au EGF (AG-1478). La phosphorylation du récepteur au EGF, accrue dans les CMLV de rats SHR comparée à celle des WKY, fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et l’AG-1478, mais ne fut pas atténuée par l’AG-1295 et l’AG-1024. De plus, la phosphorylation accrue de ERK 1/2 dans les CMLV de rats SHR fut atténuée par le losartan, le BQ-123, le BQ-788 et les inhibiteurs des récepteurs aux facteurs de croissance. Parallèlement, le rôle de la transactivation de EGF-R dans la prolifération accrue induite par AngII et ET-1 fut aussi examiné dans les CMLV A-10. L’augmentation, induite par AngII et ET-1, de la prolifération et de la phosphorylation de ERK 1/2 dans les CMLV A-10 fut ramenée au niveau contrôle par AG-1478. Ces données suggèrent que les peptides vasoactifs endogènes induisent la prolifération accrue des CMLV par la signalisation des MAP kinases résultant de la transactivation de EGF-R. / Vascular remodelling that contributes to the pathophysiology of vascular diseases, including hypertension, is associated with alteration in vascular smooth muscle cell (VSMC) growth, hypertrophy, etc. We have recently shown that vasoactive peptides such as angiotensin II (AngII) and endothelin-1 (ET-1) increased the proliferation of VSMC. Since the levels of AngII, ET-1 and growth factors are increased in hypertension, the present studies were undertaken to examine if these endogenous vasoactive peptides and growth factors contribute to the enhanced proliferation of VSMC in spontaneously hypertensive rats (SHR) and to further investigate the underlying mechanisms responsible for enhanced proliferation. A10 VSMC and aortic VSMC from 12 week old SHR and age-matched WKY rats were used for these studies. Cell proliferation was determined by [3H]thymidine incorporation and ERK ½ and growth factor receptor phosphorylation was determined by Western blotting. VSMC from SHR exhibited enhanced cell proliferation as compared to WKY as determined by enhanced [3H]thymidine incorporation which was attenuated by AngII AT1 receptor antagonist losartan, as well as by endothelin receptor ETA and ETB antagonists BQ-123 and BQ-788, respectively. The inhibitors of platelet derived growth factor receptor (PDGF-R); AG-1295, epidermal growth factor receptor (EGF-R); AG-1478, and insulin-like growth factor receptor (IGF-R); AG-1024 also attenuated the enhanced proliferation of VSMC from SHR to WKY control levels. In addition, VSMC from SHR exhibited enhanced phosphorylation of EGF-R as compared to WKY, which was attenuated by losartan, BQ-123, BQ-788 and AG-1478, and not by AG-1295 and AG-1024. Furthermore, the enhanced phosphorylation of ERK ½ in VSMC from SHR was also attenuated by losartan, BQ-123 and BQ-788 as well as by growth factor receptor inhibitors, AG-1478, AG-1024 and AG-1295. The implication of growth factor receptor transactivation in AngII and ET-1 induced enhanced cell proliferation was also examined in A10 VSMC. Ang II or ET-1 induced enhanced proliferation of A-10 VSMC and enhanced ERK ½ phosphorylation was also restored to control levels by EGF-R inhibitor. These data suggest that vasoactive peptide-induced growth factor receptor transactivation through MAP kinase signaling may contribute to the enhanced proliferation of VSMC from SHR.

