Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-06-27T12:24:48Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese _Sandro Vagner de Lima.pdf: 6041788 bytes, checksum: 30432ac952cb4559dfe9e27b22cd9bf5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-27T12:24:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Tese _Sandro Vagner de Lima.pdf: 6041788 bytes, checksum: 30432ac952cb4559dfe9e27b22cd9bf5 (MD5) Previous issue date: 2015-10-08 / Esta tese de doutorado foi dedicada à investigação do modo como a técnica de espectroscopia de impedância elétrica (EIE) poderia ser usada para acompanhar os processos de mudanças conformacionais de macromoléculas biológicas, como proteínas e DNA. Para isso, usamos como sistemas modelos a proteína albumina do soro bovino (BSA), e a formação do complexo polianilina/DNA (PANI/DNA). Com a caracterização de soluções de DNA e BSA por EIE e sua modelagem elétrica convenientemente descrita pelo circuito de Randles (e sua variante), foram determinados os parâmetros relevantes para descrição dos fenômenos de desnaturação e de agregação da proteína e da precipitação do complexo PANI/DNA. As informações obtidas sobre a solubilidade desses últimos complexos são de grande utilidade para o entendimento dos mecanismos de interação entre cadeias de DNA e de polímeros condutores. Do mesmo ponto de vista da EIE, as sucessivas mudanças da conformação da proteína e os detalhes da cinética de sua agregação na interação com surfactantes foram adequadamente correlacionados com a característica elétrica do circuito de Randles das soluções correspondentes. Finalmente, estudos iniciais foram estendidos para a análise dos processos de fibrilação de proteínas. Para todos os problemas abordados, o uso da resistência de transferência de carga elétrica (RCT) (um parâmetro do circuito de Randles) nos permite sugerir ser a técnica de EIE apropriada para caracterizar as diferentes mudanças conformacionais envolvidas em fenômenos que resultam da interação de biomoléculas com moléculas de prova. Assim, ela se confirma como um método competitivo quando comparado ao uso da fluorescência e da absorção UV-Vis (técnicas rotineiramente adotadas para a análise desses problemas). / This doctoral thesis was devoted to the investigation of the technique of electrical impedance spectroscopy as an alternative method to assess conformational changes of biological macromolecules, such as proteins and DNA. For this, we used protein bovine serum albumin (BSA), and the formation of polyaniline (PANI)/DNA complexes as model systems. With the characterization of DNA and BSA solutions by Electrical Impedance Spectroscopy (EIS) and their electrical modeling conveniently described by the Randles circuit (and its variant), we determined the relevant characteristics of phenomena such as the denaturation and aggregation of proteins (BSA), and polymer/DNA complex formation (PANI/DNA). As a result of this approach we identified the existence of different interaction regimes between the chains of polyaniline and DNA molecules that are dependent on the concentration of PANI/DNA and the existence of equilibrium conditions which separate regions of precipitation/stability the PANI/DNA complex. Also from this point of view, the modes of interaction BSA / surfactants involved in the conformation changes well as typical stages associated with fibrillation kinetics were adequately correlated with the electric characteristic of the Randles circuit. In all studies carry out in this thesis, the analysis of the electric charge transfer resistance behavior (RCT) (a parameter of the Randles circuit) when confronted with the results obtained by standard techniques showed that the EIS presents reliable and some comparative advantages. These results allow us to provide an adequate and competitive alternative to conventional methods such as UV-Visible absorption, fluorescence and the use of probe molecules

Orientador: Iris Concepcion Kinares de Torriani / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Fisica Gleb Wataghin / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:14:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JulioCesarda_M.pdf: 3602925 bytes, checksum: ebc541d863211845fb7a5a80d72ed5b5 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Durante as últimas décadas, o estudo de mudanças conformacionais de macromoléculas biológicas tem se tornado um grande desafio para os cientistas, além de ser um tema de interesse biotecnológico e de engenharia de proteínas. O processo de enovelamento (desenovelamento) de proteínas tem sido intensivamente estudado, pois isso pode contribuir para o conhecimento do processo de síntese de proteínas, além de ajudar a entender o desenvolvimento de algumas doenças associadas ao mau enovelamento ou agregação de certas proteínas. Nesse contexto, o Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) aparece