O transtorno do espectro autista (TEA) é uma alteração do desenvolvimento neuropsiquiátrico que afeta três grandes áreas: interesse social, dificuldade de comunicação e comportamentos restritos. O TEA pode estar presente em algumas síndromes já bem descritas, como a Síndrome do X frágil (SXF), que é a mais frequente causa de retardo mental herdável, e também está associada a transtornos de desenvolvimento. O gene MTHFR faz parte do metabolismo do ácido fólico e está associado a síntese de nucleotídeos e metilação do DNA. O polimorfismos C677T deste gene, está relacionado a hipometilação quando na presença do alelo T, levando a alterações na expressão gênica. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência da síndrome do X-frágil e de variantes polimórficas no gene MTHFR em uma amostra de pacientes do sexo masculino e feminino com TEA. Analisamos uma amostra de 154 crianças diagnosticadas com TEA idiopático, sendo que 136 destas foram testadas para a SXF (97 meninos e 39 meninas). Todas as análises moleculares foram feitas a partir da técnica de PCR. Uma vez que a triagem fosse positiva para SXF, o DNA do paciente foi encaminhado para confirmação por Southern Blotting. Nossa análise molecular identificou três (3,1%) meninos com mutação completa, e para a maioria das meninas o resultado se mostrou inconclusivo (71,8%). Para o teste de associação do polimorfismo C677T do gene MTHFR e a susceptibilidade a TEA, analisamos 151 crianças com TEA idiopático e 100 crianças controles. Não foram observadas diferenças significativas na distribuição alélica (T=0,38 casos e T=0,35 controle) nem na distribuição genotípica (p=0,72) entre os dois grupos. Nenhuma associação foi encontrada entre a presença do alelo T e comportamentos autistas selecionados: evitação do olhar, movimentos corporais complexos e auto-agressão. Estes resultados mostram que a SXF representa uma fração importante dos casos de autismo idiopático pois nem sempre a expressão clinica da doença é identificada pela equipe medica. Além disto, ao contrario de outros trabalhos prévios, na nossa população, polimorfismos no gene MHTFR não representam papel na suscetibilidade aos transtornos do espectro autista. / Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder that acts in three areas: social interests, communication difficulties and restrict behaviors. ASD can be present in Fragile X Syndrome (FXS) that is the most frequent cause of inherited mental retardation and it is also associated a developmental disorders. The MTHFR gene plays in acid folic pathway and it is associated with the nucleotide synthesis and DNA methylation. The C677T MTHFR polymorphism is related with hypomethylation when T allele is present, leading to genic expression alterations. We analyzed a sample of 154 children with idiopatic TEA, being 136 tested for XFS through PCR technique (97 males and 39 females). All molecular analysis were made from PCR technique. Once the screening was positive for FXS, the patient DNA was referred for confirmation by Southern Blotting. In our molecular analyse, we identified three (3.1%) boys with full mutation, and for the girls, 71.8% was inconclusive. By analysing the MTHFR C677T polymorphism association and the susceptibility for TEA, we analyzed 151 children with idiopatic TEA and 100 controls children. There were any significant differences in allelic distribution (T=0.38 cases and T=0.35 controls) or genotypic distribution (p=0.72) between the groups. No association was found between the presence of T allele and autistic behaviors selected: averted gaze, complex body movements and self-injury behavior. These results show that FXS presents a significant part of idiopatic autism cases because is not always the expression of clinical disease is identified by the medical team. Moreover, unlike other previous studies, in our population, polymorphisms in the gene MHTFR do not represent role in susceptibility to autism spectrum disorders.

O transtorno do espectro autista (TEA) é uma alteração do desenvolvimento neuropsiquiátrico que afeta três grandes áreas: interesse social, dificuldade de comunicação e comportamentos restritos. O TEA pode estar presente em algumas síndromes já bem descritas, como a Síndrome do X frágil (SXF), que é a mais frequente causa de retardo mental herdável, e também está associada a transtornos de desenvolvimento. O gene MTHFR faz parte do metabolismo do ácido fólico e está associado a síntese de nucleotídeos e metilação do DNA. O polimorfismos C677T deste gene, está relacionado a hipometilação quando na presença do alelo T, levando a alterações na expressão gênica. