Cinco membros da família das Acil-CoA sintetases de cadeia longa (ACSL) são responsáveis por ativar ácidos graxos, produzindo acil-CoA, e distribuí-los entre diversas vias metabólicas no interior da célula, tais como a síntese de triacilglicerol (TAG) e ?- oxidação mitocondrial. Apesar das disfunções nas ACSLs contribuirem para muitas doenças metabólicasa função de algumas isoformas de ACSL em tecidos específicos permanece ainda sem descrição na literatura. Aqui mostramos pela primeira vez a presença de mRNA da ACSL6 no músculo esquelético de seres humanos. Além disso, indivíduos obesos apresentaram menores níveis de mRNA de ACSL6 quando comparados à indivíduos magros. Após refeição hiperlipídica aguda (high fat meal, HFM, 90% de gordura) a expressão ACSL6 aumentou 2,5 vezes em relação aos níveis de jejum. Nós também verificamos as condições metabólicas que controlam a expressão ACSL6 em ratos: o jejum de 48h modulou negativamente a expressão gênica de ACSL6 e de outros genes de síntese de lipídeos tais como SREBP-1c e DGAT1, enquanto que a ingestão aguda de HFM (80% de gordura saturada , 10 mL/kg) teve o efeito oposto; Após o treinamento aeróbio (6 semanas, 5 dias /semana, uma vez por dia, 60 min a 70% da capacidade aeróbica máxima) o mRNA da ACSL6 foi reduzido em 35%. Em células primárias de músculo esquelético de ratos, a transfecção com siRNA de ACSL6 diminuiu a expressão de ACSL6, DGAT1 e SREBP-1c e o acúmulo de TAGs e gotas lipídicas. O silenciamento gênico da ACSL6 também aumentou o conteúdo dos ácidos graxos C16:0 e C18:0, AMPK-fosforilada, capacidade respiratória mitocondrial, a oxidação de palmitato e mRNA de PGC-1?, UCP2 e UCP3, mas diminuiu a produção de espécies 11 reativas de oxigênio. Em células primárias de músculo esquelético de seres humanos, a superexpressão da ACSL6 não alterou o conteúdo de TAG e da proteína DGAT1, mas aumentou as espécies lipídicas esfingomielina e fosfatidilcolinas, e reduziu a oxidação de 1-14C-palmitato e a expressão do PGC1?. Em conclusão, ACSL6 está envolvida na síntese e distribuição de acil-CoA para a síntese de lipídeos. A inibição gênica da ACSL6 melhora a capacidade de respiração mitocondrial e oxidação lipídica, através da ativação da via AMPK/PGC1?. / Five members of long-chain acyl-CoA synthetase (ACSL) family activate fatty acids providing acyl-CoA for several metabolic pathways within the cell, such as synthesis of triacylglycerol (TAG) and mitochondrial ?-oxidation, and their dysfunctions contribute to many metabolic diseases. Despite this, the existence and function of some ACSL isoforms in specific tissues remains unclear. Here we show for the first time the presence of ACSL6 mRNA and protein in skeletal muscle (SM) of humans. Obese subjects had lower levels of ACSL6 mRNA when compared to leans, and acute high fat meal (HFM, 90% fat) increased ACSL6 expression 2.5 times over fasted levels in both. We also verify the metabolic conditions that control ACSL6 expression in rats: fasting (48h) negatively modulated the ACSL6 mRNA and the expression of other genes of lipid synthesis SREBP-1c and DGAT1 in rat SM, while acute ingestion of HFM (80% saturated fat, 10 mL/Kg) had the opposite effect; After aerobic training (6 weeks, 5 days/week, once a day, 60 min at 70% of maximal aerobic capacity) ACSL6 mRNA was reduced 35%. In primary skeletal muscle cells (PSMC) of rats, ACSL6-specific siRNA oligo transfection (20 nM) decreased ACSL6, DGAT1 and SREBP-1c mRNA and the accumulation of TAGs and lipid droplets (LD). The knockdown also increased the content of C16:0 and C18:0 fatty acids, AMPK-Phosphorylated, mitochondrial content and respiratory rates, palmitate oxidation and PGC-1?, UCP2 and UCP3 mRNA, but decreased reactive oxygen species production. In PSMC of humans, ACSL6 overexpression did not change the contents of TAG or DGAT1 mRNA, but increased sphingomyelin and phosphatidylcholines and reduced 14C-palmitate oxidation and PGC1? mRNA expression. In conclusion, ACSL6 drives acyl-CoA toward lipid synthesis and its 13 downregulation improves mitochondrial capacity of respiration, lipid oxidation and biogenesis, which involves the activation of AMPK/PGC1-? pathway.

