Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

Techn. Universiẗat, Diss., 2005--München.

University, Diss., 2006--Frankfurt (Main). / Zsfassung in dt. und engl. Sprache.

Frankfurt (Main), Univ., Diss., 2009

Zugl.: Berlin, Humboldt-Univ., Diss., 2008

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Würzburg, Univ., Diss., 2009. / Zsfassung in engl. Sprache.

The biogenesis of spliceosomal UsnRNPs is a highly elaborate cellular process that occurs both in the nucleus and the cytoplasm. A major part of the process is the assembly of the Sm-core particle, which consists of a ring shaped heptameric unit of seven Sm proteins (SmD1•D2•F•E•G•D3•B) wrapped around a single stranded RNA motif (termed Sm-site) of spliceosomal UsnRNAs. This process occurs mainly in the cytoplasm by the sequential action of two biogenesis factors united in PRMT5- and SMN-complexes, respectively. The PRMT5-complex composed of the three proteins PRMT5, WD45 and pICln is responsible for the symmetric dimethylation of designated arginine residues in the C-terminal tails of some Sm proteins. The action of the PRMT5- complex results in the formation of assembly incompetent Sm-protein intermediates sequestered by the assembly chaperone pICln (SmD1•D2•F•E•G•pICln and pICln•D3•B). Due to the action of pICln, the Sm proteins in these complexes fail to interact with UsnRNAs to form the mature Sm-core. This kinetic trap is relieved by the action of the SMN-complex, which removes the pICln subunit and facilitates the binding of the Sm-core intermediates to the UsnRNA, thus forming the mature Sm-core particle. The human SMN complex consists of 9 subunits termed SMN, Gemin2-8 and Unrip. So far, there are no available atomic structures of the whole SMN-complex, but structures of isolated domains and subunits of the complex have been reported by several laboratories in the past years. The lack of structural information about the entire SMN complex most likely lies in the biophysical properties of the SMN complex, which possesses an oligomeric SMN core, and many unstructured and flexible regions. These were the biggest roadblocks for its structural elucidation using traditional methods such as X-ray crystallography, NMR or CryoEM. To circumvent these obstacles and to obtain structural insight into the SMN-complex, the Schizosaccharomyces pombe SMN complex was used as a model system in this work. In a collaboration with the laboratory of Dr. Remy Bordonne (IGMM, CNRS, France), we could show that the SpSMN complex is minimalistic in its composition, consisting only of SpSMN, SpGemin2, SpGemin8, SpGemin7 and SpGemin6. Using biochemical experiments, an interaction map of the SpSMN complex was established which was found to be highly similar to the reported map of the human SMN complex. The results of this study clearly show that SpSMN is the oligomeric core of the complex and provides the binding sites for the rest of the subunits. Through biochemical and X-ray scattering experiments, the properties of the SpSMN subunit such as oligomerization viii and intrinsic disorder, were shown to determine the overall biophysical characteristics of the whole complex. The structural basis of SpSMN oligomerization is presented in atomic detail which establishes a dimeric SpSMN as the fundamental unit of higher order SpSMN oligomers. In addition to oligomerization, the YG-box domain of SpSMN serves as the binding site for SpGemin8. The unstructured region of SpSMN imparts an unusual large hydrodynamic size, intrinsic disorder, and flexibility to the whole complex. Interestingly, these biophysical properties are partially mitigated by the presence of SpGemin8•SpGemin7•SpGemin6 subunits. These results classify the SpSMN complex as a multidomain entity connected with flexible linkers and characterize the SpSMN subunit to be the central oligomeric structural organizer of the whole complex. / Die Biogenese von