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência da síndrome do X-frágil e de variantes polimórficas no gene MTHFR em uma amostra de pacientes do sexo masculino e feminino com TEA. Analisamos uma amostra de 154 crianças diagnosticadas com TEA idiopático, sendo que 136 destas foram testadas para a SXF (97 meninos e 39 meninas). Todas as análises moleculares foram feitas a partir da técnica de PCR. Uma vez que a triagem fosse positiva para SXF, o DNA do paciente foi encaminhado para confirmação por Southern Blotting. Nossa análise molecular identificou três (3,1%) meninos com mutação completa, e para a maioria das meninas o resultado se mostrou inconclusivo (71,8%). Para o teste de associação do polimorfismo C677T do gene MTHFR e a susceptibilidade a TEA, analisamos 151 crianças com TEA idiopático e 100 crianças controles. Não foram observadas diferenças significativas na distribuição alélica (T=0,38 casos e T=0,35 controle) nem na distribuição genotípica (p=0,72) entre os dois grupos. Nenhuma associação foi encontrada entre a presença do alelo T e comportamentos autistas selecionados: evitação do olhar, movimentos corporais complexos e auto-agressão. Estes resultados mostram que a SXF representa uma fração importante dos casos de autismo idiopático pois nem sempre a expressão clinica da doença é identificada pela equipe medica. Além disto, ao contrario de outros trabalhos prévios, na nossa população, polimorfismos no gene MHTFR não representam papel na suscetibilidade aos transtornos do espectro autista. / Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder that acts in three areas: social interests, communication difficulties and restrict behaviors. ASD can be present in Fragile X Syndrome (FXS) that is the most frequent cause of inherited mental retardation and it is also associated a developmental disorders. The MTHFR gene plays in acid folic pathway and it is associated with the nucleotide synthesis and DNA methylation. The C677T MTHFR polymorphism is related with hypomethylation when T allele is present, leading to genic expression alterations. We analyzed a sample of 154 children with idiopatic TEA, being 136 tested for XFS through PCR technique (97 males and 39 females). All molecular analysis were made from PCR technique. Once the screening was positive for FXS, the patient DNA was referred for confirmation by Southern Blotting. In our molecular analyse, we identified three (3.1%) boys with full mutation, and for the girls, 71.8% was inconclusive. By analysing the MTHFR C677T polymorphism association and the susceptibility for TEA, we analyzed 151 children with idiopatic TEA and 100 controls children. There were any significant differences in allelic distribution (T=0.38 cases and T=0.35 controls) or genotypic distribution (p=0.72) between the groups. No association was found between the presence of T allele and autistic behaviors selected: averted gaze, complex body movements and self-injury behavior. These results show that FXS presents a significant part of idiopatic autism cases because is not always the expression of clinical disease is identified by the medical team. Moreover, unlike other previous studies, in our population, polymorphisms in the gene MHTFR do not represent role in susceptibility to autism spectrum disorders.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2007. / Submitted by Luis Felipe Souza (luis_felas@globo.com) on 2008-11-10T17:49:53Z No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AdrianaLofrano.pdf: 4137468 bytes, checksum: 498e0c4d88e5333d6bdd65d0935b79ba (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2008-11-28T12:56:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AdrianaLofrano.pdf: 4137468 bytes, checksum: 498e0c4d88e5333d6bdd65d0935b79ba (MD5) / Made available in DSpace on 2008-11-28T12:56:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_2007_AdrianaLofrano.pdf: 4137468 bytes, checksum: 498e0c4d88e5333d6bdd65d0935b79ba (MD5) / Mutações inativadoras dos genes das gonadotrofinas são raras e representam oportunidade única para estudo dos efeitos do FSH e do LH, separadamente, in vivo. Anteriormente, descrevemos uma família brasileira, na qual dois irmãos, um homem e uma mulher, apresentavam deficiência seletiva de FSH devido à mutação Tyr76X, em homozigose, no gene FSHB. Recentemente identificamos outra família, na qual três irmãos, dois homens e uma mulher, apresentavam deficiência seletiva de LH. Na primeira parte do presente estudo (ESTUDO A), foi aplicado protocolo de estimulação hormonal nos pacientes com deficiência de FSH, com o objetivo de analisar os efeitos da estimulação gonadotrófica seletiva na resposta esteroidogênica gonadal em ambos os sexos. Na segunda parte (ESTUDO B), descrevemos as características clínicas e aspectos fisiopatológicos da deficiência seletiva de LH em ambos os sexos e realizamos a análise do gene da subunidade beta do LH (LHB) nos indivíduos afetados e seus familiares. No ESTUDO A, o protocolo consistiu inicialmente de análise da pulsatilidade do LH, obtida por meio de coletas noturnas seriadas de amostras de sangue para dosagem de LH. Em seguida, após supressão adrenal com dexametasona dois dias antes e durante o protocolo, foram realizadas medidas de esteróides sexuais gonadais no estado basal e após administração de hCG apenas, FSH apenas, ou FSH seguido de hCG (FSH+hCG). Foram analisadas as seguintes variáveis: número de pulsos de LH, média ± DP de suas amplitudes, média ± DP dos valores de LH ao longo da noite, e concentrações séricas de testosterona (T), estradiol (E2, SDHEA, 17hidroxiprogesterona (17OHP), androstenediona (AD) e inibina B (InB), antes e depois de cada estímulo. Foram obtidos os seguintes resultados, na mulher e no homem, respectivamente: a média ± DP do LH ao longo da noite foi 49,2 ± 5,7 mIU/ml e 9,1 ± 2,9 mIU/ml; foram detectados 8 pulsos em 8 horas e 9 pulsos em 9 horas, com amplitudes de 53,4 ± 6,5 mIU/ml e 11,7 ± 1,9 mIU/ml. Não houve resposta esteroidogênica gonadal na mulher a nenhum dos estímulos utilizados, enquanto no