Several factors, including periodontal disease, can lead to alveolar bone reabsorbtion. The aim of this study was to investigate and compare the efficiency of mononuclear bone marrow cells (MN-BMC) associated with hydroxiapatite with hydroxiapatite alone, to promote bone regeneration. The dogs were separated in two groups (GI and GII) of nine animals. A defect of 4,3 mm diameter was surgically induced by a trephine bur between the dental roots of the fourth pre-molar tooth. In each dog the wound was treated with FMCB associated with HA (GII) or HA alone (GI). Bone marrow was extracted from all four members, the surgical access for this procedure consisted in the major tracanter of the femur and humerus condyle. In order to process the bone marrow a Histopaque® 1.077 gradient was used to separate the layer of mononuclear cells. A small sample of this layer was used for verification of total cell count and viability. The obtained mononuclear cells were then transplanted to the patients as soon as possible. Clinical evaluations for 7 days, radiologic examinations at 14, 45 and 60 days, and histological analyzes at 14, 45 and 60 days were made in order to investigate and compare the efficiency of the treatments in bone regeneration and/or reparation. The surgical procedure was adequate for the investigation purpose and the trephine bur permitted standardization of the bone defects. Adequate cell number and viability were obtained from the four bone marrow extractions followed by their processing. Scarring of the surgical wound was satisfactory and occurred similarly for the two groups. Both groups presented similar progress by radiological examination. Immediate postsurgical exams indicated that the bone defect had an adequate fulfillment. At 14 days, radiopacity had diminished when compared with immediate post-surgical finding; this was followed by an increase in radiopacity at 45 days, in both groups. Even though bone defect was still visible, radiopacity at 60 days was higher than that of 45 days. Histological evaluation indicated a progressive bone formation process in both groups. Immature bone was already visualized at 14 days in GII. In fact, histological and statistical analyzes provide reliable data that bone regeneration occurred in a less amount of time in GII at a probability of 5%. HA was still present at the 60 day group evaluation witch indicates that this biomaterial had not been completely absorbed at this time. Additionally, foreign body reactions were not present proving that the bone grafts used was biocompatible. In summary, this study has shown that the use of MN-BMC in combination with HA resulted in improvement in bone reparation when compared with HA alone. / Vários fatores, dentre eles a doença periodontal, podem levar à reabsorção do osso alveolar. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a fração total de células mononucleares (FTCM) proveniente da medula óssea (MO) na regeneração alveolar da mandíbula de cães, quando associadas à hidroxiapatita sintética (HA). Para isso, foram utilizados 18 cães divididos em 2 grupos (GI e GII). No GI o defeito foi preenchido somente com o biomaterial. O GII foi tratado com HA associado à FTCM. Defeitos de 4,3 mm de diâmetro foram criados entre as raízes do quarto pré-molar direito no osso alveolar. Esses foram preenchidos com o implante correspondente a cada grupo. A MO foi coletada dos quatro membros do animal. O acesso para a coleta no membro pélvico foi o trocanter maior do fêmur, já o acesso no membro torácico consistiu no côndilo maior do úmero. Da MO coletada, foi extraída a camada mononuclear por meio de centrifugação em gradiente de Histopaque® 1.077. As células mononucleares foram transplantadas logo após separação. Com a finalidade de investigar e comparar a eficiência da regeneração óssea foi realizado avaliações clínicas diárias durante uma semana; avaliações radiográficas no pós-operatório imediato, aos 14, 45 e 60 dias; e exames histológicos aos 14, 45 e 60 dias. A cicatrização da ferida ocorreu de forma satisfatória e semelhante para ambos os grupos. O exame radiográfico revelou evolução semelhante para os dois grupos. No pós-operatório imediato, esse exame, permitiu avaliar o adequado preenchimento do defeito no GI e GII. Nos dois grupos, aos 14 dias, observou-se uma diminuição da radiopacidade,em relação ao pós-operatório imediato, seguida por um aumento na mesma aos 45 dias em relação aos 14 dias. Essa evolução é esperada em um processo de reparação ósseo onde é usado como a HA. A radiopacidade aos 60 dias foi superior daquela observada aos 45 dias, mas o defeito ainda era perceptível. Os exames histológicos indicaram um processo de formação ósseo progressivo nos dois grupos. Aos 14 dias, havia presença de trabéculas ósseas no GII, não sendo observadas no GI nessa data. De fato, o GII apresentou um processo de regeneração óssea mais acelerada em relação ao GI até os 45 dias, sendo comprovado estatisticamente pela presença em maior quantidade de matriz óssea no GII aos 45 dias, ao nível de significância de 5%. Ainda era perceptível a presença da HA em algumas amostras aos 60 dias indicando que essa não foi completamente reabsorvida. Nenhuma reação do tipo corpo estranho foi observada, portanto, comprovando a biocompatibilidade do material. Coletivamente, os resultados obtidos neste trabalho mostraram que a associação da FTCM provenientes da medula óssea de cães à HA favoreceu a regeneração óssea em defeitos realizados no osso alveolar da mandíbula de cães. Quando comparada ao uso somente da hidroxiapatita sintética, esse processo de regeneração ocorreu de forma mais rápida em defeitos preenchidos com o biomaterial associado à FTCM.