como uma técnica valiosa para esse estudo, pois ela permite obter informações estruturais da molécula em solução. Além de permitir estudos dinâmicos, as experiências de SAXS possibilitam a observação das moléculas em condições fisiológicas. Neste trabalho, a potencialidade da técnica de SAXS foi evidenciada no estudo de mudanças conformacionais de biomoléculas. O processo de desnaturação da proteína lisozima em solução foi estudado através de experiências em equilíbrio. Mudanças conformacionais foram observadas durante o processo de desnaturação por ação de uréia na solução e por altas temperaturas. Os resultados mostraram que a lisozima é uma proteína com certa resistência para se desenovelar completamente, mesmo em condições extremas de concentração de uréia e de altas temperaturas. A molécula tende a não perder totalmente sua compacidade. Além disso, foram observados somente dois estados conformacionais (enovelado e desenovelado). Um estado intermediário reportado na literatura, mas contestado por vários autores, não foi observado. Isso mostra a alta cooperatividade dessa proteína no processo de desnaturação. Outro processo estudado foi a oligomerização da proteína -Lactoglobulina sob ação de irradiação com radiação gama. A proteína foi estudada na forma sólida, com diferentes atividades de água, e em solução, em diferentes concentrações. As amostras foram irradiadas com radiação gama em diferentes doses e as mudanças foram registradas através de experiências de SAXS. Os dados experimentais foram usados para o cálculo de modelos dos oligômeros formados por ação da radiação. Concluindo, este estudo mostrou que a técnica de SAXS é uma ferramenta versátil e muito útil para o estudo de processos de mudanças nas estruturas terciária e quaternária de proteínas em solução / Abstract: During the last decades, the study of conformational changes in biological macromolecules has been a great challenge for the scientists, and continues to be an important subject of biotechnological interest and protein engineering. The process of folding (unfolding) of protein molecules has been intensively studied, because this investigation can contribute to the knowledge of the process of protein synthesis, thus helping to understand the development of some illnesses associated with misfolding or aggregation processes of certain proteins. In this context, the technique of Small Angle X-ray Scattering (SAXS) appears as a valuable technique, because it provides structural information of the molecules in solution. This technique allows dynamical studies and makes possible the study of the protein in physiological conditions. In this work the potentiality of the SAXS technique was evidenced in the study of conformational changes of biological molecules. The process of denaturation of the protein lysozyme in solution was studied using SAXS measurements in equilibrium conditions. Conformational changes were observed during the process of denaturation by the action of urea in the solution and for high temperatures. The results showed that lysozyme is a protein with certain resistance to unfold completely. Even in extreme conditions of high concentration of urea and high temperatures, this protein does not totally lose its compactness. Moreover, only two conformational states (folded and unfolded) were observed. An intermediate state was not observed. This study showed the high cooperativity of the unfolding process of this protein during its denaturation process. Another process studied was the oligomerization of the protein -Lactoglobulin under the effect of gamma irradiation. The protein was studied in the solid form, in different water activities, and in solution, in different concentrations. The samples were exposed to several doses of -radiation. The SAXS technique was used to obtain dimensional parameters of the proteins and models were calculated from the experimental scattering data. Finally, this study showed that the SAXS technique as a versatile and very useful tool for the study of changes in the tertiary and quaternary structures of proteins in solution / Mestrado / Física / Mestre em Física

A família proteína quinases C (PKC) é composta por dez isoenzimas, as quais são capazes de fosforilar resíduos de serina e treonina. A ativação dessas quinases envolve mudanças conformacionais, como a remoção do pseudo-substrato do sítio ativo e associação dessas enzimas com lipídeos em membranas biológicas. Além disso, três fosforilações são importantes para a maturação/ enovelamento da enzima e não estão associadas com o estado de ativação das cPKCs. Apesar dessas quinases estarem envolvidas em vários processos patológicos, como carcinogênese e doenças cardiovasculares, ainda não se estabeleceu a relação entre estado de ativação das PKCs com essas doenças. Isso se deve, em parte, à ausência de ferramentas que possibilitam a distinção das formas