homem, houve aumento de T e AD após hCG (55,2% e 125%, respectivamente), após FSH (76,3% e 40%) e após FSH+hCG (68% e 140%), houve aumento da 17OHP apenas após FSH+hCG (238,8%) e aumento do E2 após hCG (>116,1%) e após FSH+hCG (111,8%). A InB aumentou 480% após FSH. No ESTUDO B, a deficiência de LH caracterizou-se, nos homens, por ausência do desenvolvimento puberal e azoospermia e na mulher, por amenorréia secundária e infertilidade. As concentrações de séricas de LH foram indetectáveis e as de FSH, elevadas. O seqüenciamento do gene LHB revelou a presença da mutação IVS2+1G>C em homozigose nos indivíduos afetados. O rastreamento da mutação por digestão enzimática revelou que seis familiares férteis eram heterozigotos para a nova mutação, enquanto a mutação não foi identificada em nenhum dos 100 indivíduos normais, no grupo controle. A análise por RT-PCR do RNAm extraído de leucócitos dos indivíduos afetados demonstrou que a mutação resultou na inclusão do íntron 2 e, consequentemente, mudança da fase de leitura do éxon 3 do LHB. O alinhamento das seqüências da suposta proteína aberrante e do LH-beta normal evidenciou a perda de estruturas essenciais para a dimerização das subunidades e conseqüentemente comprometimento provável de sua secreção. Os resultados do ESTUDO A sugeriram que o FSH pode exercer efeito regulatório sobre a produção de andrógenos pelas células de Leydig normais, provavelmente agindo de forma parácrina, mediada por sua ação nas células de Sertoli. No ESTUDO B, a mutação identificada no gene LHB (IVS2+1G>C) resultou no fenótipo de deficiência seletiva de LH nos homozigotos, corroborando os efeitos fisiológicos principais do LH sobre a produção androgênica e fertilidade no sexo masculino e sobre a capacidade ovulatória e fertilidade, no sexo feminino. _____________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Inactivating mutations of gonadotropins genes are rare and represent a unique oportunity to study FSH and LH effects, separately, in vivo. We previously described a Brazilian family including two siblings, a man and a woman, with selective FSH deficiency due to a mutation (Tyr76X) in FSHB gene. Recently, we identified another family including three siblings, two men and a woman, with selective LH deficiency. In the first part of this study (STUDY A), we performed a hormonal stimulation protocol in the FSH-deficient patients, in order to analyse the effects of selective gonadotropin stimulation on gonadal steroidogenic response in both sexes. In the second part (STUDY B), we described the clinical characteristics and physiopathologic features of selective LH deficiency in both sexes and performed the analysis of the LHB gene in the affected patients and their relatives. In STUDY A, the protocol started with overnight serial LH sampling for the analysis of LH pulsatility. After adrenal suppression with oral dexametasone given two days before and during the protocol, gonadal steroids levels were assessed at baseline and after hCG, FSH or FSH +hCG administration. The following variables were analysed: LH pulse number, mean ± SD LH amplitude, mean ± SD overnight LH level and baseline and stimulated serum levels of testosterone (T), estradiol (E2), dehidroepiandrosterone sulphate (SDHEA), 17hydroxi-progesterone (17OHP), androstenedione (AD) and inhibin B. The following results were obtained, for the woman and the man, respectively: the mean overnight LH levels were 49.2 ± 5.7 mIU/mL and 9.1 ± 2.9 mIU/mL; there were 8 pulses/8h and 9 pulses/9h, with mean amplitudes of 53.4 ± 6.5mIU/mL and 11.7 ± 1.9mIU/mL. There was no steroid response to rFSH, hCG or FSH+hCG in the woman. In the man, there was an increase in T and AD after hCG (55.2% and 125%, respectively), after FSH (76.3% and 40%) and after FSH+hCG (68% and 140%); an increase in 17OHP was observed only after FSH+hCG (238.8%); estradiol increased after hCG (>116%) and after FSH+hCG (111.8%), and inhibin B increased by 480% after FSH. In STUDY B, LH deficiency was charactized by absent pubertal development and azoospermia in the men, and by secondary amenorrhea and infertility in the woman. LH levels were undetectable, whereas FSH was elevated. LHB gene sequencing revealed a mutation (IVS2+1G>C) in homozygous state in the affected subjects. Mutation screening by enzymatic digestion revealed that six fertile family members were heterozygotes for the new mutation, whereas the mutation was not found in any of the 100 normal subjects in the control group. RT-PCR analysis of the LHB mRNA extracted from leucocytes of the affected subjects demonstrated that the mutation resulted in the inclusion of intron 2 and, consequently, in an exon 3 frameshift. Sequence alignments of the supposed aberrant protein and wild-type LHB showed that the aberrant protein would lack structures essential for subunit dimerization, which would probably compromise its secretion. The results from STUDY A suggested that FSH may exert a regulatory role in androgen production by Leydig cells, probably acting in a paracrine way, mediated by its action on Sertoli cells. The LHB mutation identified in STUDY B (IVS2+1G>C) resulted in the phenotype of selective LH deficiency in homozygotes, reinforcing the main physiologic effects of LH on androgen production and fertility in men, and on ovulatory capacity and fertility in women.

