Le Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-[alpha]) est une cytokine pro-inflammatoire qui occupe un rôle central dans la physiopathologie de nombreuses pathologies inflammatoires et particulièrement l'arthrite. La neutralisation de cette cytokine par l'utilisation d'anticorps anti-TNF-[alpha] a montré son efficacité dans la polyarthrite rhumatoïde et est aujourd'hui le traitement de référence pour la prise en charge de cette pathologie. Cependant, un tiers des patients traités par anticorps anti-TNF restent réfractaires ou ne répondent pas à ce traitement. Dans ce contexte, il apparait nécessaire de développer des approches nouvelles ou complémentaires pour renforcer l'arsenal thérapeutique actuellement disponible. L'utilisation d'oligonucléotides triple hélice (TFO) permet de moduler l'expression génique de manière spécifique par interaction avec la double hélice d'ADN. Dans cette étude, nous avons évalué les potentialités anti-inflammatoires d'un TFO anti-TNF-[alpha] in vitro sur les synoviocytes et chondrocytes articulaires et in vivo dans deux modèles d'arthrite expérimentale. Ce TFO interagit avec le promoteur du gène du TNF-[alpha], et son activité inhibitrice a été comparée à celle d'une approche par ARN interférence in vitro. Dans les modèles d'arthrite aigue et chronique, l'injection intra-articulaire préventive de TFO anti-TNF-[alpha] permet une amélioration significative des symptômes arthritiques. Particulièrement, le traitement par le TFO diminue sensiblement l'inflammation synoviale et les lésions ostéocartilagineuses articulaires. Ces résultats sont les premiers à montrer la possibilité d'utiliser un TFO in vivo et offrent d'intéressantes perspectives thérapeutiques / Tumor necrosis factor alpha (TNF-[alpha]), a pro-inflammatory cytokine, plays a key role in the pathogenesis of many inflammatory diseases, including arthritis. Neutralization of this cytokine by anti-TNF-[alpha] antibodies has shown its efficacy in rheumatoid arthritis and is now widely used. Nevertheless, some patients currently treated with anti-TNF-[alpha] remain refractory or become non-responder to these treatments. In this context, there is a need for new or complementary therapeutic strategies. Triplex forming oligonucleotides (TFO) can inhibit gene expression with high sequence-specificity by interacting with the DNA double-strand. In this study, we investigated if an anti-TNF-[alpha] TFO had a therapeutic activity on inflammatory processes in vitro and in vivo, as judged from effects on two rat arthritis models. This TFO interacted with the TNF-[alpha] gene promoter, and its inhibitory activity was verified and compared to that of siRNA in vitro. A local intra-articular preventive injection of TFO in both acute and chronic arthritis models significantly reduced the development of the disease. Furthermore, the TFO efficiently blocked synovitis and cartilage and bone destruction in the joints. The results presented here provide the first evidence that gene targeting by anti-TNF-[alpha] TFO modulates arthritis in vivo, thus providing proof of concept that it could be used as therapeutic tool for TNF-[alpha]-dependent chronic inflammatory disorders

Mutacijos, atsiradusios atitinkamuose žmogaus genuose, gali lemti pakitusių baltymų atsiradimą, kurie sukelia įvairias ligas (pvz.: vėžį), klaidingą embriono vystymąsi ar priešlaikinę mirtį. Tokios genetinės ligos gali būti gydomos genų terapijos būdu. Labiausiai vystoma genų terapijos strategija yra paremta homologine rekombinacija, kurios metu DNR seka, naudojama geno taisymui, yra patiekiama in trans. Natūraliai žinduolių ląstelėse homologinė rekombinacija (HR) vyksta žemu rekombinacijos dažniu (10-6). Tačiau yra žinoma, kad dvigrandininio trūkio įvedimas žymiai pagreitina HR (10-1). In vivo eksperimentų atveju dvigrandininio trūkio įvedimas turi būti ypač tikslus, todėl šis metodas reikalauja naujų molekulinių įrankių, kurie būtų itin specifiški ir griežtai kontroliuojami. Šiame darbe mes orientavomės į itin specifiškų ir griežtai kontroliuojamų meganukleazių kūrimą naudojant restrikcijos endonukleazių (REazių)-tripleksą formuojančių oligonukleotidų (TFO) konjugatus. REazių-TFO konjugatuose TFO suteikia specifiškumą prailgintam atpažinimo taikiniui per DNR triplekso susidarymą taip nukreipdamas restrikcijos fermentą prie konkretaus taikinio kur norima įvesti dvigrandininį trūkį. Šiuo tyrimu mes parodėme dvi alternatyvias restrikcijos endonukleazių-TFO konjugatų aktyvumo reguliavimo strategijas, kas leistų šias nukleazes panaudoti in vivo tyrimuose. Tuo tikslu buvo pasirinkti ortodoksiniai restrikcijos fermentai