ativas e inativas das PKCs. Na presente tese, baseando-se em mudanças conformacionais sofridas pelas PKCs durante o processo de ativação, dois anticorpos contra cPKCs ativas foram racionalmente desenvolvidos, sendo um anticorpo policlonal (anti-C2Cat) e outro monoclonal (4.8E). O anticorpo anti-C2Cat foi desenvolvido a partir de imunização de coelhos com um peptídeo localizado na região de interação entre os domínios C2 e catalítico na PKC inativa. Já o anticorpo monoclonal 4.8E foi produzido após a imunização de camundongos Balb/ C com extrato de proteínas proveniente de células HEK293T superexpressando formas constitutivamente ativas da PKCβI. A seletividade de anti-C2Cat e 4.8E por cPKCs ativas foi demonstrada por ensaios de ELISA e de imunoprecipitação, sendo que os anticorpos sempre apresentaram maior afinidade por cPKCs ativas purificadas, superexpressas ou mesmo as endógenas. O anticorpo anti-C2Cat foi capaz de monitorar a dinâmica espaço-temporal da ativação das cPKCs em linhagens de neuroblastoma (Neuro-2A e SK-N-SH) estimuladas com PMA, morfina, ATP ou glutamato por diferentes tempos. Ainda, um maior conteúdo de cPKCs ativas foi detectado por anti-C2Cat na linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 (triplo- negativa) do que em células MCF-7 (ER+). Em acordo com esses dados, anti-C2Cat identificou uma maior ativação de cPKCs em tumores mais agressivos de câncer de mama (subtipo triplo-negativo) do que em tumores menos agressivos (ER+, subtipo luminal). Os anticorpos conformacionais anti-C2Cat e 4.8E foram aplicados para elucidar vias de sinalização que levam à carcinogênese em células MDA-MB-231, por meio da realização de ensaios de co-imunoprecipitação, seguida pela identificação das proteínas por espectrometria de massas. Usando essa abordagem, os resultados sugerem que as cPKCs ativas possam estar envolvidas com a tradução de proteínas envolvidas na migração celular, como actina. Em conjunto, os resultado obtidos na presente tese demonstram duas formas racionais de desenvolver anticorpos contra cPKCs ativas, sendo que algumas aplicações para estas ferramentas foram demonstradas. Estratégias baseadas em mudanças conformacionais, similares às apresentadas aqui, poderão ser utilizadas para a produção racional de anticorpos contra outras quinases ou proteínas / The protein kinase C family (PKC) is composed of ten isoenzymes, which are capable of phosphorylating serine and threonine amino acid residues. PKC activation involves conformational changes, such as removing the pseudo-substrate from the active site and binding of the enzyme to lipids in biological membranes. In addition, PKC undergoes three phosphorylations that are important for the maturation/ folding of the enzyme and are not linked with activation status. Despite the fact that these kinases are involved in various pathological processes, such as carcinogenesis and cardiovascular disease, a relationship between PKC activation status with these diseases has not yet been established. This is partly due to the lack of tools to detect active PKC in tissue samples. In this thesis, based on conformational changes suffered by PKC during its activation, two antibodies against active cPKCs were rationally developed; a polyclonal antibody (anti-C2Cat) and a monoclonal (4.8E). Anti-C2Cat was produced after immunization of rabbits with a peptide located at the interface between the C2 and catalytic domains of cPKCs in an inactive PKC. The monoclonal antibody 4.8E was produced after immunization of Balb/C mice with total lysates from HEK293T cells overexpressing constitutively active forms of PKCβI. The anti-C2Cat and 4.8E specificity by active cPKCs was demonstrated by ELISA and immunoprecipitation assays, where the antibodies always showed higher affinity to active cPKCs. Anti-C2Cat was able to detect the temporal and spatial dynamics of cPKC activation upon receptor (morphine, ATP or glutamate) or phorbol ester stimulation in neuroblastoma lines (Neuro-2A and SK-N-SH). Futhermore, anti-C2Cat is able to detect active PKC in human tissues. Higher levels of active cPKC were observed in the more aggressive triple negative breast cancer tumors as compared to the less aggressive estrogen receptor positive tumors. Also, both antibodies were applied to study signaling pathways that lead to carcinogenesis in MDA-MB-231 cells by performing co-immunoprecipitation and mass spectrometry. Using this approach, the results suggest that active cPKCs may be involved in translation of proteins involved in cell migration, such as actin. Taken together, the results obtained in this thesis showed two rational ways to develop antibodies against active cPKCs and some applications for these tools were demonstrated. Strategies based on conformational changes, similar to those presented herein may be used for rational production of antibodies against other kinases and proteins.