Os estudos sobre a resistência de Mycobacterium tuberculosis aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB), vêm sendo cada vez mais explorados com o objetivo de entender melhor como funcionam os mecanismos utilizados pela micobactéria. A partir do aumento da transmissão ativa de linhagens de M. tuberculosis resistentes às drogas, tanto no Rio Grande do Sul quanto em outras regiões do Brasil, fez-se necessário um estudo relativo à resistência de M. tuberculosis à pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB). Sabe-se até o momento que existem genes específicos que, possivelmente sejam alvos de alterações e podem proporcionar resistência ao M. tuberculosis, no entanto ainda não se têm relatos do tipo e da freqüência destas mutações nos isolados do nosso Estado e de outros locais do Brasil. Sendo assim, neste trabalho buscou-se estudar isolados de M. tuberculosis, fenotipicamente caracterizados como resistentes à PZA e/ou EMB e determinar seu perfil de susceptibilidade a partir de caracterização das mutações nos genes pncA e embB, envolvidos respectivamente com a resistência à PZA e EMB. A metodologia utilizada foi baseada primeiramente na caracterização dos isolados pelos métodos tradicionais (testes fenotípicos de susceptibilidade) seguida de extração de DNA, amplificação dos genes alvo e posteriormente seqüenciamento dos mesmos. A partir da análise das seqüências obtidas foi possível caracterizar 12 novas mutações no gene pncA, distribuídas ao longo de todo o gene, que possivelmente estejam envolvidas com a resistência dos respectivos isolados à PZA. A análise dos isolados resistentes à EMB demonstrou que nossos isolados apresentam alterações somente no códon 306 do gene embB de M. tuberculosis. Após este estudo, será possível avaliar a ocorrência das mutações nos genes específicos e inferir sobre a possível interferência das mesmas nos mecanismos relacionados com a resistência a essas drogas. Conhecendo melhor os isolados de nosso país, poderemos fornecer informações para o desenvolvimento de um melhor método de detecção da resistência. Este método, depois de adequadamente testado poderá colaborar de forma decisiva nos programas de controle da tuberculose. / Extensive research about Mycobacterium tuberculosis resistance to drugs used in tuberculosis (TB) treatment has been performed in order to have a better understanding of the mechanisms used by mycobacteria. Once active transmission of drug resistant strains of M. tuberculosis has been occurring both in Rio Grande do Sul State and in other regions of Brazil, it brought up the need of performing a study related to M. tuberculosis pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB) resistance. It is known that specific genes are targets of alterations, which can lead to M. tuberculosis resistance, however, up to this moment there are no records about types or frequencies of those mutations in isolates from Rio Grande do Sul State and other sites in Brazil. Thus, in this study we aimed to evaluate M. tuberculosis isolates phenotypically characterized as PZA and/or EMB resistant, in order to determine their susceptibility profile based on the characterization of mutations in pncA and embB genes, involved in PZA and EMB resistance, respectively. Methodology used in the study was primarily based on the characterization of isolates by conventional methods (phenotypic susceptibility tests) followed by DNA extraction, target genes amplification and DNA sequencing. Sequence analysis revealed 12 novel mutations in pncA gene distributed all along the gene and they are possibly involved with PZA resistance in those isolates. Analysis of EMB resistant isolates showed our isolates presented alterations at codon 306 of embB gene of M. tuberculosis only. From this study it will be possible to evaluate the presence of mutations in specific genes in order to establish a correlation between their occurrence and the effects in the mechanisms related to the emergence of resistance to those drugs. Improving our knowledge about the isolates in our country we will be able to provide information that can be useful for the development of a methodology for the early detection of resistance. This methodology, if properly tested and validated can be highly helpful for the improvement of TB control programs.

