Restrikcijos endonukleazės (REazės) yra vieni dažniausiai naudojamų fermentų molekulinėje biologijoje, todėl ieškoma alternatyvių kelių REazių specifiškumo variantų padidinimui. Deja, po nesėkmingų kryptingo restrikcijos fermentų substratinio specifiškumo keitimo eksperimentų, pastaruoju metu ima vyrauti nuomonė, kad tik atsitiktinė mutagenezė arba jos derinimas su tam tikrų aminorūgščių kryptingu keitimu gali padėti sukurti naujo specifiškumo REazes, kurių atranka neįmanoma be efektyvių in vivo atrankos metodų. Biotechnologijos instituto Prokariotų genų inžinerijos laboratorijoje buvo iškelta hipotezė: derinant posegregacinio ląstelių žudymo (PSŽ) efektą ir persidengiančių DNR sekų metilinimą, galima vykdyti naujo specifiškumo mutantinių REazių atranką. Darbo objektu pasirinkta IIS potipio R–M sistemų pora Eco31I (5’-GGTCTC-3’)/Alw26I (5’-GTCTC-3’), kurių atpažįstamos DNR sekos persidengia. SOS atsako indikatoriniam kamienui ER1992 ekspresuojant temperatūrai jautrios (ts) replikacijos plazmidę, koduojančią alw26IM, ir stabilią plazmidę, koduojančią atsitiktinai mutuotus eco31IR genus, bei wt eco31IM, nepalankiomis (PSŽ) ts replikacijos plazmidei sąlygomis būtų galima atrinkti pakeisto arba pakitusio specifiškumo restrikcijos fermentus. Po ts plazmidės pametimo, SOS atsakas bus sukeliamas tose ląstelėse, kurios turės plazmides koduojančias mutantines REazes (atpažįstama seka – 5‘-XGTCTC-3). Darbo metu buvo atrinktos 8-ios pakitusio specifiškumo mutantinės REazės. Mutacijų... [toliau žr. visą tekstą] / Restriction endonucleases are among the most commonly used enzymes in molecular biology. Consequently, changing their very high sequence specificity is one of the scientific goals in studying these enzymes. After unseccessful efforts to generate new specificities by directed mutagenesis it is widely believable that random mutagenesis or its combination with directed mutagenesis can help to generate restriction endonucleases with the new specificity. In addition, random mutagenesis must be combined with effective in vivo selection system. We reasoned that combination of the RM gene complex–mediated postsegregational cell killing (PSK) effect and methylation of overlapping sequences could be used in the selection of active Eco31I restriction endonuclease mutants. To support this idea, eco31IR (recognition sequence 5‘-GGTCTC-3‘) after the random mutagenesis was cloned into stable vector pUC19 (carrying eco31IM gene) and alw26IM (5‘-GTCTC-3‘ recognition sequence) gene was cloned into thermosensitive (ts) vector. Upon loss of ts plasmid at high temperature, the SOS response was induced by eco31IR gene–mediated PSK effect. Thus, transformants carrying a changed specificity Eco31I restriction endonuclease could be selected by indicative blue colour of colony–forming cells in case if special reporter E.coli strain is used. We succeeded in isolating of 8 active Eco31I mutants. Six of them had common D231V amino acid substitution resulting in a weaking of enzyme activity with the... [to full text]