This thesis is a series of investigations into the regulation of skeletal muscle mitochondrial metabolism. Novel regulatory mechanisms regarding mitochondrial fatty acid oxidation are continually being identified and alterations in skeletal muscle mitochondrial metabolism have been implicated in the pathogenesis of type II diabetes (T2DM). Therefore, advancing our basic understanding of mitochondrial regulatory processes is required to provide insight into the progression of T2DM. In study one, the utilization of knockout mice for the putative mitochondrial fatty acid transport protein FAT/CD36, showed that mitochondrial FAT/CD36 plays a functional role in mitochondrial long chain fatty acid (LCFA) oxidation. Specifically, FAT/CD36 was found to be located on the outer mitochondrial membrane (OMM) upstream of acyl-CoA synthetase. In study two, it was observed that in rat muscle, malonyl-CoA (M-CoA) inhibition kinetics of carnitine palmitoyltransferase I (CPT-I) display a more physiological IC50 in permeabilzed muscle fibre bundles (PmFB) compared to isolated mitochondria. These data suggest that the cytoskeleton may have a role in regulating M-CoA inhibition. Additionally, a significant effect of LCFA-CoA on M-CoA inhibition kinetics was observed. These data indicate that M-CoA content does not need to decrease to promote an increase in CPT-I flux. Finally, in a model of T2DM (ZDF rat), submaximal ADP-stimulated respiration rates and the content of adenine nucleotide translocase 2 (ANT2) content were depressed compared to lean control animals. Resveratrol treatment in ZDF rats recovered these declines concomitantly with improving insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake and the cellular redox state. A number of novel findings are presented, specifically, 1) a functional role for mitochondrial FAT/CD36 in mitochondrial LCFA oxidation was confirmed and the topology of this protein along the OMM is expanded upon, 2) M-CoA inhibition kinetics of CPT-I were re-evaluated in PmFB and a regulatory role of LCFA-CoA on M-CoA inhibition kinetics is established, and 3) submaximal ADP-stimulated respiration rates and ANT2 content are depressed in the ZDF rat and resveratrol supplementation prevents these decrements.

Cinco membros da família das Acil-CoA sintetases de cadeia longa (ACSL) são responsáveis por ativar ácidos graxos, produzindo acil-CoA, e distribuí-los entre diversas vias metabólicas no interior da célula, tais como a síntese de triacilglicerol (TAG) e ?- oxidação mitocondrial. Apesar das disfunções nas ACSLs contribuirem para muitas doenças metabólicasa função de algumas isoformas de ACSL em tecidos específicos permanece ainda sem descrição na literatura. Aqui mostramos pela primeira vez a presença de mRNA da ACSL6 no músculo esquelético de seres humanos. Além disso, indivíduos obesos apresentaram menores níveis de mRNA de ACSL6 quando comparados à indivíduos magros. Após refeição hiperlipídica aguda (high fat meal, HFM, 90% de gordura) a expressão ACSL6 aumentou 2,5 vezes em relação aos níveis de jejum. Nós também verificamos as condições metabólicas que controlam a expressão ACSL6 em ratos: o jejum de 48h modulou negativamente a expressão gênica