O transtorno do espectro autista (TEA) é uma alteração do desenvolvimento neuropsiquiátrico que afeta três grandes áreas: interesse social, dificuldade de comunicação e comportamentos restritos. O TEA pode estar presente em algumas síndromes já bem descritas, como a Síndrome do X frágil (SXF), que é a mais frequente causa de retardo mental herdável, e também está associada a transtornos de desenvolvimento. O gene MTHFR faz parte do metabolismo do ácido fólico e está associado a síntese de nucleotídeos e metilação do DNA. O polimorfismos C677T deste gene, está relacionado a hipometilação quando na presença do alelo T, levando a alterações na expressão gênica. O objetivo deste trabalho foi investigar a ocorrência da síndrome do X-frágil e de variantes polimórficas no gene MTHFR em uma amostra de pacientes do sexo masculino e feminino com TEA. Analisamos uma amostra de 154 crianças diagnosticadas com TEA idiopático, sendo que 136 destas foram testadas para a SXF (97 meninos e 39 meninas). Todas as análises moleculares foram feitas a partir da técnica de PCR. Uma vez que a triagem fosse positiva para SXF, o DNA do paciente foi encaminhado para confirmação por Southern Blotting. Nossa análise molecular identificou três (3,1%) meninos com mutação completa, e para a maioria das meninas o resultado se mostrou inconclusivo (71,8%). Para o teste de associação do polimorfismo C677T do gene MTHFR e a susceptibilidade a TEA, analisamos 151 crianças com TEA idiopático e 100 crianças controles. Não foram observadas diferenças significativas na distribuição alélica (T=0,38 casos e T=0,35 controle) nem na distribuição genotípica (p=0,72) entre os dois grupos. Nenhuma associação foi encontrada entre a presença do alelo T e comportamentos autistas selecionados: evitação do olhar, movimentos corporais complexos e auto-agressão. Estes resultados mostram que a SXF representa uma fração importante dos casos de autismo idiopático pois nem sempre a expressão clinica da doença é identificada pela equipe medica. Além disto, ao contrario de outros trabalhos prévios, na nossa população, polimorfismos no gene MHTFR não representam papel na suscetibilidade aos transtornos do espectro autista. / Autism spectrum disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder that acts in three areas: social interests, communication difficulties and restrict behaviors. ASD can be present in Fragile X Syndrome (FXS) that is the most frequent cause of inherited mental retardation and it is also associated a developmental disorders. The MTHFR gene plays in acid folic pathway and it is associated with the nucleotide synthesis and DNA methylation. The C677T MTHFR polymorphism is related with hypomethylation when T allele is present, leading to genic expression alterations. We analyzed a sample of 154 children with idiopatic TEA, being 136 tested for XFS through PCR technique (97 males and 39 females). All molecular analysis were made from PCR technique. Once the screening was positive for FXS, the patient DNA was referred for confirmation by Southern Blotting. In our molecular analyse, we identified three (3.1%) boys with full mutation, and for the girls, 71.8% was inconclusive. By analysing the MTHFR C677T polymorphism association and the susceptibility for TEA, we analyzed 151 children with idiopatic TEA and 100 controls children. There were any significant differences in allelic distribution (T=0.38 cases and T=0.35 controls) or genotypic distribution (p=0.72) between the groups. No association was found between the presence of T allele and autistic behaviors selected: averted gaze, complex body movements and self-injury behavior. These results show that FXS presents a significant part of idiopatic autism cases because is not always the expression of clinical disease is identified by the medical team. Moreover, unlike other previous studies, in our population, polymorphisms in the gene MHTFR do not represent role in susceptibility to autism spectrum disorders.

Os estudos sobre a resistência de Mycobacterium tuberculosis aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB), vêm sendo cada vez mais explorados com o objetivo de entender melhor como funcionam os mecanismos utilizados pela micobactéria. A partir do aumento da transmissão ativa de linhagens de M. tuberculosis resistentes às drogas, tanto no Rio Grande do Sul quanto em outras regiões do Brasil, fez-se necessário um estudo relativo à resistência de M. tuberculosis à pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB). Sabe-se até o momento que existem genes específicos que, possivelmente sejam alvos de alterações e podem proporcionar resistência ao M. tuberculosis, no entanto ainda não se têm relatos do tipo e da freqüência destas mutações nos isolados do nosso Estado e de outros locais do Brasil. Sendo assim, neste trabalho buscou-se estudar isolados de M. tuberculosis, fenotipicamente caracterizados como resistentes à PZA e/ou EMB e determinar seu perfil de susceptibilidade a partir de caracterização das mutações nos genes pncA e embB, envolvidos respectivamente com a resistência à PZA e EMB. A metodologia utilizada foi baseada primeiramente na caracterização dos isolados pelos métodos tradicionais (testes fenotípicos de susceptibilidade) seguida de extração de DNA, amplificação dos genes alvo e posteriormente seqüenciamento dos mesmos. A partir da análise das seqüências obtidas foi possível caracterizar 12 novas mutações no gene pncA, distribuídas ao longo de todo o gene, que possivelmente estejam envolvidas com a resistência dos respectivos isolados à PZA. A análise dos isolados resistentes à EMB demonstrou que nossos isolados apresentam alterações somente no códon 306 do gene embB de M. tuberculosis. Após este estudo, será possível avaliar a ocorrência das mutações nos genes específicos e inferir sobre a possível interferência das mesmas nos mecanismos relacionados com a resistência a essas drogas. Conhecendo melhor os isolados de nosso país, poderemos fornecer informações para o desenvolvimento de um melhor método de detecção da resistência. Este método, depois de adequadamente testado poderá colaborar de forma decisiva nos programas de controle da tuberculose. / Extensive research about Mycobacterium tuberculosis resistance to drugs used in tuberculosis (TB) treatment has been performed in order to have a better understanding of the mechanisms used by mycobacteria. Once active transmission of drug resistant strains of M. tuberculosis has been occurring both in Rio Grande do Sul State and in other regions of Brazil, it brought up the need of performing a study related to M. tuberculosis pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB) resistance. It is known that specific genes are targets of alterations, which can lead to M. tuberculosis resistance, however, up to this moment there are no records about types or frequencies of those mutations in isolates from Rio Grande do Sul State and other sites in Brazil. Thus, in this study we aimed to evaluate M. tuberculosis isolates phenotypically characterized as PZA and/or EMB resistant, in order to determine their susceptibility profile based on the characterization of mutations in pncA and embB genes, involved in PZA and EMB resistance, respectively. Methodology used in the study was primarily based on the characterization of isolates by conventional methods (phenotypic susceptibility tests) followed by DNA extraction, target genes amplification and DNA sequencing. Sequence analysis revealed 12 novel mutations in pncA gene distributed all along the gene and they are possibly involved with PZA resistance in those isolates. Analysis of EMB resistant isolates showed our isolates presented alterations at codon 306 of embB gene of M. tuberculosis only. From this study it will be possible to evaluate the presence of mutations in specific genes in order to establish a correlation between their occurrence and the effects in the mechanisms related to the emergence of resistance to those drugs. Improving our knowledge about the isolates in our country we will be able to provide information that can be useful for the development of a methodology for the early detection of resistance. This methodology, if properly tested and validated can be highly helpful for the improvement of TB control programs.