spliceosomalen UsnRNPs ist ein hochkomplexer zellulärer Prozess, der sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma stattfindet. Ein Hauptteil dieses Prozesses ist der Aufbau des Sm-Kernpartikels, der aus einem ringförmigen Heptamer aus sieben Sm-Proteinen (SmD1 · D2 · F · E · G · D3 · B) besteht, die um ein einzelsträngiges RNA-Motiv (das auch als Sm-Stelle bezeichnet wird) der spliceosomalen U snRNAs gewickelt ist. Dieser Prozess findet hauptsächlich im Zytoplasma durch die sequenzielle Wirkung von zwei Biogenesefaktoren statt, den PRMT5 und den SMN-Komplexen. Der PRMT5-Komplex besteht aus den drei Proteinen PRMT5, WD45 und pICln und ist für die symmetrische Dimethylierung bestimmter Argininreste in den C-terminalen Schwänzen einiger Sm-Proteine verantwortlich. Die Wirkung des PRMT5-Komplexes führt zur Bildung von inkompetenten Sm-Protein-Intermediaten, die durch das Assemblierungs-Chaperon pICln (SmD1 · D2 · F · E · G · pICln und pICln · D3 · B) sequestriert werden. Aufgrund der Wirkung von pICln interagieren die Sm-Proteine in diesen Komplexen nicht mit den U snRNAs, um den reifen Sm-Kern zu bilden. Diese kinetische Falle wird durch die Wirkung des SMN-Komplexes aufgelöst, der die pICln-Untereinheit entfernt und die Bindung der Sm-Core-Zwischenprodukte an die U snRNA erleichtert, wodurch der reife Sm-Core-Partikel gebildet wird. Der menschliche SMN-Komplex besteht aus 9 Untereinheiten, die als SMN, Gemin2-8 und Unrip bezeichnet werden. Bisher sind keine atomaren Strukturen des gesamten SMN-Komplexes verfügbar, aber Strukturen isolierter Domänen und Untereinheiten des Komplexes wurden in den letzten Jahren von mehreren Laboratorien beschrieben. Der Mangel an strukturellen Informationen über den gesamten SMN-Komplex liegt höchstwahrscheinlich in den biophysikalischen Eigenschaften des SMN-Komplexes, der einen oligomeren SMN-Kern und viele unstrukturierte und flexible Regionen besitzt. Dies waren die größten Hindernisse für die Strukturaufklärung mit traditionellen Methoden wie Röntgenkristallographie, NMR oder CryoEM. Um diese Hindernisse zu umgehen und strukturelle Einblicke in den SMN-Komplex zu erhalten, wurde in dieser Arbeit der SMN-Komplex von Schizosaccharomyces pombe als Modellsystem verwendet. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Remy Bordonne (IGMM, CNRS, Frankreich) konnten wir zeigen, dass der SpSMN-Komplex in seiner Zusammensetzung minimalistisch ist und nur aus SpSMN, SpGemin2, SpGemin8, SpGemin7 und SpGemin6 besteht. Mit biochemischer Experimenten wurde eine x Interaktionskarte des SpSMN-Komplexes erstellt, die der bekannten Karte des menschlichen SMN-Komplexes sehr ähnlich war. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen deutlich, dass SpSMN der oligomere Kern des Komplexes ist und die Bindungsstellen für den Rest der Untereinheiten bereitstellt. Durch biochemische und Röntgenstreuungsexperimente wurde gezeigt, dass die Eigenschaften der SpSMNUntereinheit wie Oligomerisierung und intrinsische Störung die gesamten biophysikalischen Eigenschaften des gesamten Komplexes bestimmen. Die strukturelle Basis der SpSMN-Oligomerisierung wird atomar detailliert dargestellt, wodurch ein dimeres SpSMN als zentrale Grundeinheit der SpSMN-Oligomere höherer Ordnung festgelegt wird. Zusätzlich zur Oligomerisierung dient die YG-Box- Domäne von SpSMN als Bindungsstelle für SpGemin8. Die unstrukturierte Region von SpSMN verleiht dem gesamten Komplex eine ungewöhnlich große hydrodynamische Größe, intrinsische Unordnung und Flexibilität. Interessanterweise werden diese biophysikalischen Eigenschaften teilweise durch das Vorhandensein von SpGemin8 • SpGemin7 • SpGemin6-Untereinheiten gemindert. Diese Ergebnisse klassifizieren den SpSMN-Komplex als eine mit flexiblen Wechselwirkungen verbundene Multidomäneneinheit und charakterisieren die SpSMN-Untereinheit als den zentralen oligomeren Strukturorganisator des gesamten Komplexes.