Ziele der hier vorliegenden Arbeit waren eine immunhistochemische Analyse von GFAP (‚glial fibrillary acidic protein’) und GLUT-1 (Glukosetransporter-1) nach fokaler zerebraler Ischämie sowie deren mögliche Beeinflussung durch eine intravenöse Transplantation autologer mononukleärer Knochenmarkzellen (mKMZ) im Schafmodell. Eine differenzierte Analyse der Zielstrukturen in grauer und weißer Substanz (GS bzw. WS) sollte Aufschluss über eventuell unterschiedliche Reaktionsmuster liefern. Das Gehirnmaterial von zehn Tieren der bereits 2006/2007 stattgefundenen Studie, welche mit PET und MRT-Untersuchungen sowie der Durchführung von Verhaltenstests einherging, wurde retrospektiv im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht. Je fünf gehörten zu einer Kontroll- bzw. Therapiegruppe (KG bzw. TG). Bei allen Versuchstieren wurde durch die permanente Okklusion der linken mittleren Zerebralarterie (pMCAO) eine fokale zerebrale Ischämie im Bereich des Neokortex hervorgerufen. Die Tiere der Therapiegruppe erhielten 24 Stunden nach dem Eingriff eine Transplantation autologer mKMZ (4x106/kg KGew). Nach sieben Wochen wurden die Versuchstiere getötet, ihre Schädel perfundiert und ihre Gehirne fixiert. Eine Lamelle der Gehirne wurde für die anschließende histologische Untersuchung in 30% Saccharose konserviert. Nach der Etablierung der Antikörper GFAP und GLUT-1 wurden vier Regionen der Gehirn-lamellen immunhistochemisch markiert und abschließend qualitativ und quantitativ analysiert. Die Regionen I (infarktnah) und III (infarktfern) lagen in der ipsilateralen Hemisphäre, die Regionen II (korrespondierend zu Region I) und IV (korrespondierend zu Region III) in der kontralateralen Hemisphäre. Durch den höheren Substanzverlust an Gehirnmasse in der ipsi-lateralen Hemisphäre der KG, wurden in dieser Tiergruppe die Regionen III und IV nicht ausgewertet. Vor der Analyse sind die physiologischen Markierungsmuster der vier Regionen in grauer und weißer Substanz an zwei gesunden Tieren (Prozesskontrolle) aufgezeigt worden. Durch die elektronenmikroskopische Untersuchung von Präparaten und anhand von GFAP/GLUT-1 doppelmarkierten Präparaten konnte festgestellt werden, dass die Astrozytenendfüßchen durch den hier verwendeten GLUT-1 Antikörper nicht markiert wur-den, sondern dass alleinig die gefäßständige, 55 kDa schwere Isoform detektiert worden ist. Die fokale zerebrale Ischämie führte in beiden Gruppen zu einer hochgradigen reaktiven Astrogliose mit Ausprägung einer Glianarbe in Region I. Protoplasmatische Astrozyten der grauen und fibrilläre Astrozyten der weißen Substanz zeigten hypertrophe Veränderungen. Die reaktive Astrogliose von Region I spiegelte sich in einer erhöhten GFAP-Dichte wider (p<0,05 in der Therapiegruppe). Region III hatte die gleiche GFAP-Dichte wie die Regionen II und IV. Der direkte Vergleich zwischen den Regionen I der beiden Gruppen zeigte Veränderungen der GFAP-Dichte durch die Zelltherapie auf: In der GS der Therapiegruppe lag eine geringere GFAP-Dichte vor, in der WS eine höhere (≠ p<0,05; GS und WS). Die Ergebnisse der GLUT-1-Analyse sind denen der GFAP-Analyse sehr ähnlich. Durch den Schlaganfall ist es zu einer erhöhten GLUT-1-Expression in GS und WS (p<0,05 WS) von Region I der