Nas duas últimas décadas, houve um enorme aumento no número de estruturas proteicas resolvidas, e entre elas há uma variedade imensa de proteínas com mais de uma conformação observada. Essa quantidade incontestável de dados experimentais corroboram a hipótese de que cada proteína exista num espaço conformacional próprio, onde ela possa adotar inúmeras conformações, umas mais distintas ou estáveis que outras. Essas conformações estão distribuídas nesse espaço de acordo com sua energia potencial, que pode ser definida como uma superfície cheia de rugosidades, poços e barreiras energéticas. Duas conformações distantes nesse espaço são muito diferentes entre si, enquanto que duas conformações próximas são mais semelhantes. Da mesma forma, se distinguem os movimentos necessários para passar de uma conformação à outra. Para uma proteína passar de um estado a outro, geralmente identificados com grandes mudanças conformacionais, é necessário um movimento coletivo. Por ser de grande amplitude, esse tipo de movimento ocorre com baixa frequência, e dificilmente é observado em simulações clássicas de dinâmica molecular. Assim, existem métodos dedicados à obtenção destes movimentos, como a análise de modos normais, os modelos de redes elásticas e a análise de componentes principais. Neste trabalho, adaptamos o método de transformada de Fourier para recuperar modos harmônicos que compõem uma trajetória simulada suficientemente longa para analisar três proteínas distintas quanto a seus movimentos biológicos de importância funcional. Uma é a DEA, cuja simetria hexagonal observamos influenciar nos modos coletivos e na transição entre estados. Outra é a MosR, que simulamos em seus dois estados diferentes, oxidado ou reduzido, para encontrar como a oxidação é capaz de impedir os movimentos coletivos que levam à conformação ligada ao DNA. Nestas duas proteínas, observamos que nenhum modo por si só é responsável pela transição entre as conformações experimentais, mas que eles dependem de outros modos ou outras mudanças conformacionais ocorrendo de forma combinada. A terceira proteína analisada é um regulador transcricional, assim como a MosR, a ElrR, cuja estrutura é conhecida somente na forma apo. Neste trabalho, construímos modelos da ElrR ligada ao DNA pela combinação linear de modos harmônicos para modelar um possível ligante na nova conformação do sítio alostérico. As amplitudes usadas nessa combinação foram obtidas pelo método de mínimos quadrados, visando minimizar o desvio em relação somente às coordenadas que as hélices de reconhecimento devem apresentar para se ligar ao sítio de DNA. Este prognóstico foi feito pela análise metódica das estruturas de 27 reguladores transcricionais, homodiméricos com o motivo HTH, em complexo com DNA. Essa análise também nos permitiu descrever a estereoquímica do encaixe das hélices de reconhecimento nos sulcos maiores do DNA com novos parâmetros geométricos, intimamente relacionados com a simetria do complexo, com a sequência de resíduos das hélices de reconhecimento e com a sequência de bases do sítio de DNA, de forma a auxiliar na modelagem de novos complexos. / There was an enormous increase in the deposited protein structures in the past two decades, among them there is a great variety of proteins with more than one observed conformation. This undenieble amount of experimental data ratify the hypothesis that each protein posseses its own conformational space, where it can adopt countless conformations, some more distinct or stable than others. These conformations are distributed in the space according to its potential energy, which maybe defined as a rough landscape fulled with energetic wells and barriers. Two conformations lying apart from each other in this landscape do not carry much resemblances, while neighbouring conformations are very similar. The motions required to get one conformation to another are just as distinguishable. There must be a collective motion inbetween two states of a protein, commonly characterized by large conformation changes. This type of motion is related to large amplitudes and low frequencies, thus it is hardly seen in classical molecular dynamics simulations. Therefore, there are dedicated methods to obtain these motions, as normal modes analysis, elastic network models and essential dynamics. In this work we adapted the method of Fourier transform filtering to retrieve harmonic modes that compose a simulated trajectory and thus analise the biological motions with functional importance