Os estudos sobre a resistência de Mycobacterium tuberculosis aos fármacos utilizados no tratamento da tuberculose (TB), vêm sendo cada vez mais explorados com o objetivo de entender melhor como funcionam os mecanismos utilizados pela micobactéria. A partir do aumento da transmissão ativa de linhagens de M. tuberculosis resistentes às drogas, tanto no Rio Grande do Sul quanto em outras regiões do Brasil, fez-se necessário um estudo relativo à resistência de M. tuberculosis à pirazinamida (PZA) e etambutol (EMB). Sabe-se até o momento que existem genes específicos que, possivelmente sejam alvos de alterações e podem proporcionar resistência ao M. tuberculosis, no entanto ainda não se têm relatos do tipo e da freqüência destas mutações nos isolados do nosso Estado e de outros locais do Brasil. Sendo assim, neste trabalho buscou-se estudar isolados de M. tuberculosis, fenotipicamente caracterizados como resistentes à PZA e/ou EMB e determinar seu perfil de susceptibilidade a partir de caracterização das mutações nos genes pncA e embB, envolvidos respectivamente com a resistência à PZA e EMB. A metodologia utilizada foi baseada primeiramente na caracterização dos isolados pelos métodos tradicionais (testes fenotípicos de susceptibilidade) seguida de extração de DNA, amplificação dos genes alvo e posteriormente seqüenciamento dos mesmos. A partir da análise das seqüências obtidas foi possível caracterizar 12 novas mutações no gene pncA, distribuídas ao longo de todo o gene, que possivelmente estejam envolvidas com a resistência dos respectivos isolados à PZA. A análise dos isolados resistentes à EMB demonstrou que nossos isolados apresentam alterações somente no códon 306 do gene embB de M. tuberculosis. Após este estudo, será possível avaliar a ocorrência das mutações nos genes específicos e inferir sobre a possível interferência das mesmas nos mecanismos relacionados com a resistência a essas drogas. Conhecendo melhor os isolados de nosso país, poderemos fornecer informações para o desenvolvimento de um melhor método de detecção da resistência. Este método, depois de adequadamente testado poderá colaborar de forma decisiva nos programas de controle da tuberculose. / Extensive research about Mycobacterium tuberculosis resistance to drugs used in tuberculosis (TB) treatment has been performed in order to have a better understanding of the mechanisms used by mycobacteria. Once active transmission of drug resistant strains of M. tuberculosis has been occurring both in Rio Grande do Sul State and in other regions of Brazil, it brought up the need of performing a study related to M. tuberculosis pyrazinamide (PZA) and ethambutol (EMB) resistance. It is known that specific genes are targets of alterations, which can lead to M. tuberculosis resistance, however, up to this moment there are no records about types or frequencies of those mutations in isolates from Rio Grande do Sul State and other sites in Brazil. Thus, in this study we aimed to evaluate M. tuberculosis isolates phenotypically characterized as PZA and/or EMB resistant, in order to determine their susceptibility profile based on the characterization of mutations in pncA and embB genes, involved in PZA and EMB resistance, respectively. Methodology used in the study was primarily based on the characterization of isolates by conventional methods (phenotypic susceptibility tests) followed by DNA extraction, target genes amplification and DNA sequencing. Sequence analysis revealed 12 novel mutations in pncA gene distributed all along the gene and they are possibly involved with PZA resistance in those isolates. Analysis of EMB resistant isolates showed our isolates presented alterations at codon 306 of embB gene of M. tuberculosis only. From this study it will be possible to evaluate the presence of mutations in specific genes in order to establish a correlation between their occurrence and the effects in the mechanisms related to the emergence of resistance to those drugs. Improving our knowledge about the isolates in our country we will be able to provide information that can be useful for the development of a methodology for the early detection of resistance. This methodology, if properly tested and validated can be highly helpful for the improvement of TB control programs.

