Šio darbo tikslas – taikant in vivo transkripcijos interferencijos sistemą, ištirti laukinio tipo restrikcijos endonukleazės (REazės) Eco31I (atpažįsta DNR seką 5’-GGTCTC-3’) ir mutantinės REazės Eco31IQ69R/K127I (atpažįsta DNR seką 5’-(G/W)GTCTC-3’) sąveikos su DNR sekomis 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’, 5’-CGTCTC-3‘ savybes. In vivo transkripcijos interferencijos sistemą sudaro aadA genas (sąlygoja atsparumą spektinomicinui) ir priešprasmis stiprus konstitutyvinis E. coli promotorius conII, nuo kurio vykstanti transkripcija blokuoja aadA geno ekspresiją. Tokios ląstelės fenotipas yra SpS. Transkripcija nuo promotoriaus conII gali būti reguliuojama, įvedant specifiškai su DNR sąveikaujančių baltymų atpažįstamas DNR sekas – sintetinius operatorius. Sąveikaudamas su atpažįstama DNR seka, baltymas veikia kaip conII promotoriaus represorius. Tai sąlygoja ląstelės fenotipo pasikeitimą į SpR. Darbo metu buvo sukonstruotos keturios transkripcijos inerferencijos sistemos plazmidės, kuriose promotorius conII turi operatorines sekas: 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’, 5’-CGTCTC-3‘. REazė, nesant apsaugančios metilazės, turi letalų poveiki ląstelei-šeimininkui, todėl darbe buvo naudoti katalitiškai neaktyvūs fermento mutantai Eco31IH312A ir Eco31IQ69R/K127I+H312A. A priori tikėtasi, kad abu fermentai specifiškai sąveikaus su 5’-GGTCTC-3’ seka, o Eco31IQ69R/K127I+H312A taip pat įtakos transkripciją nuo promotoriaus conII, sąveikaudama su 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’... [toliau žr. visą tekstą] / The aim of this study was the investigation of interaction of wild type restriction endonuclease (REase) Eco31I and mutant REase Eco31IQ69R/K127I with DNA sequences 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’ and 5’-CGTCTC-3 by an in vivo transcriptional interfererence assay. The transcriptional interference assay is composed of an aadA gene that determines the resistance to spectinomycin and antisense constitutive E. coli promoter conII. The expression of aadA gene is blocked by the transcription from promoter conII and, therefore, the phenotype is SpS. The promoter conII could be regulated by installing operator sequence. DNA-binding protein binds to this recognition sequence and acts as a repressor of promoter conII. This interaction determines transformation of the phenotype to SpR. Four transcriptional interference system plasmids with operon sequences 5’-GGTCTC-3’, 5’-AGTCTC-3’, 5’-TGTCTC-3’and 5’-CGTCTC-3’ were engineered during this study. Cleavage deficient variants Eco31IH312A and Eco31IQ69R/K127I+H312A were tested, because the presence of REase in the absence of cognate DNA methyltransferase is lethal to the host. We predicted that the both enzymes (Eco31IH312A and Eco31IQ69R/K127I+H312A) would interact with 5’-GGTCTC-3’ sequence. Therefore, the interaction of Eco31IQ69R/K127I+H312A with sequences 5’-AGTCTC-3’ and 5’-TGTCTC-3’ at the lower level was expected. The optimal conditions of transcriptional interference were selected and the both enzymes interacted only with... [to full text]