Les évènements moléculaires en amont et en aval de la petite GTPase Rac1 menant à la migration cellulaire sont encore mal compris. La première partie du projet consiste à utiliser une approche protéomique non-biaisée pour tenter d’identifier les partenaires de Rac. Pour ce faire, nous avons développé une méthode de purification efficace et rapide de manière à maintenir les complexes protéiques transitoires intacts. Dans un deuxième temps, nous avons identifié des sites de phosphorylation sur la RacGEF atypique Dock5 en aval des intégrines. Afin de mieux comprendre le rôle de la phosphorylation de cette protéine, nous avons criblé une banque de kinases ce qui nous a permis d’identifier 14 kinases pouvant phosphoryler la région PXXP de Dock5. D’après nos résultats, ceci aurait comme effet de diminuer l’interaction entre Dock5 et ses partenaires contenant des domaines SH3. Ainsi, la phosphorylation de Dock5 régulerait la formation de complexes et le recrutement de Dock5 par des protéines adaptatrices. / The molecular events upstream and downstream of Rac leading to cell migration and still to date not fully understood allthough more than 20 effectors have been identified for this GTPase. The first part of our project is to use a non-biased proteomic approach to try to identify novel binding partners of Rac1. In order to do so, we developped a novel purification strategy that enabled us to purify Rac and its binding partners in a timely manner. The second part of our project is to understand the role of Dock5 phosphorylation downstream of the integrins. We identified phosphorylated residues in the PXXP region of the atypical RacGEF upon fibronectin stimulation and found 14 kinases able to phosphorylate this region. According to our results, Dock5 phosphorylation does not affect its GEF activity but diminishes its interaction with various SH3 domain-containing proteins. Thus, our data suggest that Dock5 phosphorylation would regulate complex formation and recruitment of this protein by adaptor proteins.

Le facteur d'initiation de la traduction chez les eukaryotes eIF4E (4E) est un puissant oncogène en raison de sa capacité à faciliter l'export et/ou la traduction de certains transcripts, dont beaucoup sont eux-mêmes des oncogènes. 4E intéragit avec un grand nombre de protéines régulatrices dont la protéine 4E-T (pour 4E-Transporter). La capacité de 4E-T à modifier la localisation subcellulaire de 4E pourrait offrir un mécanisme permettant de modifier le potentiel oncogène d'une cellule. La surexpression de 4E-T dans des cellules d'ostéosarcome conduit à l’augmentation du nombre et de la taille des P-bodies, dans lesquels 4E colocalisent avec 4E-T mais pas avec la version tronquée 4E-T/Y30A. Cependant, les différentes expériences menées, permettant d’analyser les taux de transcription, la quantité de protéine, les profiles polysomiques ainsi que la distribution nucléo-cytoplasmique, montrent que la surexpression de 4E-T n'a pas d'effet sur la fonction de 4E. L'observation d’un enrichissement cytoplasmique et d’une charge réduite de ribosomes sur les transcripts codant les protéines cycline D1 et ODC (profile polysomique) dans la lignée 4E-T suggère un role de 4E-T dans la séquestration cytoplasmique de certains transcrips par un mécanisme qui reste encore à déterminer. / The eukaryotic translation initation factor eIF4E (4E) is a potent oncogene due to its ability to facilitate export and/or translation of certain transcripts, many of which are, themselves, oncogenes. 4E has many protein-binding partners including the 4E transporter protein (4ET). The ability to alter the subcellular localization of 4E via 4E-T could offer a mechanism by which to alter the oncogenic potential of a cell. Overexpression of 4E-T in osteosarcoma cells leads to formation of larger and more numerous P-bodies that can effectively colocalize with 4E than either a vector control (E) or a less efficient 4E-binding version of 4E-T (Y30A). However, the overexpression of 4E-T did not affect the 4E’s function as determined by examining global levels of transcription, polysome profile, cytoplasmic/nuclear distribution, or protein levels of most of the transcripts tested. The observation that there was cytoplasmic enrichment and reduced loading of ribosomes on cyclin D1 and ODC transcripts (polysome profile) in the 4ET line suggests a possible 4ETmediated cytoplasmic sequestration of certain transcripts by an as yet to be determined mechanism.