MunI ir Bse634I, kurie mūsų laboratorijoje yra gerai... [toliau žr. visą tekstą] / Simple mutations within the coding region of critical human genes can lead to the formation of abnormal proteins, resulting in various diseases (e.g. cancer), in failure of an embryo to develop, or premature death. Genetic diseases can only be truly cured via restoration of defective gene function and one of the most promising strategies is based on homologous recombination. Naturally homologous recombination occurs with a low frequency (1 in 106 transfected cells), however it is known that DNA double-strand breaks enhance the efficiency of homologous recombination by several orders of magnitude (up to 10,000-fold). Therefore, gene therapy via homologous recombination requires new molecular tools that should be highly specific and rigorously controllable. In this work we have focused on the development of restriction enzyme-triple helix forming oligonucleotide (TFO) conjugates, where TFO provides specificity for the extended recognition site through the triple helix formation and addresses restriction enzyme to a particular target site where it introduces a double stranded break. We provide proof-of-concept demonstrations of two alternative strategies to control the DNA cleavage activity of restriction endonuclease-TFO conjugates, that allows adopt them in in vivo experiments. To this end we used restriction endonucleases MunI and Bse634I, which were structurally and biochemically characterized before in our laboratory. We successfully combined the restriction endonuclease... [to full text]

Simple mutations within the coding region of critical human genes can lead to the formation of abnormal proteins, resulting in various diseases (e.g. cancer), in failure of an embryo to develop, or premature death. Genetic diseases can only be truly cured via restoration of defective gene function and one of the most promising strategies is based on homologous recombination. Naturally homologous recombination occurs with a low frequency (1 in 106 transfected cells), however it is known that DNA double-strand breaks enhance the efficiency of homologous recombination by several orders of magnitude (up to 10,000-fold). Therefore, gene therapy via homologous recombination requires new molecular tools that should be highly specific and rigorously controllable. In this work we have focused on the development of restriction enzyme-triple helix forming oligonucleotide (TFO) conjugates, where TFO provides specificity for the extended recognition site through the triple helix formation and addresses restriction enzyme to a particular target site where it introduces a double stranded break. We provide proof-of-concept demonstrations of two alternative strategies to control the DNA cleavage activity of restriction endonuclease-TFO conjugates, that allows adopt them in in vivo experiments. To this end we used restriction endonucleases MunI and Bse634I, which were structurally and biochemically characterized before in our laboratory. We successfully combined the restriction endonuclease... [to full text] / Mutacijos, atsiradusios atitinkamuose žmogaus genuose, gali lemti pakitusių baltymų atsiradimą, kurie sukelia įvairias ligas (pvz.: vėžį), klaidingą embriono vystymąsi ar priešlaikinę mirtį. Tokios genetinės ligos gali būti gydomos genų terapijos būdu. Labiausiai vystoma genų terapijos strategija yra paremta homologine rekombinacija, kurios metu DNR seka, naudojama geno taisymui, yra patiekiama in trans. Natūraliai žinduolių ląstelėse homologinė rekombinacija (HR) vyksta žemu rekombinacijos dažniu (10-6). Tačiau yra žinoma, kad dvigrandininio trūkio įvedimas žymiai pagreitina HR (10-1). In vivo eksperimentų atveju dvigrandininio trūkio įvedimas turi būti ypač tikslus, todėl šis metodas reikalauja naujų molekulinių įrankių, kurie būtų itin specifiški ir griežtai kontroliuojami. Šiame darbe mes orientavomės į itin specifiškų ir griežtai kontroliuojamų meganukleazių kūrimą naudojant restrikcijos endonukleazių (REazių)-tripleksą formuojančių oligonukleotidų (TFO) konjugatus. REazių-TFO konjugatuose TFO suteikia specifiškumą prailgintam atpažinimo taikiniui per DNR triplekso susidarymą taip nukreipdamas restrikcijos fermentą prie konkretaus taikinio kur norima įvesti dvigrandininį trūkį. Šiuo tyrimu mes parodėme dvi alternatyvias restrikcijos endonukleazių-TFO konjugatų aktyvumo reguliavimo strategijas, kas leistų šias nukleazes panaudoti in vivo tyrimuose. Tuo tikslu buvo pasirinkti ortodoksiniai restrikcijos fermentai MunI ir Bse634I, kurie mūsų laboratorijoje yra gerai... [toliau žr. visą tekstą]