Restrikcijos endonukleazės (REazės) yra vieni dažniausiai naudojamų fermentų molekulinėje biologijoje, todėl ieškoma alternatyvių kelių REazių specifiškumo variantų padidinimui. Deja, po nesėkmingų kryptingo restrikcijos fermentų substratinio specifiškumo keitimo eksperimentų, pastaruoju metu ima vyrauti nuomonė, kad tik atsitiktinė mutagenezė arba jos derinimas su tam tikrų aminorūgščių kryptingu keitimu gali padėti sukurti naujo specifiškumo REazes, kurių atranka neįmanoma be efektyvių in vivo atrankos metodų. Biotechnologijos instituto Prokariotų genų inžinerijos laboratorijoje buvo iškelta hipotezė: derinant posegregacinio ląstelių žudymo (PSŽ) efektą ir persidengiančių DNR sekų metilinimą, galima vykdyti naujo specifiškumo mutantinių REazių atranką. Darbo objektu pasirinkta IIS potipio R–M sistemų pora Eco31I (5’-GGTCTC-3’)/Alw26I (5’-GTCTC-3’), kurių atpažįstamos DNR sekos persidengia. SOS atsako indikatoriniam kamienui ER1992 ekspresuojant temperatūrai jautrios (ts) replikacijos plazmidę, koduojančią alw26IM, ir stabilią plazmidę, koduojančią atsitiktinai mutuotus eco31IR genus, bei wt eco31IM, nepalankiomis (PSŽ) ts replikacijos plazmidei sąlygomis būtų galima atrinkti pakeisto arba pakitusio specifiškumo restrikcijos fermentus. Po ts plazmidės pametimo, SOS atsakas bus sukeliamas tose ląstelėse, kurios turės plazmides koduojančias mutantines REazes (atpažįstama seka – 5‘-XGTCTC-3). Darbo metu buvo atrinktos 8-ios pakitusio specifiškumo mutantinės REazės. Mutacijų... [toliau žr. visą tekstą] / Restriction endonucleases are among the most commonly used enzymes in molecular biology. Consequently, changing their very high sequence specificity is one of the scientific goals in studying these enzymes. After unseccessful efforts to generate new specificities by directed mutagenesis it is widely believable that random mutagenesis or its combination with directed mutagenesis can help to generate restriction endonucleases with the new specificity. In addition, random mutagenesis must be combined with effective in vivo selection system. We reasoned that combination of the RM gene complex–mediated postsegregational cell killing (PSK) effect and methylation of overlapping sequences could be used in the selection of active Eco31I restriction endonuclease mutants. To support this idea, eco31IR (recognition sequence 5‘-GGTCTC-3‘) after the random mutagenesis was cloned into stable vector pUC19 (carrying eco31IM gene) and alw26IM (5‘-GTCTC-3‘ recognition sequence) gene was cloned into thermosensitive (ts) vector. Upon loss of ts plasmid at high temperature, the SOS response was induced by eco31IR gene–mediated PSK effect. Thus, transformants carrying a changed specificity Eco31I restriction endonuclease could be selected by indicative blue colour of colony–forming cells in case if special reporter E.coli strain is used. We succeeded in isolating of 8 active Eco31I mutants. Six of them had common D231V amino acid substitution resulting in a weaking of enzyme activity with the... [to full text]

II tipo restrikcijos endonukleazės atpažįsta specifines DNR sekas ir kerpa DNR šiose sekose arba šalia jų. BpuJI, atpažįstanti 5’-CCCGT seką, skiriasi nuo kitų fermentų tuo, kad jos kirpimo vieta yra labai variabili. Čia parodoma, kad BpuJI yra dimeras, sudarytas iš dviejų monomerų, kurie turi po du atskirus domenus. BpuJI N domenas atpažįsta taikinį kaip monomeras, o C-domenas pasižymi nukleaziniu aktyvumu ir dimerizuojasi. Apo-fermento nukleazinis aktyvumas yra nuslopintas. N-domenams atpažinus taikinį, aktyvuojamas C-domenas, kuris perkerpa DNR šalia taikinio. Be to, aktyvuotas C-domenas yra nespecifinė nukleazė, linkusi nukirpti ~3 nt nuo buko dvigrandės DNR galo. Taigi, BpuJI DNR karpymo pobūdis yra labai sudėtingas. Bioinformatinė analizė ir kryptinga mutagenezė parodė, kad BpuJI C-domenas turi PD-(D/E)XK struktūrinę sanklodą ir yra panašus į archėjų Holidėjaus jungtis karpančias nukleazes. Išsprendus 1,3 Å skiriamosios gebos BpuJI N-domeno/DNR komplekso erdvinė struktūrą, paaiškėjo, kad šį domeną sudaro du „sparnuotą“ spiralė-linkis-spiralė motyvą turintys subdomenai. BpuJI taikinį atpažįsta aminorūgštys, esančios N-rankoje ir abiejų spiralė-linkis-spiralė motyvų atpažinimo spiralėse. BpuJI N-domenas yra labiausiai panašus į Nt.BspD6I nukleazę, kerpančią vieną DNR grandinę. Nt.BspD6I/DNR komplekso struktūros modelis rodo, kad Nt.BspD6I ir BpuJI taikinį atpažįstantys struktūriniai elementai yra panašūs. / Type II restriction endonucleases recognize specific DNA sequences and cleave DNA at fixed positions within or close to this sequence. BpuJI recognizes the 5’-CCCGT sequence, but in contrast to other enzymes its cleavage site is very variable. This study shows that BpuJI is a dimer in solution and consists of two separate domains. The N-domain binds to the target sequence as a monomer, while the C-domain is responsible for nuclease activity and dimerization. The nuclease activity is repressed in the apo-enzyme and becomes activated upon specific DNA binding by the N-domains. The activated C-domain cleaves DNA near the target site. In addition, it possesses an end-directed nuclease activity and preferentially cuts ~3 nt from the 3’ terminus. This leads to a very complicated pattern of DNA cleavage. Bioinformatics and mutational analysis revealed that the BpuJI C-domain harbours a PD (D/E)XK active site and is structurally related to archaeal Holliday junction resolvases. The crystal structure of the BpuJI N-domain bound to cognate DNA was solved at 1.3 Å resolution. It revealed two winged-helix subdomains, D1 and D2. The recognition of the target sequence is achieved the amino acid residues located on both the HTH motifs and an N-terminal arm. The BpuJI DNA recognition domain is most similar to the nicking endonuclease Nt.BspD6I. The modelling suggests that Nt.BspD6I could share the specificity-determining regions with BpuJI.

Type II restriction endonucleases recognize specific DNA sequences and cleave DNA at fixed positions within or close to this sequence. BpuJI recognizes the 5’-CCCGT sequence, but in contrast to other enzymes its cleavage site is very variable. This study shows that BpuJI is a dimer in solution and consists of two separate domains. The N-domain binds to the target sequence as a monomer, while the C-domain is responsible for nuclease activity and dimerization. The nuclease activity is repressed in the apo-enzyme and becomes activated upon specific DNA binding by the N-domains. The activated C-domain cleaves DNA near the target site. In addition, it possesses an end-directed nuclease activity and preferentially cuts ~3 nt from the 3’ terminus. This leads to a very complicated pattern of DNA cleavage. Bioinformatics and mutational analysis revealed that the BpuJI C-domain harbours a PD (D/E)XK active site and is structurally related to archaeal Holliday junction resolvases. The crystal structure of the BpuJI N-domain bound to cognate DNA was solved at 1.3 Å resolution. It revealed two winged-helix subdomains, D1 and D2. The recognition of the target sequence is achieved the amino acid residues located on both the HTH motifs and an N-terminal arm. The BpuJI DNA recognition domain is most similar to the nicking endonuclease Nt.BspD6I. The modelling suggests that Nt.BspD6I could share the specificity-determining regions with BpuJI. / II tipo restrikcijos endonukleazės atpažįsta specifines DNR sekas ir kerpa DNR šiose sekose arba šalia jų. BpuJI, atpažįstanti 5’-CCCGT seką, skiriasi nuo kitų fermentų tuo, kad jos kirpimo vieta yra labai variabili. Čia parodoma, kad BpuJI yra dimeras, sudarytas iš dviejų monomerų, kurie turi po du atskirus