PHEX est une protéine importante dans le processus de minéralisation osseuse. Des mutations ou la délétion d’une partie de ce gène causent l’hypophosphatémie liée au chromosome X (XLH). Cette maladie est caractérisée par une hypophosphatémie, accompagnée de défauts de minéralisation, de rachitisme et de lésions ostéomalaciques. Avec l’hypophosphatémie, les taux circulants de vitamine D devraient être augmentés, ce qui n’est pas le cas d’où une régulation anormale de la production de vitamine D a lieu. Cependant, malgré le fait que cette protéine soit une peptidase, aucun substrat physiologique n’a encore été répertorié pour PHEX. PHEX est une protéine membranaire de type II de la famille M13 des métalloendopeptidases à zinc possédant un court domaine N-terminal cytosolique, un segment transmembrannaire d’environ 20 acides aminés et une large portion C-terminale extracellulaire où se trouve le site actif de l’enzyme. PHEX est exprimée de façon majoritaire dans les os et dans les dents et elle apparaît à l’initiation de la minéralisation. Les patients souffrant de XLH et la souris Hyp, qui est un modèle animal de la maladie humaine, montrent des quantités importantes de la protéine FGF23. De plus, FGF23 est impliqué dans une autre maladie reliée au métabolisme du phosphate, l’hypophosphatémie rachitique autosomale dominante (ADHR) où des mutations de FGF23 causent sensiblement les mêmes symptômes que XLH. FGF23 est produit principalement par les ostéoblastes et les ostéocytes. FGF23 cause une hypophosphatémie par la diminution de l’expression du cotransporteur NaPi de type II, responsable de la réabsorption du phosphate rénal. L’hypothèse proposée dans la littérature serait que PHEX activerait ou inactiverait des peptides importants pour la minéralisation osseuse. Plus spécifiquement, l’activation ou l’inactivation de ces peptides aurait pour rôle de réguler les quantités de FGF23. Selon l’hypothèse mentionnée précédemment, la régulation de PHEX pourrait donc avoir un effet sur la minéralisation. Une quantité croissante de données sur la régulation de PHEX sont maintenant disponibles. Par exemple, la vitamine D diminue l’expression de PHEX tandis que les glucocorticoïdes et l’hormone de croissance augmentent son expression. Dans une première étude, nous avons voulu déterminer si un peptide relié à la minéralisation osseuse, le PTHrP1-34, pouvait réguler l’expression de PHEX. Nous avons déterminé que le PTHrP1-34 peut réguler de façon négative l’expression de PHEX dans les cellules UMR-106, une lignée cellulaire ostéoblastique. Cette régulation passe par la voie de l’AMPc/protéine kinase A. De plus, cette diminution d’expression est également observée au jour 7 dans des cultures primaires d’ostéoblastes de rat en minéralisation. Par la suite, nous avons étudié un mutant de PHEX, le mutant E4Q retrouvé chez un patient souffrant de XLH, où la mutation se retrouve dans le domaine cytosolique de PHEX. Cette mutation n’interfère pas avec le site catalytique de l’enzyme puisque ce mutant de PHEX peut tout aussi bien cliver un substrat synthétique que la protéine sauvage. Il a été déterminé que cette mutation annule un motif di-acide. Nous avons démontré que ce motif di-acide est responsable de la liaison de PHEX à COPII, responsable de la formation de vésicules de sécrétion. De plus, il semblerait que ce motif soit important, probablement par son interaction avec COPII, à l’incorporation de PHEX dans des vésicules de calcification, lesdites vésicules étant importantes dans le processus de minéralisation. Finalement, des essais de compétitions ont démontré que la minéralisation pouvait être perturbée lorsque l’on surexprimait la queue cytosolique sauvage de PHEX, contrairement à la queue mutée. Ceci suggère possiblement que l’interaction avec COPII menant à l’incorporation de PHEX dans les vésicules de calcification ou d’autres protéines comprenant de tels motifs pourrait être importante pour la minéralisation. Finalement, la dernière étude porte sur la protéine FGF23. Nous avons démontré, par la surexpression de FGF23 dans la lignée MC3T3 d’ostéoblastes de souris, que cette surexpression a un effet sur la sénescence de ces cellules. En effet, des essais de sénescence ont montré l’augmentation de celle-ci lorsque FGF23 est surexprimé. Par contre, la prolifération n’est pas altérée. De plus, il semblerait que la différenciation soit plus rapide, tel qu’observé par une minéralisation survenant plus tôt, mais n’étant pas plus importante. Bref, la surexpression de FGF23 semblerait faire en sorte que les ostéoblastes se différencient plus rapidement et passent donc à un état de sénescence prématuré comparativement aux cellules