Transmission of the malaria parasite from man to the mosquito requires the formation of sexual parasite stages, the gametocytes. The gametocytes are the only parasite stage that is able to survive in the mosquito midgut and to undergo further development – gamete formation and fertilization. Numerous sexual stage-specific proteins have been discovered, some of which play crucial roles for parasite transmission. However, the functions of many sexual stage proteins remain elusive. Amongst the sexual stage-specific proteins are the proteins of the PfCCp proteins family, which exhibit numerous adhesion domains in their protein structures. For four members of the protein family, PfCCp1 to PfCCp4 gene-disruptant parasite lines had been already studied. Amongst these, PfCCp2 and PfCCp3 showed an important role for development of the parasites in the mosquito. In the present work the study of gene-disrupted parasites of the PfCCp Protein family was completed. PfCCp5-KO and PfFNPA-KO parasite lines were characterized to a great extent and many properties were similar to those of other PfCCp proteins. The co-dependent expression previously reported to be a phenomenon of PfCCp proteins was also observed in these two mutants, although to lesser extent. When either PfCCp5 or PfFNPA were absent, all other proteins were detected in reduced abundance only. Co-dependent expression manifests exclusively on the protein level. Transcript levels were not altered as RT-PCR showed. Amongst PfCCp proteins numerous proteinproteins interactions are taking place. The previously described multimeric protein complexes also include further sexual stage-specific proteins like Pfs230, Pfs48/45 and Pfs25. Recently, a new component of PfCCp-based multimeric protein complexes had been identified. The protein was named PfWLP1 (WD repeat protein-like protein 1) due to its possession of several WD40 repeats. In the present study expression of this uncharacterized protein was investigated via indirect IFA. It was expressed in asexual blood stages and gametocytes. Upon gamete formation and fertilization its expression ceased. Another sexual stage protein studied in this work was PfactinII. It was shown to be exclusively expressed in sexual stages. In gametocytes it co-localizes with Pfs230 and correct localization of PfactinII depends on presence of Pfs230. Transcript analysis by means of RT-PCR revealed the expression of several components of the IMC in gametocytes. Furthermore, five or six myosin genes encoded in the P. falciparum genome were detected in gametocytes. Gametocyte egress was studied on the ultrastructural level via transmission electron microscopy and an inside-out type of egress was observed. Firstly, the membrane of the parasitophorous vacuole (PVM) was lysed and only thereafter the membrane of the red blood cell (RBCM) ruptured. Furthermore, a new inductor of gametogenesis was identified: The K+/H+ ionophore nigericin induced gametocytes activation in the absence of xanthurenic acid (XA), which is responsible for gamtetocyte activation in the mosquito midgut. Selective permeabilization of RBCM and PVM by the mild detergent saponin, showed that in the absence of these membranes male gametocytes were still able to perceive both XA and the drop in temperature. Thus, the receptors for both factors signaling the parasite transmission to the mosquito, seem to be of parasitic origin. LC/MS/MS analysis confirmed the ability of RBCs to take up XA. With malaria eradication on the agenda of malaria research targeting the sexual stages becomes a crucial part of intervention strategies. The sexual stages are especially attractive target as they