of three distinct proteins. One is DEA, which hexagonal symmetry was observed to affect its collective motions and the transition between biological states. Another protein is MosR, which we simulated in two different states, oxidized or reduced, to learn how the formation of a disulphide bridge is able to preclude the collective motions that lead to a DNA-binding conformation. With these two proteins we observed that no mode by itself is responsible for the transition between experimental conformations, and they actually depend on other conformational changes occurring in a combined manner. The third protein that we analised, ElrR, is a transcriptional regulator, like MosR, which structure is known only on its apo form. Hence in this work we built models of ElrR bound to DNA by the linear combination of harmonic modes aiming to model a ligand that would fit in the allosteric site upon the conformational changes driven by the collective motions. The amplitudes we used in this method were calculated by the least square method to minimize the deviation to the positions of the recognition helices when bound to the DNA. This prognostic of the target position of the recognition helices was made upon the methodical analysis of 27 structures of homodimeric transcriptional regulators, that present the Helix-Turn-Helix motif, complexed with DNA. This approach allowed us to describe the stereochemical fitting of the recognition helices into the DNA major grooves with new geometrical parameters intimatelly related to the symmetry of the complex, the residue sequence of the recognition helices and the base sequence of the DNA site, providing thus support to model new complexes.

Nas duas últimas décadas, houve um enorme aumento no número de estruturas proteicas resolvidas, e entre elas há uma variedade imensa de proteínas com mais de uma conformação observada. Essa quantidade incontestável de dados experimentais corroboram a hipótese de que cada proteína exista num espaço conformacional próprio, onde ela possa adotar inúmeras conformações, umas mais distintas ou estáveis que outras. Essas conformações estão distribuídas nesse espaço de acordo com sua energia potencial, que pode ser definida como uma superfície cheia de rugosidades, poços e barreiras energéticas. Duas conformações distantes nesse espaço são muito diferentes entre si, enquanto que duas conformações próximas são mais semelhantes. Da mesma forma, se distinguem os movimentos necessários para passar de uma conformação à outra. Para uma proteína passar de um estado a outro, geralmente identificados com grandes mudanças conformacionais, é necessário um movimento coletivo. Por ser de grande amplitude, esse tipo de movimento ocorre com baixa frequência, e dificilmente é observado em simulações clássicas de dinâmica molecular. Assim, existem métodos dedicados à obtenção destes movimentos, como a análise de modos normais, os modelos de redes elásticas e a análise de componentes principais. Neste trabalho, adaptamos o método de transformada de Fourier para recuperar modos harmônicos que compõem uma trajetória simulada suficientemente longa para analisar três proteínas distintas quanto a seus movimentos biológicos de importância funcional. Uma é a DEA, cuja simetria hexagonal observamos influenciar nos modos coletivos e na transição entre estados. Outra é a MosR, que simulamos em seus dois estados diferentes, oxidado ou reduzido, para encontrar como a oxidação é capaz de impedir os movimentos coletivos que levam à conformação ligada ao DNA. Nestas duas proteínas, observamos que nenhum modo por si só é responsável pela transição entre as conformações experimentais, mas que eles dependem de outros modos ou outras mudanças conformacionais ocorrendo de forma combinada. A terceira proteína analisada é um regulador transcricional, assim como a MosR, a ElrR, cuja estrutura é conhecida somente na forma apo. Neste trabalho, construímos modelos da ElrR ligada ao DNA pela combinação linear de modos harmônicos para modelar um possível ligante na nova conformação do sítio alostérico. As amplitudes usadas nessa combinação foram obtidas pelo método de mínimos quadrados, visando minimizar o desvio em relação somente às coordenadas que as hélices de reconhecimento devem apresentar para se ligar ao sítio de DNA. Este prognóstico foi feito pela análise metódica das estruturas de 27 reguladores transcricionais, homodiméricos com o motivo HTH, em complexo com DNA. Essa análise também nos permitiu descrever a estereoquímica