sauvages. Ceci est en accord avec la littérature où KLOTHO, un cofacteur de FGF23 permettant sa liaison avec une plus grande affinité sur son récepteur, lorsqu’inactivé démontre un phénotype similaire au vieillissement incluant un phénotype de sénescence. / PHEX is an important protein in the process of osseous mineralisation. Mutations or deletions of a part of the PHEX gene cause X-linked hypophosphatemia (XLH). This disease is characterized by hypophosphatemia, accompanied by defects of bone mineralisation, rickets and osteomalacia. With the hypophosphatemia, the circulating levels of vitamin D should be increased, which is not the case where an abnormal regulation of the production of vitamin D takes place. However, in spite of the fact that this protein is a peptidase, no physiological substrate has been identified. PHEX is a membrane type II integral protein member of the M13 family of zinc metalloendopeptidasee. These proteins have a short N-terminal cytosolic domain, a transmembrane domain of approximately 20 amino acids and a large extracellular C-terminal portion where the active site of the enzyme is located. PHEX is expressed predominantly in bones and teeth in osteoblasts and odontoblasts, respectively. PHEX is expressed at initiation of mineralization. Patients suffering from XLH and the Hyp mouse, which has been used widely as an animal model of the human disease, show large quantities of the FGF23 protein. Moreover, FGF23 is implicated in another disease connected to phosphate metabolism, the autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) where activating mutations in FGF23 cause roughly the same symptoms as XLH. FGF23 is produced mainly by osteoblasts and osteocytes. FGF23 causes hypophosphatemia by decreasing the expression of the type II sodium phosphate cotransportor, partly responsible for renal phosphate reabsorption. The hypothesis suggested in the literature would be that PHEX would activate or inactivate important peptides for osseous mineralisation. More specifically, the activation or the inactivation of these peptides would have a role in the control of FGF23 expression. According to the assumption mentioned previously, the regulation of PHEX could thus have an effect on mineralization. An increasing quantity of data on the regulation of PHEX is now available. For example, vitamin D decreases the expression of PHEX while glucocorticoids and growth hormone increase its expression. In a first study, we examined the possibility that a peptide connected to osseous mineralization could control the expression of PHEX. We determined that PTHrP1-34 can control in a negative way the expression of PHEX in UMR-106 cells, a cell line of osteoblastic origin. This regulation involves the cAMP/protein kinase A pathway. Moreover, this decrease in PHEX expression is also observed at day 7 in primary cultures of mineralizing rat osteoblasts. Next, we looked more closely at PHEX cellular localization. We used a mutant of PHEX, mutant E4Q identified in an XLH patient, where the mutated amino acid is found in the cytosolic domain of PHEX. This change does not interfere with the catalytic site of the enzyme since this PHEX mutant can still cleave a synthetic substrate as well as wildtype protein. This mutation disrupts a di-acidic motif present in the cytosolic domain of PHEX. We showed that this di-acidic motif is reponsible for the interaction of PHEX with COPII, a protein complex involved in the formation of secretion vesicles. Moreover, it would seem that this di-acidic motif is important, probably by its interaction with COPII, to the incorporation of PHEX in matrix vesicles, which are important in the mineralization process. Finally, competition assays showed that mineralization could be disturbed when the wildtype PHEX cytosolic tail is overexpressed, as opposed with the mutated cytosolic tail. This suggests that the interaction with COPII and the subsequent incorporation of PHEX in matrix vesicles or other proteins that possesses this motif could be important for mineralization. Finally, the last study examined the role of FGF23 on mineralization. We showed, by the overexpression of FGF23 in the mouse MC3T3 osteoblast cell line, that FGF23 can cause senescence of these cells. On the other hand, proliferation is not affected. Moreover, differentiation seems to occur at a faster rate, as indicated by earlier mineralization. Overexpression of FGF23 would accelerate differentiation and induce senescence. This is in agreement with the literature where KLOTHO, a FGF23 cofactor that increase the affinity of FGF23 for its receptor, when inactivated, shows a similar phenotype that includes senescence and aging.