O Mycobacterium tuberculosis é intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Esta resistência é devida, principalmente, ao envelope hidrofóbico da célula bacteriana que atua como uma barreira efetiva para diversos compostos. Outros determinantes da sua resistência intrínseca incluem enzimas hidrolíticas e bombas de efluxo de drogas. A resistência adquirida em isolados clínicos de M. tuberculosis é principalmente devida a mutações em genes que codificam alvos para os fármacos ou em seus ativadores. Apesar disso, um número entre 5–30% das cepas resistentes não têm caracterizado o seu mecanismo de resistência, considerando-se o sistema de efluxo como uma das possibilidades para esta resistência. O efluxo é o resultado da atividade de proteínas transportadoras envolvidas na extrusão de substâncias (incluindo todas as classes de relevantes antimicrobianos clínicos) de dentro da célula para o meio externo. O principal objetivo deste trabalho foi comparar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) em condições de diferentes tratamentos (presença e ausência de inibição do sistema de efluxo) e os resultados obtidos com o seqüenciamento dos genes rpsL e rrs. Para isso foram testados 79 isolados de M. tuberculosis, destes, 43 (54%) isolados apresentaram mutações; 38 (48%) diminuíram a CMI na presença de inibidores do sistema de efluxo, sendo que isso ocorreu tanto em isolados resistentes ou sensíveis, mutados ou não-mutados. Em três isolados resistentes a estreptomicina não foram identificadas alterações nos genes rpsL e rrs e na presença de inibidores do sistema de efluxo a resistência foi diminuída. A diminuição da CMI nesses isolados resistentes, embora sem mutação, indica uma possível participação do sistema de efluxo. Nas cepas mutadas, o mecanismo de efluxo, estaria aumentando a tolerância do isolado à concentração da droga. Estas últimas possuiriam dois mecanismos de resistência atuantes (mutação nos genes alvo do fármaco e superexpressão das proteínas de membrana responsáveis pelo efluxo de drogas). / Mycobacterium tuberculosis is naturally resistant to many antimicrobials. This resistance is due mainly to the hydrophobic cell envelope acting as an effective permeability barrier for many compounds. Other determinants ones of its intrinsic resistance include hydrolytic enzymes and efflux pumps of drugs. The acquired resistance in clinical isolates of M. tuberculosis is mainly due to mutations in genes that encode targets for drugs substances or in their activators. Even so, in 5-30% of the resistant strains the resistance mechanism is not known and the efflux system has been considered as one of the possibilities for this resistance. Efflux is the result of the activity of transport proteins involved in extrusion of substances (including all classes of clinically relevant antimicrobials) from the interior of the cells into the external environment. The main goal of this study is to compare the Minimal Inibitory Concentration (MIC) in different conditions (with or without efflux system inhibitors) and the sequencing data of the rpsL and rrs genes. For that we have analized 79 M. tuberculosis isolates, and from these, 43 (54%) presented mutations; 38 (48%) decreased the MIC in presence of efflux system inhibitors. This decrease in MIC occurred in resistant or sensitive isolates, with or without mutations. Three resistant isolates did not present any mutations in rpsL and rrs genes and in presence of efflux system inhibitors the resistance decreased. The decrease of MIC in these resistant isolates, although without mutation, indicates participation of the efflux system. In the mutated isolates the efflux system could increase the tolerance to drug concentration. In these isolates two resistance mechanisms must be acting (mutation on the drug target genes and over-expression of membrane proteins responsible for the drug efflux).

O Mycobacterium tuberculosis é intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Esta resistência é devida, principalmente, ao envelope hidrofóbico da célula bacteriana que atua como uma barreira efetiva para diversos compostos. Outros determinantes da sua resistência intrínseca incluem enzimas hidrolíticas e bombas de efluxo de drogas. A resistência adquirida em isolados clínicos de M. tuberculosis é principalmente devida a mutações em genes que codificam alvos para os fármacos ou em seus ativadores. Apesar disso, um número entre 5–30% das cepas resistentes não têm caracterizado o seu mecanismo de resistência, considerando-se o sistema de efluxo como uma das possibilidades para esta resistência. O efluxo é o resultado da atividade de proteínas transportadoras envolvidas na extrusão de substâncias (incluindo todas as classes de relevantes antimicrobianos clínicos) de dentro da célula para o meio externo. O principal objetivo deste trabalho foi comparar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) em condições de diferentes tratamentos (presença e ausência de inibição do sistema de efluxo) e os resultados obtidos com o seqüenciamento dos genes rpsL e rrs. Para isso foram testados 79 isolados de M. tuberculosis, destes, 43 (54%) isolados apresentaram mutações; 38 (48%) diminuíram a CMI na presença de inibidores do sistema de efluxo, sendo que isso ocorreu tanto em isolados resistentes ou sensíveis, mutados ou não-mutados. Em três isolados resistentes a estreptomicina não foram identificadas alterações nos genes rpsL e rrs e na presença de inibidores do sistema de efluxo a resistência foi diminuída. A diminuição da CMI nesses isolados resistentes, embora sem mutação, indica uma possível participação do sistema de efluxo. Nas cepas mutadas, o mecanismo de efluxo, estaria aumentando a tolerância do isolado à concentração da droga. Estas últimas possuiriam dois mecanismos de resistência atuantes (mutação