represent a population bottleneck. The here reported findings on P. falciparum gametocytes provide several potential candidate proteins for developing tools to interrupt transmission from man to mosquito. Such tools might include Transmission blocking vaccines and drugs. / Die Übertragung der Malaria vom menschlichen Wirt auf die Überträgermücke erfordert die Bildung von Sexualstadien, der Gametozyten. Dieses Parasitenstadium ist in der Lage im Mitteldarm der Mücke zu überleben und sich zu Gameten zu entwickeln, gefolgt von Befruchtung und ygotenbildung. Eine Vielzahl von in den Sexualstadien exprimierter Proteine wurde bereits entdeckt. Einige von diesen haben essentielle Funktionen für die Transmission der Parasiten auf die Mücke. Die Rolle der meisten dieser spezifisch exprimierter Protein ist jedoch ungeklärt. Zu den sexualstadienspezifischen Proteinen gehören die Proteine der PfCCp-Proteinfamilie. Für vier Proteine diese Proteinfamilie wurden bereits KO-Mutanten untersucht. Zwei Mutanten, PfCCp2-KO und PfCCp3-KO besitzen eine wichtige Funktion während der Entwicklung der Parasiten in der Mücke. In der vorliegenden Arbeit wurde die Studie der PfCCp-Proteine komplettiert. PfCCp5- und PfFNPA-defiziente Parasitenlinien wurden zu einem Großteil charakterisiert. Viele Eigenschaften dieser beiden Parasitenlinien wiesen Ähnlichkeiten zu den bisher untersuchten PfCCp-KO-Mutanten auf. Die ko-abhängige Expression welche in der PfCCp-Proteinfamilie vorkommt, wurde auch in diesen beiden Mutanten beobachtet, wenngleich in geringerem Ausmaß. In den Mutanten, in welchem entweder PfCCp5 oder PfFNPA fehlten, waren alle übrigen PfCCp-Proteine nur in reduzierter Menge nachzuweisen. Diese ko-abhängige Expression ist ausschließlich auf dem Proteinlevel zu beobachten. Die Transkription der jeweiligen Gene hingegen ist unbeeinflusst. Zahlreiche Protein-Protein-Interaktionen finden zwischen den Proteinen der Proteinfamilie statt. The zuvor beschriebenen multimeren Proteinkomplexe schließen auch weitere sexualstadienspezifische Proteine ein, wie Pfs230, Pfs48/45 und Pfs25. Kürzlich wurde eine neue Komponente der PfCCp-basierten Multiproteinkomplexe identifiziert. Dieses Protein wurde PfWLP1 (WD repeat protein-like protein 1) genannt, da es mehrere WD40 repeat Domänen besitzt. In der vorliegenden Arbeit wurde das bisher unbeschriebene Protein mittels indirekter immunfluoreszenzstudien charakterisiert. PfWLP1 ist sowohl in asexuellen Blutstadien als auch in Gametozyten exprimiert. Nach der Gametenbildung und Fertilisation nimmt die Expression des Proteins ab. Ein weiteres Protein der Sexualstadien, welches in dieser Arbeit untersucht wurde, ist PfactinII. Es wurde gezeigt, dass dieses Protein ausschließlich in den Sexualstadien vorliegt. In Gametozyten ko-lokalisiert es mit Pfs230 und die korrekte Lokalisierung ist abhängig von der Anwesenheit von Pfs230. Mittels RT-PCR wurden mehrere Komponenten des inneren Membrankomplexes in Gametozyten nachgewiesen. Weiterhin wurden Transkripte für fünf der sechs Myosin-Gene, welche im Genom von P. falciparum exprimiert sind, nachgewiesen. Der Austritt der Gametozyten aus der Wirtszelle wurde auf ultrastruktureller Ebene mittels Transmissionselektronenmikroskopie untersucht. Hierbei wurde gezeigt, dass die Lyse der den Parasiten umgebenden Membranen von innen nach außen geschieht. Das heißt, dass zunächst die Membran der parasitophoren Vakuole (PVM) lysiert wird, und erst anschließend die Erythrozyten-Plasmamembran (RBCM). Als neuer Induktor der Gametozytenaktivierung wurde Nigericin identifiziert. Nigericin ist ein K+/H+-Ionophor, welcher in Abwesenheit von XA in der Lage ist, die Gametenbildung