Kontrollgruppe gekommen. Auch in Region I der Therapiegruppe konnten er-höhte GLUT-1-Dichten in GS und WS (p<0,05 WS) detektiert werden, zusätzlich dazu lag in der GS von Region III der Therapiegruppe eine erhöhte GLUT-1-Dichte vor (p<0,05). Der Vergleich zwischen beiden Gruppen zeigte Veränderungen durch die Therapie für die Regio-nen I und II auf. Die GLUT-1-Dichte der WS war in beiden Regionen in der TG erhöht (p<0,05), die GS von Region I zeigte in der Therapiegruppe eine geringere GLUT-1-Dichte. Ein Schlaganfall führt zu einer Erhöhung der GFAP sowie GLUT-1-Dichten in WS und GS im infarktnahen Gebiet. Durch die Transplantation von 4x106 autologen mononukleären Knochenmarkzellen pro kg KGew 24 Stunden nach dem Schlaganfall können diese Strukturen in ihren Expressionsmustern beeinflusst werden, dabei reagieren graue und weiße Substanz unterschiedlich: Die GS mit einer Verringerung, die WS mit einer Erhöhung der GFAP- bzw. GLUT-1-Dichte (p<0,05 WS, GLUT-1). Die Funktionskreisläufe in infarktfernen Regionen sind sieben Wochen nach dem Schlaganfall auf Astrozytenebene normalisiert (vgl. Region III). Die erhöhte GLUT-1-Dichte (p<0,05) in der GS der infarktfernen Region ist möglicherweise mit einem erhöhten Glukosemetabolismus in Verbindung zu setzen. Dies kann jedoch erst durch die Auswertung der FDG-PET-Daten beantwortet werden. Ob die durch Transplantation autologer mKMZ festgestellten Veränderungen der GFAP- und GLUT-1-Dichte in der Therapiegruppe zusätzlich mit einer verbesserten motorischen Leistung der Tiere einhergingen, wird erst durch die Analyse der Daten aus den Verhaltenstests festgestellt werden können.

Ziele der hier vorliegenden Arbeit waren eine immunhistochemische Analyse von GFAP (‚glial fibrillary acidic protein’) und GLUT-1 (Glukosetransporter-1) nach fokaler zerebraler Ischämie sowie deren mögliche Beeinflussung durch eine intravenöse Transplantation autologer mononukleärer Knochenmarkzellen (mKMZ) im Schafmodell. Eine differenzierte Analyse der Zielstrukturen in grauer und weißer Substanz (GS bzw. WS) sollte Aufschluss über eventuell unterschiedliche Reaktionsmuster liefern. Das Gehirnmaterial von zehn Tieren der bereits 2006/2007 stattgefundenen Studie, welche mit PET und MRT-Untersuchungen sowie der Durchführung von Verhaltenstests einherging, wurde retrospektiv im Rahmen der vorliegenden Arbeit untersucht. Je fünf gehörten zu einer Kontroll- bzw. Therapiegruppe (KG bzw. TG). Bei allen Versuchstieren wurde durch die permanente Okklusion der linken mittleren Zerebralarterie (pMCAO) eine fokale zerebrale Ischämie im Bereich des Neokortex hervorgerufen. Die Tiere der Therapiegruppe erhielten 24 Stunden nach dem Eingriff eine Transplantation autologer mKMZ (4x106/kg KGew). Nach sieben Wochen wurden die Versuchstiere getötet, ihre Schädel perfundiert und ihre Gehirne fixiert. Eine Lamelle der Gehirne wurde für die anschließende histologische Untersuchung in 30% Saccharose konserviert. Nach der Etablierung der Antikörper GFAP und GLUT-1 wurden vier Regionen der Gehirn-lamellen immunhistochemisch markiert und abschließend qualitativ und quantitativ analysiert. Die Regionen I (infarktnah) und III (infarktfern) lagen in der ipsilateralen Hemisphäre, die Regionen II (korrespondierend zu Region