de ACSL6 e de outros genes de síntese de lipídeos tais como SREBP-1c e DGAT1, enquanto que a ingestão aguda de HFM (80% de gordura saturada , 10 mL/kg) teve o efeito oposto; Após o treinamento aeróbio (6 semanas, 5 dias /semana, uma vez por dia, 60 min a 70% da capacidade aeróbica máxima) o mRNA da ACSL6 foi reduzido em 35%. Em células primárias de músculo esquelético de ratos, a transfecção com siRNA de ACSL6 diminuiu a expressão de ACSL6, DGAT1 e SREBP-1c e o acúmulo de TAGs e gotas lipídicas. O silenciamento gênico da ACSL6 também aumentou o conteúdo dos ácidos graxos C16:0 e C18:0, AMPK-fosforilada, capacidade respiratória mitocondrial, a oxidação de palmitato e mRNA de PGC-1?, UCP2 e UCP3, mas diminuiu a produção de espécies 11 reativas de oxigênio. Em células primárias de músculo esquelético de seres humanos, a superexpressão da ACSL6 não alterou o conteúdo de TAG e da proteína DGAT1, mas aumentou as espécies lipídicas esfingomielina e fosfatidilcolinas, e reduziu a oxidação de 1-14C-palmitato e a expressão do PGC1?. Em conclusão, ACSL6 está envolvida na síntese e distribuição de acil-CoA para a síntese de lipídeos. A inibição gênica da ACSL6 melhora a capacidade de respiração mitocondrial e oxidação lipídica, através da ativação da via AMPK/PGC1?. / Five members of long-chain acyl-CoA synthetase (ACSL) family activate fatty acids providing acyl-CoA for several metabolic pathways within the cell, such as synthesis of triacylglycerol (TAG) and mitochondrial ?-oxidation, and their dysfunctions contribute to many metabolic diseases. Despite this, the existence and function of some ACSL isoforms in specific tissues remains unclear. Here we show for the first time the presence of ACSL6 mRNA and protein in skeletal muscle (SM) of humans. Obese subjects had lower levels of ACSL6 mRNA when compared to leans, and acute high fat meal (HFM, 90% fat) increased ACSL6 expression 2.5 times over fasted levels in both. We also verify the metabolic conditions that control ACSL6 expression in rats: fasting (48h) negatively modulated the ACSL6 mRNA and the expression of other genes of lipid synthesis SREBP-1c and DGAT1 in rat SM, while acute ingestion of HFM (80% saturated fat, 10 mL/Kg) had the opposite effect; After aerobic training (6 weeks, 5 days/week, once a day, 60 min at 70% of maximal aerobic capacity) ACSL6 mRNA was reduced 35%. In primary skeletal muscle cells (PSMC) of rats, ACSL6-specific siRNA oligo transfection (20 nM) decreased ACSL6, DGAT1 and SREBP-1c mRNA and the accumulation of TAGs and lipid droplets (LD). The knockdown also increased the content of C16:0 and C18:0 fatty acids, AMPK-Phosphorylated, mitochondrial content and respiratory rates, palmitate oxidation and PGC-1?, UCP2 and UCP3 mRNA, but decreased reactive oxygen species production. In PSMC of humans, ACSL6 overexpression did not change the contents of TAG or DGAT1 mRNA, but increased sphingomyelin and phosphatidylcholines and reduced 14C-palmitate oxidation and PGC1? mRNA expression. In conclusion, ACSL6 drives acyl-CoA toward lipid synthesis and its 13 downregulation improves mitochondrial capacity of respiration, lipid oxidation and biogenesis, which involves the activation of AMPK/PGC1-? pathway.