do encaixe das hélices de reconhecimento nos sulcos maiores do DNA com novos parâmetros geométricos, intimamente relacionados com a simetria do complexo, com a sequência de resíduos das hélices de reconhecimento e com a sequência de bases do sítio de DNA, de forma a auxiliar na modelagem de novos complexos. / There was an enormous increase in the deposited protein structures in the past two decades, among them there is a great variety of proteins with more than one observed conformation. This undenieble amount of experimental data ratify the hypothesis that each protein posseses its own conformational space, where it can adopt countless conformations, some more distinct or stable than others. These conformations are distributed in the space according to its potential energy, which maybe defined as a rough landscape fulled with energetic wells and barriers. Two conformations lying apart from each other in this landscape do not carry much resemblances, while neighbouring conformations are very similar. The motions required to get one conformation to another are just as distinguishable. There must be a collective motion inbetween two states of a protein, commonly characterized by large conformation changes. This type of motion is related to large amplitudes and low frequencies, thus it is hardly seen in classical molecular dynamics simulations. Therefore, there are dedicated methods to obtain these motions, as normal modes analysis, elastic network models and essential dynamics. In this work we adapted the method of Fourier transform filtering to retrieve harmonic modes that compose a simulated trajectory and thus analise the biological motions with functional importance of three distinct proteins. One is DEA, which hexagonal symmetry was observed to affect its collective motions and the transition between biological states. Another protein is MosR, which we simulated in two different states, oxidized or reduced, to learn how the formation of a disulphide bridge is able to preclude the collective motions that lead to a DNA-binding conformation. With these two proteins we observed that no mode by itself is responsible for the transition between experimental conformations, and they actually depend on other conformational changes occurring in a combined manner. The third protein that we analised, ElrR, is a transcriptional regulator, like MosR, which structure is known only on its apo form. Hence in this work we built models of ElrR bound to DNA by the linear combination of harmonic modes aiming to model a ligand that would fit in the allosteric site upon the conformational changes driven by the collective motions. The amplitudes we used in this method were calculated by the least square method to minimize the deviation to the positions of the recognition helices when bound to the DNA. This prognostic of the target position of the recognition helices was made upon the methodical analysis of 27 structures of homodimeric transcriptional regulators, that present the Helix-Turn-Helix motif, complexed with DNA. This approach allowed us to describe the stereochemical fitting of the recognition helices into the DNA major grooves with new geometrical parameters intimatelly related to the symmetry of the complex, the residue sequence of the recognition helices and the base sequence of the DNA site, providing thus support to model new complexes.

A família proteína quinases C (PKC) é composta por dez isoenzimas, as quais são capazes de fosforilar resíduos de serina e treonina. A ativação dessas quinases envolve mudanças conformacionais, como a remoção do pseudo-substrato do sítio ativo e associação dessas enzimas com lipídeos em membranas biológicas. Além disso, três fosforilações são importantes para a maturação/ enovelamento da enzima e não estão associadas com o estado de ativação das cPKCs. Apesar dessas quinases estarem envolvidas em vários processos patológicos, como carcinogênese e doenças cardiovasculares, ainda não se estabeleceu a relação entre estado de ativação das PKCs com essas doenças. Isso se deve, em parte, à ausência de ferramentas que possibilitam a distinção das formas ativas e inativas das PKCs. Na presente tese, baseando-se em mudanças conformacionais sofridas pelas PKCs durante o processo de ativação, dois anticorpos contra cPKCs ativas foram racionalmente desenvolvidos, sendo um anticorpo policlonal (anti-C2Cat) e outro monoclonal (4.8E). O anticorpo anti-C2Cat foi desenvolvido a partir de imunização de coelhos com um peptídeo