I) und IV (korrespondierend zu Region III) in der kontralateralen Hemisphäre. Durch den höheren Substanzverlust an Gehirnmasse in der ipsi-lateralen Hemisphäre der KG, wurden in dieser Tiergruppe die Regionen III und IV nicht ausgewertet. Vor der Analyse sind die physiologischen Markierungsmuster der vier Regionen in grauer und weißer Substanz an zwei gesunden Tieren (Prozesskontrolle) aufgezeigt worden. Durch die elektronenmikroskopische Untersuchung von Präparaten und anhand von GFAP/GLUT-1 doppelmarkierten Präparaten konnte festgestellt werden, dass die Astrozytenendfüßchen durch den hier verwendeten GLUT-1 Antikörper nicht markiert wur-den, sondern dass alleinig die gefäßständige, 55 kDa schwere Isoform detektiert worden ist. Die fokale zerebrale Ischämie führte in beiden Gruppen zu einer hochgradigen reaktiven Astrogliose mit Ausprägung einer Glianarbe in Region I. Protoplasmatische Astrozyten der grauen und fibrilläre Astrozyten der weißen Substanz zeigten hypertrophe Veränderungen. Die reaktive Astrogliose von Region I spiegelte sich in einer erhöhten GFAP-Dichte wider (p<0,05 in der Therapiegruppe). Region III hatte die gleiche GFAP-Dichte wie die Regionen II und IV. Der direkte Vergleich zwischen den Regionen I der beiden Gruppen zeigte Veränderungen der GFAP-Dichte durch die Zelltherapie auf: In der GS der Therapiegruppe lag eine geringere GFAP-Dichte vor, in der WS eine höhere (≠ p<0,05; GS und WS). Die Ergebnisse der GLUT-1-Analyse sind denen der GFAP-Analyse sehr ähnlich. Durch den Schlaganfall ist es zu einer erhöhten GLUT-1-Expression in GS und WS (p<0,05 WS) von Region I der Kontrollgruppe gekommen. Auch in Region I der Therapiegruppe konnten er-höhte GLUT-1-Dichten in GS und WS (p<0,05 WS) detektiert werden, zusätzlich dazu lag in der GS von Region III der Therapiegruppe eine erhöhte GLUT-1-Dichte vor (p<0,05). Der Vergleich zwischen beiden Gruppen zeigte Veränderungen durch die Therapie für die Regio-nen I und II auf. Die GLUT-1-Dichte der WS war in beiden Regionen in der TG erhöht (p<0,05), die GS von Region I zeigte in der Therapiegruppe eine geringere GLUT-1-Dichte. Ein Schlaganfall führt zu einer Erhöhung der GFAP sowie GLUT-1-Dichten in WS und GS im infarktnahen Gebiet. Durch die Transplantation von 4x106 autologen mononukleären Knochenmarkzellen pro kg KGew 24 Stunden nach dem Schlaganfall können diese Strukturen in ihren Expressionsmustern beeinflusst werden, dabei reagieren graue und weiße Substanz unterschiedlich: Die GS mit einer Verringerung, die WS mit einer Erhöhung der GFAP- bzw. GLUT-1-Dichte (p<0,05 WS, GLUT-1). Die Funktionskreisläufe in infarktfernen Regionen sind sieben Wochen nach dem Schlaganfall auf Astrozytenebene normalisiert (vgl. Region III). Die erhöhte GLUT-1-Dichte (p<0,05) in der GS der infarktfernen Region ist möglicherweise mit einem erhöhten Glukosemetabolismus in Verbindung zu setzen. Dies kann jedoch erst durch die Auswertung der FDG-PET-Daten beantwortet werden. Ob die durch Transplantation autologer mKMZ festgestellten Veränderungen der GFAP- und GLUT-1-Dichte in der Therapiegruppe zusätzlich mit einer verbesserten motorischen Leistung der Tiere einhergingen, wird erst durch die Analyse der Daten aus den Verhaltenstests festgestellt werden können.