nos genes alvo do fármaco e superexpressão das proteínas de membrana responsáveis pelo efluxo de drogas). / Mycobacterium tuberculosis is naturally resistant to many antimicrobials. This resistance is due mainly to the hydrophobic cell envelope acting as an effective permeability barrier for many compounds. Other determinants ones of its intrinsic resistance include hydrolytic enzymes and efflux pumps of drugs. The acquired resistance in clinical isolates of M. tuberculosis is mainly due to mutations in genes that encode targets for drugs substances or in their activators. Even so, in 5-30% of the resistant strains the resistance mechanism is not known and the efflux system has been considered as one of the possibilities for this resistance. Efflux is the result of the activity of transport proteins involved in extrusion of substances (including all classes of clinically relevant antimicrobials) from the interior of the cells into the external environment. The main goal of this study is to compare the Minimal Inibitory Concentration (MIC) in different conditions (with or without efflux system inhibitors) and the sequencing data of the rpsL and rrs genes. For that we have analized 79 M. tuberculosis isolates, and from these, 43 (54%) presented mutations; 38 (48%) decreased the MIC in presence of efflux system inhibitors. This decrease in MIC occurred in resistant or sensitive isolates, with or without mutations. Three resistant isolates did not present any mutations in rpsL and rrs genes and in presence of efflux system inhibitors the resistance decreased. The decrease of MIC in these resistant isolates, although without mutation, indicates participation of the efflux system. In the mutated isolates the efflux system could increase the tolerance to drug concentration. In these isolates two resistance mechanisms must be acting (mutation on the drug target genes and over-expression of membrane proteins responsible for the drug efflux).

O Mycobacterium tuberculosis é intrinsecamente resistente a diversos antimicrobianos. Esta resistência é devida, principalmente, ao envelope hidrofóbico da célula bacteriana que atua como uma barreira efetiva para diversos compostos. Outros determinantes da sua resistência intrínseca incluem enzimas hidrolíticas e bombas de efluxo de drogas. A resistência adquirida em isolados clínicos de M. tuberculosis é principalmente devida a mutações em genes que codificam alvos para os fármacos ou em seus ativadores. Apesar disso, um número entre 5–30% das cepas resistentes não têm caracterizado o seu mecanismo de resistência, considerando-se o sistema de efluxo como uma das possibilidades para esta resistência. O efluxo é o resultado da atividade de proteínas transportadoras envolvidas na extrusão de substâncias (incluindo todas as classes de relevantes antimicrobianos clínicos) de dentro da célula para o meio externo. O principal objetivo deste trabalho foi comparar a Concentração Mínima Inibitória (CMI) em condições de diferentes tratamentos (presença e ausência de inibição do sistema de efluxo) e os resultados obtidos com o seqüenciamento dos genes rpsL e rrs. Para isso foram testados 79 isolados de M. tuberculosis, destes, 43 (54%) isolados apresentaram mutações; 38 (48%) diminuíram a CMI na presença de inibidores do sistema de efluxo, sendo que isso ocorreu tanto em isolados resistentes ou sensíveis, mutados ou não-mutados. Em três isolados resistentes a estreptomicina não foram identificadas alterações nos genes rpsL e rrs e na presença de inibidores do sistema de efluxo a resistência foi diminuída. A diminuição da CMI nesses isolados resistentes, embora sem mutação, indica uma possível participação do sistema de efluxo. Nas cepas mutadas, o mecanismo de efluxo, estaria aumentando a tolerância do isolado à concentração da droga. Estas últimas possuiriam dois mecanismos de resistência atuantes (mutação nos genes alvo do fármaco e superexpressão das proteínas de membrana responsáveis pelo efluxo de drogas). / Mycobacterium tuberculosis is naturally resistant to many antimicrobials. This resistance is due mainly to the hydrophobic cell envelope acting as an effective permeability barrier for many compounds. Other determinants ones of its intrinsic resistance include hydrolytic enzymes and efflux pumps of drugs. The acquired resistance in clinical isolates of M. tuberculosis is mainly due to mutations in genes that encode targets for drugs substances or in their activators. Even so, in 5-30% of the resistant strains the resistance mechanism is not known and the efflux system has been considered as one of the possibilities for this resistance. Efflux is the result of the activity of transport proteins involved in extrusion of substances (including all classes of clinically relevant antimicrobials) from the interior of the cells into the external environment. The main goal of this study is to compare the Minimal Inibitory Concentration (MIC) in different conditions (with or without efflux system inhibitors) and the sequencing data of the rpsL and rrs genes. For that we have analized 79 M. tuberculosis isolates, and from these, 43 (54%) presented mutations; 38 (48%) decreased the MIC in presence of efflux system inhibitors. This decrease in MIC occurred in resistant or sensitive isolates, with or without mutations. Three resistant isolates did not present any mutations in rpsL and rrs genes and in presence of efflux system inhibitors the resistance decreased. The decrease of MIC in these resistant isolates, although without mutation, indicates participation of the efflux system. In the mutated isolates the efflux system could increase the tolerance to drug concentration. In these isolates two resistance mechanisms must be acting (mutation on the drug target genes and over-expression of membrane proteins responsible for the drug efflux).