INTRODUÇÃO: A atrofia muscular induzida pela insuficiência cardíaca (IC) está associada à intolerância ao exercício físico e ao mau prognóstico. Compreender os mecanismos moleculares envolvidos nessa atrofia pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar tal condição. Tem sido demonstrado que o sistema proteolítico lisossomal/autofágico é um importante mecanismo de manutenção da massa muscular. Entretanto, o papel desse sistema no desenvolvimento da miopatia esquelética induzida pela IC ainda não havia sido abordado. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atuação de componentes do sistema lisossomal/autofágico na musculatura esquelética de ratos submetidos ao infarto do miocárdio (IM). MÉTODOS: Cirurgias de IM e fictícia (Sham) foram realizadas em ratos Wistar, e doze semanas após os procedimentos cirúrgicos foram avaliados parâmetros ecocardiográficos, tolerância ao exercício físico e histologia dos tecidos cardíaco e muscular esquelético. Componentes do sistema proteolítico lisossomal/autofágico na musculatura esquelética foram avaliados por meio de expressão gênica (qRT-PCR) e proteica (Western Blotting) e atividade enzimática. RESULTADOS: Ratos IM apresentaram intolerância ao esforço físico, disfunção e dilatação ventricular esquerda e edema pulmonar, o que evidencia a presença de IC. Foi observado aumento da expressão gênica de GABARAPL1, ATG7, BNIP3, CTSL1 e LAMP2 no músculo glicolítico plantar, enquanto nenhuma alteração foi observada no músculo oxidativo sóleo, embora ambos os músculos tenham apresentado atrofia. Ainda, o IM promoveu no músculo plantar aumento da expressão proteica de Bnip3 e Fis1, maior atividade enzimática da Catepsina L e maior acúmulo de hidroperóxidos lipídicos. CONCLUSÕES: Nossos resultados evidenciam demonstram aumento da transcrição de genes relacionados à autofagia na atrofia do músculo plantar induzida por IM, mas não na atrofia do músculo sóleo. Assim, genes autofágicos são regulados de forma diferenciada em músculos atróficos compostos por diferentes tipos de fibras e características metabólicas. Ainda, alterações em componentes do sistema lisossomal/autofágico no músculo plantar indicam aumento da autofagia de mitocôndrias (mitofagia), o que parece ter contribuído para a atrofia deste músculo e para a intolerância ao exercício físico induzida pela IC / INTRODUCTION: Heart failure (HF)-induced skeletal muscle atrophy is often associated to exercise intolerance and poor prognosis. Better understanding the molecular mechanisms underlying HF-induced muscle atrophy may contribute to the development of pharmacological strategies to prevent or treat such condition. It has been shown that autophagy-lysosome system is an important mechanism for maintenance of muscle mass. However, its role in HF-induced myopathy has not been addressed yet. Therefore, the aim of present study was to evaluate the relative role of the main autophagy-related genes in myocardial infarction (MI)-induced muscle atrophy in rats. METHODS: Wistar rats underwent MI or sham surgeries, and after 12 weeks were submitted to echocardiography, exercise tolerance and histology evaluations. Lysosomal/autophagic proteolytic system components were depicted in skeletal muscle by gene (qRT-PCR) and protein (Western Blotting) expression analysis, and enzymatic activity. RESULTS: MI rats displayed exercise intolerance, left ventricle dysfunction and dilation suggesting the presence of HF. The key finding of the present study is that upregulation of autophagy-related genes (GABARAPL1, ATG7, BNIP3, CTSL1 and LAMP2) was observed only in plantaris while muscle atrophy was depicted in both soleus and plantaris muscles. Furthermore, MI induced higher Bnip3 and Fis1 protein expression, and increased cathepsin L activity and lipid hydroperoxides levels in plantaris muscle. CONCLUSIONS: Altogether our results provide evidence for transcriptional overexpression of autophagy-related genes in MI-induced plantaris atrophy but not soleus atrophy. Therefore, autophagy-related genes are differentially regulated in atrophic muscles comprising different fiber-types and metabolic characteristics. Moreover, changes in lysosomal/autophagic system components in the plantaris muscle indicate increased mitochondrial autophagy (mitophagy), which seems to have contributed to HF-induced plantaris atrophy and exercise intolerance