La protéine Nef du VIH-1 joue un rôle important dans la pathogenèse du VIH-1 en modulant les voies de signalisation de la cellule hôte. La signalisation par le TcR est essentielle à la sélection positive pour générer les cellules simples positives (SP) CD4+ et simples positives (SP) CD8+, processus largement dépendant de l’activité de la Src kinase Lck et de son habileté à lier la queue cytoplasmique des corécepteurs CD4 et CD8. Nous avons précédemment trouvé que l’expression de Nef dans le VIH ou VIS peut induire une sévère déplétion des thymocytes et une baisse d’expression du corécepteur CD4 à la membrane. Nous avons également montré que Nef bloque la génération des thymocytes doubles positifs (DP) CD4+ CD8+ en plus d’altérer la transition des cellules DP vers CD4+ SP. Par contre, ce phénotype est récupérable par plusieurs approches dont le croisement d’une souris transgéniques exprimant Nef avec une souris exprimant la forme constitutivement active de Lck Y505F. Les résultats indiquent que la maturation des cellules CD4+ est altérée par le dysfonctionnement de la signalisation CD4-Lck. Toutefois, les mécanismes moléculaires par lesquels Nef contribue au bloc de la génération des cellules CD4+ dans le thymus demeurent très imprécis. Dans cette étude, en utilisant des approches biochimiques et de microscopie confocale, nous avons trouvé que les thymocytes transgéniques Nef+ expriment plus de Lck que les thymocytes Nef-. Malgré cette augmentation, une partie significative de Lck est incapable d’atteindre la membrane plasmique. Cette fraction était significativement accumulée dans un compartiment intracellulaire des thymocytes transgéniques exprimant Nef. Également, en utilisant la technique d’essai kinase in vitro, nous avons trouvé que l’activité kinase de Lck est significativement augmentée dans les thymocytes transgéniques mais demeure stable suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4. Également, comparativement aux thymocytes Nef-, la kinase Lck dans les thymocytes transgéniques était résistante à la dégradation suite à une stimulation. En examinant le statut de c-Cbl, le principal régulateur négatif de Lck, nous avons montré que c-Cbl colocalise faiblement avec Lck, malgré son hyperphosphorylation constitutive. Ceci pourrait expliquer l’échec de la dégradation de Lck. En plus, nous avons trouvé que suite à une stimulation par un α-CD3ε + α-CD4, la phosphorylation de Zap-70 en tyrosine 493 par Lck est diminuée, résultant d’une importante baisse de l’activité kinase de Zap-70 et d’un bloc des premiers évènements de la voie de signalisation par le TcR. Ces données indiquent que la signalisation CD4-Lck est interrompue par la présence de Nef. / HIV-1 Nef protein plays an essential role in the HIV-1 pathogenesis by modulating the host signaling transduction pathways. TcR signalling is important for the thymic selection process to CD4 and CD8 single positive T cells and is greatly dependent on the activity of Src kinase Lck and its ability to bind to CD4 and CD8 cytoplasmic tail. We previously found that expression of HIV or SIV Nef can induce severe thymocytes depletion and downregulation of CD4 expression in Nef+ mice. We also recently showed that Nef blocks generation of double positive thymocytes and impairs DP to CD4+ SP T cells transition. The reversal of this phenotype was accomplished by several approaches, among them by crossing Nef+ mice with mice expressing constitutively active Lck Y505F. These results imply that the maturation of CD4+ T cells is disrupted due to impairment of Lck-mediated CD4 receptor signaling. However, the molecular mechanisms by which Nef contributes to the impairment in thymic CD4 generation remains largely unclear. In this study, using confocal microscopy and biochemical approaches, we found that Nef+ thymocytes express more Lck than the Nef- control. Despite of this increase, a significant portion of Lck molecules were unable to reach to the plasma membrane. It was significantly accumulated in the intracellular endosomal compartment of the Nef+ thymocytes. Moreover, using IVKA we found that the activity of Lck is significantly increased in Nef+ thymocytes but was not further increased upon stimulation by α-CD3ε, α-CD4 or α-CD3ε + α-CD4. Moreover, compared to Nef- controls, Lck kinase in Nef+ thymocytes was resistant to degradation upon stimulation. Examining the status of c-Cbl, the main negative regulator of Lck, showed that c-Cbl localized with Lck poorly, despite his constitutive hyperphosphorylation. This explains the failure of Lck degradation. In addition, we found that upon stimulation, Zap-70 phosphorylation at tyrosine 493 by Lck is decreased, resulting by a decrease of Zap-70 kinase activity and TcR proximal event block. These data indicate that CD4-Lck signaling was interrupted by the presence of Nef.