zu identifizieren. Die selektive Permeabilisierung der beiden den Gametozyten umgebenden Membranen, PVM und RBCM, zeigte, dass männliche Gametozyten nach Entfernung der beiden Membranen, in der Lage sind, den Temperaturabfall und XA zu perzipieren. Somit kann geschlussfolgert werden, dass die Rezeptoren beider Stimuli parasitischen Ursprungs sind. LC/MS/MS-Analysen bestätigten, dass Erythrozyten in der Lage sind, XA aufzunehmen. Die Sexualstadien des Malariaparasiten nehmen mehr und mehr an Bedeutung zu, da langfristig nicht nur eine Eindämmung der Malaria in endemischen Gebieten sondern die Auslöschung der Malaria angestrebt wird. Die Sexualstadien sind ein attraktiver Angriffspunkt aufgrund ihrer Bedeutung für die Transmission der Krankheit. Zum anderen ist die auf den Vektor übertragene Parasitenanzahl vergleichsweise gering. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen mehrere potentielle Kandidatenproteine auf, welche für die Entwicklung von Interventionsstrategien von Bedeutung sein könnten. Als Interventionsstrategien wären sowohl transmissionsblockierenden Vakzine als auch transmissionsblockierende Wirkstoffe denkbar.

Complex formation between macromolecules constitutes the foundation of most cellular processes. Most known complexes are made up of two or more proteins interacting in order to build a functional entity and therefore enabling activities which the single proteins could otherwise not fulfill. With the increasing knowledge about noncoding RNAs (ncRNAs) it has become evident that, similar to proteins, many of them also need to form a complex to be functional. This functionalization is usually executed by specific or global RNA-binding proteins (RBPs) that are specialized binders of a certain class of ncRNAs. For instance, the enterobacterial global RBPs Hfq and ProQ together bind >80 % of the known small regulatory RNAs (sRNAs), a class of ncRNAs involved in post-transcriptional regulation of gene expression. However, identification of RNA-protein interactions so far was performed individually by employing low-throughput biochemical methods and thereby hindered the discovery of such interactions, especially in less studied organisms such as Gram-positive bacteria. Using gradient profiling by sequencing (Grad-seq), the present thesis aimed to establish high-throughput, global RNA/protein complexome resources for Escherichia coli and Streptococcus pneumoniae in order to provide a new way to investigate RNA-protein as well as protein-protein interactions in these two important model organisms. In E. coli, Grad-seq revealed the sedimentation profiles of 4,095 (∼85 % of total) transcripts and 2,145 (∼49 % of total) proteins and with that reproduced its major ribonucleoprotein particles. Detailed analysis of the in-gradient distribution of the RNA and protein content uncovered two functionally unknown molecules—the ncRNA RyeG and the small protein YggL—to be ribosomeassociated. Characterization of RyeG revealed it to encode for a 48 aa long, toxic protein that drastically increases lag times when overexpressed. YggL was shown to be bound by the 50S subunit of the 70S ribosome, possibly indicating involvement of YggL in ribosome biogenesis or translation of specific mRNAs. S. pneumoniae Grad-seq detected 2,240 (∼88 % of total) transcripts and 1,301 (∼62 % of total) proteins, whose gradient migration patterns were successfully reconstructed, and thereby represents the first RNA/protein complexome resource of a Gram-positive organism. The dataset readily verified many conserved major complexes for the first time in S. pneumoniae and led to the discovery of a specific interaction between the 