INTRODUÇÃO: A atrofia muscular induzida pela insuficiência cardíaca (IC) está associada à intolerância ao exercício físico e ao mau prognóstico. Compreender os mecanismos moleculares envolvidos nessa atrofia pode contribuir para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para prevenir ou tratar tal condição. Tem sido demonstrado que o sistema proteolítico lisossomal/autofágico é um importante mecanismo de manutenção da massa muscular. Entretanto, o papel desse sistema no desenvolvimento da miopatia esquelética induzida pela IC ainda não havia sido abordado. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atuação de componentes do sistema lisossomal/autofágico na musculatura esquelética de ratos submetidos ao infarto do miocárdio (IM). MÉTODOS: Cirurgias de IM e fictícia (Sham) foram realizadas em ratos Wistar, e doze semanas após os procedimentos cirúrgicos foram avaliados parâmetros ecocardiográficos, tolerância ao exercício físico e histologia dos tecidos cardíaco e muscular esquelético. Componentes do sistema proteolítico lisossomal/autofágico na musculatura esquelética foram avaliados por meio de expressão gênica (qRT-PCR) e proteica (Western Blotting) e atividade enzimática. RESULTADOS: Ratos IM apresentaram intolerância ao esforço físico, disfunção e dilatação ventricular esquerda e edema pulmonar, o que evidencia a presença de IC. Foi observado aumento da expressão gênica de GABARAPL1, ATG7, BNIP3, CTSL1 e LAMP2 no músculo glicolítico plantar, enquanto nenhuma alteração foi observada no músculo oxidativo sóleo, embora ambos os músculos tenham apresentado atrofia. Ainda, o IM promoveu no músculo plantar aumento da expressão proteica de Bnip3 e Fis1, maior atividade enzimática da Catepsina L e maior acúmulo de hidroperóxidos lipídicos. CONCLUSÕES: Nossos resultados evidenciam demonstram aumento da transcrição de genes relacionados à autofagia na atrofia do músculo plantar induzida por IM, mas não na atrofia do músculo sóleo. Assim, genes autofágicos são regulados de forma diferenciada em músculos atróficos compostos por diferentes tipos de fibras e características metabólicas. Ainda, alterações em componentes do sistema lisossomal/autofágico no músculo plantar indicam aumento da autofagia de mitocôndrias (mitofagia), o que parece ter contribuído para a atrofia deste músculo e para a intolerância ao exercício físico induzida pela IC / INTRODUCTION: Heart failure (HF)-induced skeletal muscle atrophy is often associated to exercise intolerance and poor prognosis. Better understanding the molecular mechanisms underlying HF-induced muscle atrophy may contribute to the development of pharmacological strategies to prevent or treat such condition. It has been shown that autophagy-lysosome system is an important mechanism for maintenance of muscle mass. However, its role in HF-induced myopathy has not been addressed yet. Therefore, the aim of present study was to evaluate the relative role of the main autophagy-related genes in myocardial infarction (MI)-induced muscle atrophy in rats. METHODS: Wistar rats underwent MI or sham surgeries, and after 12 weeks were submitted to echocardiography, exercise tolerance and histology evaluations. Lysosomal/autophagic proteolytic system components were depicted in skeletal muscle by gene (qRT-PCR) and protein (Western Blotting) expression analysis, and enzymatic activity. RESULTS: MI rats displayed exercise intolerance, left ventricle dysfunction and dilation suggesting the presence of HF. The key finding of the present study is that upregulation of autophagy-related genes (GABARAPL1, ATG7, BNIP3, CTSL1 and LAMP2) was observed only in plantaris while muscle atrophy was depicted in both soleus and plantaris muscles. Furthermore, MI induced higher Bnip3 and Fis1 protein expression, and increased cathepsin L activity and lipid hydroperoxides levels in plantaris muscle. CONCLUSIONS: Altogether our results provide evidence for transcriptional overexpression of autophagy-related genes in MI-induced plantaris atrophy but not soleus atrophy. Therefore, autophagy-related genes are differentially regulated in atrophic muscles comprising different fiber-types and metabolic characteristics. Moreover, changes in lysosomal/autophagic system components in the plantaris muscle indicate increased mitochondrial autophagy (mitophagy), which seems to have contributed to HF-induced plantaris atrophy and exercise intolerance