La perméabilité vasculaire est une caractéristique cruciale de l’angiogenèse. Les acteurs principaux sont les cellules endothéliales qui la régulent en réponse à divers facteurs perméabilisant, tels que le « Vascular Endothelial Growth Factor » (VEGF). Dans le contexte pathologique du cancer, les cellules tumorales produisent de grandes quantités de VEGF qui stimulent la perméabilité, ce qui leur permet d’infiltrer le réseau vasculaire. Il est connu que la tyrosine kinase Src contrôle cette modulation de la perméabilité. Puisque notre laboratoire a préalablement démontré que la phosphatase de type récepteur (PTP) DEP-1 est impliquée dans l’activation de Src en réponse au VEGF, nous avons émis l'hypothèse que DEP-1 pourrait aussi jouer un rôle dans la perméabilité des cellules endothéliales. Grâce à des expériences de transfections d’ARN interférant, nous démontrons que DEP-1 est important pour la régulation de la phosphorylation de la VE-Cadhérine, un médiateur critique de la perméabilité. L’impact de DEP-1 sur la dissociation de jonctions intercellulaires est également démontré par microscopie à immunofluorescence de cellules endothéliales. DEP-1 est également nécessaire à l’augmentation de la perméabilité induite par VEGF in vitro. Deux résidus tyrosine retrouvés dans la queue carboxy-terminale de DEP-1 sont essentiels à l’activation de Src en réponse au VEGF. Suite à la transfection d’un plasmide encodant DEP-1 muté pour ces deux résidus, nous démontrons aussi leur implication dans la régulation de la perméabilité in vitro par DEP-1. Ces travaux permettent ainsi d’approfondir nos connaissances sur un nouveau régulateur potentiel de la perméabilité vasculaire. / Endothelial cell permeability is a crucial step of angiogenesis. The main actors behind permeability are endothelial cells who accomplish this in response to permeabilizing factors, most notably Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF). In a pathological context, migrating tumor cells produce great quantities of VEGF that stimulate an increase of vascular permeability, which allows them to intravasate into the vasculature. Src has been shown to mediate this process. Our laboratory has previously shown that the protein tyrosine phosphatase DEP-1 is involved in the regulation of VEGF-dependant activation of Src. These data thus suggested that DEP-1 might play a role in endothelial cell permeability. Here, we show through siRNA experiments that DEP-1 is important for the regulatory phosphorylation of VE-Cadherin which is critical for the induction of permeability. The impact of DEP-1 on intercellular junction dissociation is also demonstrated through immunofluorescence microscopy of endothelial cells. We further show that DEP-1 is absolutely required for the VEGF-dependent increase of permeability as illustrated by in vitro permeability assay on siRNA-transfected endothelial cells. Finally, we show that tyrosine residues in DEP-1’s carboxy-terminal tail, which are crucial for mediating Src activity in response to VEGF, are implicated in VEGF-dependant increase in permeability by transfecting plasmids coding for DEP-1 mutants of these tyrosine residues. These findings shed light on a novel potential key regulator of in vivo permeability.

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Les capacités de guérison humaine étant limitées et grandement associées à la fibrose, la possibilité de régénérer tous tissus contribueraient grandement à l’amélioration de la santé des patients. Dans le cadre de ce projet de doctorat, nous avons publié un article montrant les limitations de certains modèles de recherche en ce qui a trait à la guérison des plaies. Ces limitations sont d’autant plus importantes lorsque la recherche traite de régénération tissulaire. Aussi, cette publication positionne l’axolotl (Ambystoma mexicanum) comme un excellent modèle pour étudier le processus de régénération épimorphique ainsi que l’importance de la signalisation TGF-β. La cytokine multifonctionnelle TGF-β est impliquée dans la guérison, l’induction des cicatrices, la différenciation, la croissance et la migration cellulaire. Cette cytokine est responsable de la guérison quasi parfaite des muqueuses buccales chez les mammifères, mais est aussi liée à la cicatrisation de plusieurs autres types tissulaires. La famille des TGF-β est aussi impliquée dans la régénération épimorphique chez l’échinoderme, ainsi que dans la régénération hépatique (hyperplasie compensatoire), ce qui confirme son rôle régulateur de la guérison parfaite. Des travaux précédents ont montré que l’utilisation d’un inhibiteur spécifique