domenus. BpuJI N domenas atpažįsta taikinį kaip monomeras, o C-domenas pasižymi nukleaziniu aktyvumu ir dimerizuojasi. Apo-fermento nukleazinis aktyvumas yra nuslopintas. N-domenams atpažinus taikinį, aktyvuojamas C-domenas, kuris perkerpa DNR šalia taikinio. Be to, aktyvuotas C-domenas yra nespecifinė nukleazė, linkusi nukirpti ~3 nt nuo buko dvigrandės DNR galo. Taigi, BpuJI DNR karpymo pobūdis yra labai sudėtingas. Bioinformatinė analizė ir kryptinga mutagenezė parodė, kad BpuJI C-domenas turi PD-(D/E)XK struktūrinę sanklodą ir yra panašus į archėjų Holidėjaus jungtis karpančias nukleazes. Išsprendus 1,3 Å skiriamosios gebos BpuJI N-domeno/DNR komplekso erdvinė struktūrą, paaiškėjo, kad šį domeną sudaro du „sparnuotą“ spiralė-linkis-spiralė motyvą turintys subdomenai. BpuJI taikinį atpažįsta aminorūgštys, esančios N-rankoje ir abiejų spiralė-linkis-spiralė motyvų atpažinimo spiralėse. BpuJI N-domenas yra labiausiai panašus į Nt.BspD6I nukleazę, kerpančią vieną DNR grandinę. Nt.BspD6I/DNR komplekso struktūros modelis rodo, kad Nt.BspD6I ir BpuJI taikinį atpažįstantys struktūriniai elementai yra panašūs.

Mutacijos, atsiradusios atitinkamuose žmogaus genuose, gali lemti pakitusių baltymų atsiradimą, kurie sukelia įvairias ligas (pvz.: vėžį), klaidingą embriono vystymąsi ar priešlaikinę mirtį. Tokios genetinės ligos gali būti gydomos genų terapijos būdu. Labiausiai vystoma genų terapijos strategija yra paremta homologine rekombinacija, kurios metu DNR seka, naudojama geno taisymui, yra patiekiama in trans. Natūraliai žinduolių ląstelėse homologinė rekombinacija (HR) vyksta žemu rekombinacijos dažniu (10-6). Tačiau yra žinoma, kad dvigrandininio trūkio įvedimas žymiai pagreitina HR (10-1). In vivo eksperimentų atveju dvigrandininio trūkio įvedimas turi būti ypač tikslus, todėl šis metodas reikalauja naujų molekulinių įrankių, kurie būtų itin specifiški ir griežtai kontroliuojami. Šiame darbe mes orientavomės į itin specifiškų ir griežtai kontroliuojamų meganukleazių kūrimą naudojant restrikcijos endonukleazių (REazių)-tripleksą formuojančių oligonukleotidų (TFO) konjugatus. REazių-TFO konjugatuose TFO suteikia specifiškumą prailgintam atpažinimo taikiniui per DNR triplekso susidarymą taip nukreipdamas restrikcijos fermentą prie konkretaus taikinio kur norima įvesti dvigrandininį trūkį. Šiuo tyrimu mes parodėme dvi alternatyvias restrikcijos endonukleazių-TFO konjugatų aktyvumo reguliavimo strategijas, kas leistų šias nukleazes panaudoti in vivo tyrimuose. Tuo tikslu buvo pasirinkti ortodoksiniai restrikcijos fermentai MunI ir Bse634I, kurie mūsų laboratorijoje yra gerai... [toliau žr. visą tekstą] / Simple mutations within the coding region of critical human genes can lead to the formation of abnormal proteins, resulting in various diseases (e.g. cancer), in failure of an embryo to develop, or premature death. Genetic diseases can only be truly cured via restoration of defective gene function and one of the most promising strategies is based on homologous recombination. Naturally homologous recombination occurs with a low frequency (1 in 106 transfected cells), however it is known that DNA double-strand breaks enhance the efficiency of homologous recombination by several orders of magnitude (up to 10,000-fold). Therefore, gene therapy via homologous recombination requires new molecular tools that should be highly specific and rigorously controllable. In this work we have focused on the development of restriction enzyme-triple helix forming oligonucleotide (TFO) conjugates, where TFO provides specificity for the extended recognition site