localizado na região de interação entre os domínios C2 e catalítico na PKC inativa. Já o anticorpo monoclonal 4.8E foi produzido após a imunização de camundongos Balb/ C com extrato de proteínas proveniente de células HEK293T superexpressando formas constitutivamente ativas da PKCβI. A seletividade de anti-C2Cat e 4.8E por cPKCs ativas foi demonstrada por ensaios de ELISA e de imunoprecipitação, sendo que os anticorpos sempre apresentaram maior afinidade por cPKCs ativas purificadas, superexpressas ou mesmo as endógenas. O anticorpo anti-C2Cat foi capaz de monitorar a dinâmica espaço-temporal da ativação das cPKCs em linhagens de neuroblastoma (Neuro-2A e SK-N-SH) estimuladas com PMA, morfina, ATP ou glutamato por diferentes tempos. Ainda, um maior conteúdo de cPKCs ativas foi detectado por anti-C2Cat na linhagem de câncer de mama MDA-MB-231 (triplo- negativa) do que em células MCF-7 (ER+). Em acordo com esses dados, anti-C2Cat identificou uma maior ativação de cPKCs em tumores mais agressivos de câncer de mama (subtipo triplo-negativo) do que em tumores menos agressivos (ER+, subtipo luminal). Os anticorpos conformacionais anti-C2Cat e 4.8E foram aplicados para elucidar vias de sinalização que levam à carcinogênese em células MDA-MB-231, por meio da realização de ensaios de co-imunoprecipitação, seguida pela identificação das proteínas por espectrometria de massas. Usando essa abordagem, os resultados sugerem que as cPKCs ativas possam estar envolvidas com a tradução de proteínas envolvidas na migração celular, como actina. Em conjunto, os resultado obtidos na presente tese demonstram duas formas racionais de desenvolver anticorpos contra cPKCs ativas, sendo que algumas aplicações para estas ferramentas foram demonstradas. Estratégias baseadas em mudanças conformacionais, similares às apresentadas aqui, poderão ser utilizadas para a produção racional de anticorpos contra outras quinases ou proteínas / The protein kinase C family (PKC) is composed of ten isoenzymes, which are capable of phosphorylating serine and threonine amino acid residues. PKC activation involves conformational changes, such as removing the pseudo-substrate from the active site and binding of the enzyme to lipids in biological membranes. In addition, PKC undergoes three phosphorylations that are important for the maturation/ folding of the enzyme and are not linked with activation status. Despite the fact that these kinases are involved in various pathological processes, such as carcinogenesis and cardiovascular disease, a relationship between PKC activation status with these diseases has not yet been established. This is partly due to the lack of tools to detect active PKC in tissue samples. In this thesis, based on conformational changes suffered by PKC during its activation, two antibodies against active cPKCs were rationally developed; a polyclonal antibody (anti-C2Cat) and a monoclonal (4.8E). Anti-C2Cat was produced after immunization of rabbits with a peptide located at the interface between the C2 and catalytic domains of cPKCs in an inactive PKC. The monoclonal antibody 4.8E was produced after immunization of Balb/C mice with total lysates from HEK293T cells overexpressing constitutively active forms of PKCβI. The anti-C2Cat and 4.8E specificity by active cPKCs was demonstrated by ELISA and immunoprecipitation assays, where the antibodies always showed higher affinity to active cPKCs. Anti-C2Cat was able to detect the temporal and spatial dynamics of cPKC activation upon receptor (morphine, ATP or glutamate) or phorbol ester stimulation in neuroblastoma lines (Neuro-2A and SK-N-SH). Futhermore, anti-C2Cat is able to detect active PKC in human tissues. Higher levels of active cPKC were observed in the more aggressive triple negative breast cancer tumors as compared to the less aggressive estrogen receptor positive tumors. Also, both antibodies were applied to study signaling pathways that lead to carcinogenesis in MDA-MB-231 cells by performing co-immunoprecipitation and mass spectrometry. Using this approach, the results suggest that active cPKCs may be involved in translation of proteins involved in cell migration, such as actin. Taken together, the results obtained in this thesis showed two rational ways to develop antibodies against active cPKCs and some applications for these tools were demonstrated. Strategies based on conformational changes, similar to those presented herein may be used for rational production of antibodies against other kinases and proteins.