de la signalisation des TGF-β (SB-431542) empêche la régénération (Lévesque et al., 2007). Comme la voie canonique de signalisation de TGF-β s’opère via les protéines Smads (Smad2 & 3), l’étude de ces deux protéines est au cœur du second article. Lors du processus de régénération, Smad2 est phosphorylé entre 6h et 48h post-amputation (pa), ce qui correspond à la phase de migration cellulaire et au début de la prolifération. D’un autre côté, Smad3 est phosphorylé plus tôt, entre 3h et 6h pa, alors que la quantité de protéine totale diminue lors de la phase de préparation. L’administration de l’inhibiteur SB-431542 au moment de l’amputation bloque l’activation de Smad2 et de Smad3. Aucun blastème ne se forme, bien que la plaie ferme normalement. L’utilisation des inhibiteurs SIS3 et Naringenin (spécifique à Smad3) réduisent la phosphorylation de Smad3 d’environ 50 % (lorsque mesurée par immunobuvardage). Le processus de régénération ne semble toutefois pas affecté. La régulation différentielle des Smads est donc centrale au processus de régénération de l’axolotl. Dans le cadre de ce projet, nous avons aussi tenté de bloquer spécifiquement l’expression, ainsi que l’activation de Smad2. J’ai premièrement établi que Smad2 et Smad3 étaient présents dans la lignée cellulaire AL-1 et qu’ils peuvent être phosphorylés. J’ai ensuite tenté, par différentes techniques, de réduire l’activation spécifique de Smad2, sans succès. D’autre part, plusieurs expériences complémentaires confirment que l’activation de Smad3 est difficilement détectable et est peu importante pour la formation du blastème. La capacité exceptionnelle de régénération de l’axolotl est intimement liée à une activation différentielle des protéines Smad2 et Smad3. L’activation de Smad2 est associée à une prolifération cellulaire importante. D’autre part, l’absence de fibrose est potentiellement due à la faible activation de Smad3 au cours du processus de régénération. / Since wound healing in human is imperfect and associated with fibrosis, understanding how regeneration works would be a great asset to improve patient’s health. During this PhD project, we have published a paper exposing the weaknesses of certain research models when studying wound healing. Those limitations are even more striking when studying regeneration. This publication sets the stage for the use of the axolotl (Ambystoma mexicanum) as an excellent model to study regeneration and the importance of TGF- for the process. The multifunctional cytokine TGF-β is involved in healing, scarring, cellular differentiation, growth and migration. This cytokine is associated with the near perfect healing of oral tissues in humans, but is also associated with scarring of multiple tissue types. TGF-β is also associated with epimorphic regeneration in echinoderm and liver hyperplasia. Previous work had shown that treatment of regenerating axolotl limbs with a specific inhibitor of TGF-β canonical signalling (SB-431542) prevents regeneration (Lévesque et al., 2007). Since canonical signaling goes through Smad2 and Smad3, those two proteins are at the center of the second publication. During limb regeneration, Smad2 is phosphorylated at 6h-48h post-amputation (pa), which corresponds to the cellular migration phase and the beginning of the proliferative phase. On the other hand, Smad3 phosphorylation happens earlier (3h-6h pa), while the total protein expression is lower. Treatment with SB-421543 blocks the phosphorylation of both Smad2 and Smad3. No blastema is formed, but the wound closes at the same rate. Treatment with other inhibitors, SIS3 or Naringenin (specifically targeting Smad3), blocks approximately 50% of Smad3 phosphorylation (as determined by western blotting), but regeneration is not affected. Differential regulation of Smads is essential for proper regeneration to occur. Lastly, we have tried multiple approaches to diminish specifically the activation of Smad2. Using the only axolotl cell line available (AL-1), we have tried inhibition with LNA molecules, long antisense and overexpression of a competitor. None of these approaches specifically reduced the levels of Smad2. In addition, other experiments confirmed that activation of Smad3 during the regeneration process is limited. The extraordinary ability to regenerate that the axolotl possesses is tightly linked to a differential activation of Smad2 and Smad3 proteins. Smad2 phosphorylation is associated with cellular proliferation and migration, hence blastema formation, while the apparent lack of Smad3 activity might partly explain why these animals do not form scar tissues.