3’!5’ exonuclease Cbf1 and the competence-regulating ciadependent sRNAs (csRNAs). Unexpectedly, trimming of the csRNAs by Cbf1 stabilized the former, thereby promoting their inhibitory function. cbf1 was further shown to be part of the late competence genes and as such to act as a negative regulator of competence. / Makromoleküle, die Komplexe bilden, sind die Grundlage der meisten zellulären Prozesse. Die meisten bekannten Komplexe bestehen aus zwei oder mehr Proteinen, die interagieren, um eine funktionelle Einheit zu bilden. Diese Interaktionen ermöglichen Funktionen, die die einzelnen Proteine nicht erfüllen könnten. Wachsende wissenschaftliche Erkenntnisse über nichtkodierende RNAs (ncRNAs) haben gezeigt, dass, analog zu Proteinen, auch viele ncRNAs Komplexe bilden müssen, um ihre Funktionen ausüben zu können. Diese Funktionalisierung wird normalerweise von spezifischen oder globalen RNA-bindenden Proteinen (RBPs), die auf eine bestimmte Klasse an ncRNAs spezialisiert sind, durchgeführt. So binden beispielsweise die in Enterobakterien verbreiteten globalen RBPs Hfq und ProQ zusammen >80 % der bekannten kleinen regulatorischen RNAs (sRNAs)—eine Klasse der ncRNAs, die in die posttranskriptionelle Genexpressionsregulation involviert ist. RNA-Protein-Interaktionen wurden bisher anhand einzelner Moleküle und mithilfe von biochemischen Methoden mit niedrigem Durchsatz identifiziert, was die Entdeckung solcher Interaktionen erschwert hat. Dies gilt insbesondere für Organismen, die seltener Gegenstand der Forschung sind, wie beispielsweise grampositive Bakterien. Das Ziel dieser Doktorarbeit war es, mittels gradient profiling by sequencing (Grad-seq) globale Hochdurchsatzkomplexomdatensätze der RNA-ProteinInteraktionen in Escherichia coli und Streptococcus pneumoniae zu generieren. Diese Datensätze ermöglichen es auf eine neue Art und Weise RNA-Protein- und ProteinProtein-Interaktionen in diesen wichtigen Modellorganismen zu untersuchen. Die E. coli Grad-seq-Daten beinhalten die Sedimentationsprofile von 4095 Transkripten (∼85 % des Transkriptoms) und 2145 Proteinen (∼49 % des Proteoms), mit denen die wichtigsten Ribonukleoproteine reproduziert werden konnten. Die detaillierte Analyse der Verteilung von RNAs und Proteinen im Gradienten zeigte, dass zwei Moleküle, deren Funktionen bisher unbekannt waren—die ncRNA RyeG und das kleine Protein YggL—ribosomenassoziiert sind. Durch weitere Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass RyeG für ein toxisches Protein mit einer Länge von 48 Aminosäuren kodiert, das bei Überexpression die Latenzphase drastisch verlängert. Für YggL konnte eine Interaktion mit der 50S Untereinheit von 70S Ribosomen nachgewiesen werden, was auf eine potenzielle Funktion in der Biogenese von Ribosomen oder bei der Translation bestimmter mRNAs hindeutet. Die S. pneumoniae Grad-seq Daten beinhalten 2240 Transkripte (∼88 % des Transkriptoms) und 1301 Proteine (∼62 % des Proteoms), deren Migrationsprofile im Gradienten erfolgreich rekonstruiert werden konnten. Dieser RNA/ProteinKomplexomdatensatz eines grampositiven Organismus ermöglichte erstmalig die Verifizierung der wichtigsten konservierten Komplexe von S. pneumoniae. Weiterhin konnte eine spezifische Interaktion der 3’!5’-Exonuklease Cbf1 mit den ciadependent sRNAs (csRNAs), die an der Regulation von Kompetenz beteiligt sind, nachgewiesen werden. Überraschenderweise stabilisiert das von Cbf1 durchgeführte Kürzen der csRNAs die selbigen, was deren inhibitorische Funktion unterstützt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass cbf1 eines der späten Kompetenzgene ist und als solches als negativer Regulator der Kompetenz agiert.