through the triple helix formation and addresses restriction enzyme to a particular target site where it introduces a double stranded break. We provide proof-of-concept demonstrations of two alternative strategies to control the DNA cleavage activity of restriction endonuclease-TFO conjugates, that allows adopt them in in vivo experiments. To this end we used restriction endonucleases MunI and Bse634I, which were structurally and biochemically characterized before in our laboratory. We successfully combined the restriction endonuclease... [to full text]

Simple mutations within the coding region of critical human genes can lead to the formation of abnormal proteins, resulting in various diseases (e.g. cancer), in failure of an embryo to develop, or premature death. Genetic diseases can only be truly cured via restoration of defective gene function and one of the most promising strategies is based on homologous recombination. Naturally homologous recombination occurs with a low frequency (1 in 106 transfected cells), however it is known that DNA double-strand breaks enhance the efficiency of homologous recombination by several orders of magnitude (up to 10,000-fold). Therefore, gene therapy via homologous recombination requires new molecular tools that should be highly specific and rigorously controllable. In this work we have focused on the development of restriction enzyme-triple helix forming oligonucleotide (TFO) conjugates, where TFO provides specificity for the extended recognition site through the triple helix formation and addresses restriction enzyme to a particular target site where it introduces a double stranded break. We provide proof-of-concept demonstrations of two alternative strategies to control the DNA cleavage activity of restriction endonuclease-TFO conjugates, that allows adopt them in in vivo experiments. To this end we used restriction endonucleases MunI and Bse634I, which were structurally and biochemically characterized before in our laboratory. We successfully combined the restriction endonuclease... [to full text] / Mutacijos, atsiradusios atitinkamuose žmogaus genuose, gali lemti pakitusių baltymų atsiradimą, kurie sukelia įvairias ligas (pvz.: vėžį), klaidingą embriono vystymąsi ar priešlaikinę mirtį. Tokios genetinės ligos gali būti gydomos genų terapijos būdu. Labiausiai vystoma genų terapijos strategija yra paremta homologine rekombinacija, kurios metu DNR seka, naudojama geno taisymui, yra patiekiama in trans. Natūraliai žinduolių ląstelėse homologinė rekombinacija (HR) vyksta žemu rekombinacijos dažniu (10-6). Tačiau yra žinoma, kad dvigrandininio trūkio įvedimas žymiai pagreitina HR (10-1). In vivo eksperimentų atveju dvigrandininio trūkio įvedimas turi būti ypač tikslus, todėl šis metodas reikalauja naujų molekulinių įrankių, kurie būtų itin specifiški ir griežtai kontroliuojami. Šiame darbe mes orientavomės į itin specifiškų ir griežtai kontroliuojamų meganukleazių kūrimą naudojant restrikcijos endonukleazių (REazių)-tripleksą formuojančių oligonukleotidų (TFO) konjugatus. REazių-TFO konjugatuose TFO suteikia specifiškumą prailgintam atpažinimo taikiniui per DNR triplekso susidarymą taip nukreipdamas restrikcijos fermentą prie konkretaus taikinio kur norima įvesti dvigrandininį trūkį. Šiuo tyrimu mes parodėme dvi alternatyvias restrikcijos endonukleazių-TFO konjugatų aktyvumo reguliavimo strategijas, kas leistų šias nukleazes panaudoti in vivo tyrimuose. Tuo tikslu buvo pasirinkti ortodoksiniai restrikcijos fermentai MunI ir Bse634I, kurie mūsų laboratorijoje yra gerai... [toliau žr. visą tekstą]