L'ADN tumoral circulant (ADNtumc) est apparu depuis plusieurs années comme un biomarqueur prometteur susceptible d'apporter des informations permettant l'optimisation de la prise en charge du patient en oncologie. L'objectif de cette thèse était double et s'articule autour de deux axes : i) évaluer différentes conditions préanalytiques et analytiques (digitale PCR (dPCR) principalement) pour la détection de ce biomarqueur ii) évaluer l'intérêt clinique potentiel de ce biomarqueur en oncologie digestive. La première partie rapporte 3 travaux (3 articles originaux dont une collaboration nationale (équipe parisienne dirigée par J. Tost)). Dans le travail n°1, nous avons montré la faisabilité de détecter l'ADNtumc par dPCR directement à partir du plasma de 43 prélèvements de patients avec cancer colorectal métastatique (CCRm). Il n'y avait pas de différence significative pour le taux de détection des mutations KRAS circulantes entre les groupes avec et sans extraction d'ADN (93 % (40/43) versus 88 °A) (38/43), respectivement). Dans le travail n°2, nous avons mis au point une méthode basée sur l'apport d'héparinase pour la détection d'ADNtumc à partir de 194 prélèvements héparinés de patients suivis en oncologie. Ce traitement des échantillons par l'héparinase permettait l'analyse de l'ADNtumc pour 117/194 (60 %) patients avec inhibition Préalable de la dPCR par l'héparine. Enfin, dans le travail n°3, nous avons comparé plusieurs plate-formes de détection d'ADNtumc et montré que la dPCR affichait des résultats de détection comparables sur le plan qualitatif et quantitatif avec une plateforme ultrasensible d'Enhanced-ice-COLD-PCR (E-ice-COLD-PCR) pour les échantillons avec une fréquence allélique d'ADNtumc >0,4 °A La deuxième partie rapporte 3 travaux (3 articles originaux) sur l'intérêt clinique de la détection d'ADNtumc par dPCR en oncologie digestive. Nous avons ainsi montré que ce biomarqueur conférait un intérêt diagnostique (travail n°4), Pronostique (travail n 4 à 6) et prédictif de la réponse aux traitements (travail n°6) chez les Patients avec adénocarcinome pancréatique (AP) (travail n°4) et CCRm (travail n°5 à 6). / For several years, circulating tumor DNA (ctDNA) has emerged as a promising biomarker providing relevant information to optimize patient care in oncology. The aim of this thesis was both: (i) to evaluate different preanalytical and analytical conditions (digital PCR (dPCR) mainly) for the detection of this biomarker; (ii) to evaluate the potential clinical interest of this biomarker in digestive oncology. The first part reports 3 works (3 original articles including a national collaboration (Parisian team led by J. lost)). In work no. 1, we have shown the feasibility of ctDNA detection by dPCR directly from the plasma of 43 samples from patients with metastatic colorectal cancer (mCRC). There was no significant difference in the detection rate of circulating KRAS mutations between groups with and without DNA extraction (93% (40/43) versus 88% (38/43), respectively). In work no. 2, we developed a method based on the heparinase addition for the ctDNA detection from 194 heparinized samples of patients followed in oncology. This treatment of samples by heparinase allowed the ctDNA analysis of 117/194 (60%) patients with prior inhibition of dPCR by heparin. Finally, in work no. 3, we compared several ctDNA detection platforms and snowed that dPCR displayed qualitatively and quantitatively comparable detection results with an ultrasensitive platform of E-ice-COLD-PCR for the samples with ctDNA allelic fraction ?.0 4%. The second part reports 3 works (3 original articles) on the clinical interest of the ctDNA detection by dPCR in digestive oncology. We have thus shown that this biomarker had a diagnostic (work no. 4). prognostic (works no. 4 to 6) and predictive response to treatments (work no. 6) interest in patients with pancreatic adenocarcinoma (work no. 4) and mCRC (works no. 5 to 6).

Somatische Mutationen sind eine Hauptursache für die Entstehung von Krebs. Allerdings tragen nicht alle Mutationen gleichermaßen zur Tumorentstehung bei. Ein wichtiges Ziel der personalisierten Medizin ist es daher, die für das Wachstum und Überleben des Tumors wesentlichen (sogenannte „Treiber“-Mutationen) von den zahlreichen biologisch neutralen Mutationen (sogenannte „Passagier“-Mutationen) zu unterscheiden. In der vorliegenden Studie etablierte ich einen CRISPR-basierten, genetischen Screen mit dessen Hilfe die funktionelle Rolle von Mutationen bei Krebs untersucht werden kann. Ich konnte nachweißen, dass diese mutationsselektive Strategie geeignet ist, um neue Krebstreibermutationen in der Kolorektalkarzinom- Zelllinie RKO zu identifizieren. Dazu verwendete ich 100 unterschiedliche sgRNAs, welche jeweils eine Krebsmutationssequenz spezifisch schneiden während die Wildtyp-Sequenz nicht verändert wird. Als Kontrolle nutzte ich die Kolorektalkarzinom- Zelllinie HCT116, welche die Zielmutationen nicht trägt. Interessanterweise ergab die Datenanalyse, dass zwei sgRNAs, welche die gleiche Mutation (UTP14A: S99del) schneiden, besonders rasch und ausschließlich in RKO-Zellen verloren gingen. Im Einklang mit den Screening-Ergebnissen führte die individuelle Infektion der Zellen mit diesen sgRNAs zu einem selektiven Verlust in RKO-, nicht aber HCT-Zellen, wodurch UTP14A: S99del als mutmaßliche Treiber-Mutation in RKO-Zellen identifiziert werden konnte. Die weitere Validierung und Charakterisierung dieser mutmaßlichen Treiber-Mutation wird diskutiert. Insgesamt zeigt dieser Ansatz, dass ein solches CRISPR-basiertes System ein leistungsfähiges Werkzeug auch für umfangreichere Untersuchungen von Krebsmutationen darstellt. Parallel dazu setzte ich die CRISPR-Cas-Technologie ein, um bekannte und bisher nicht therapierbare Treiber-Mutationen, wie z.B. innerhalb der Ras-Onkogen-Familie, zu untersuchen. Bemerkenswert ist in diesem Zusammenhang, dass jeder dritte Krebspatient ein durch Mutationen aktiviertes KRAS exprimiert, welches damit das am häufigsten mutierte Onkogen in menschlichen Tumorzellen ist. Im Gegensatz zu anderen Molekülen des MAPK-Signalweges konnte KRAS bisher nicht mittels kleiner, inhibitorischer Moleküle inaktiviert werden. Unter diesen Voraussetzungen birgt ein genomischer, CRISPR-basierter Ansatz das Potenzial, eine dringend benötigte therapeutische Alternative zur KRAS-Inaktivierung zu liefern. Ich entwarf daher drei mutationsselektive sgRNAs abzielend auf die häufigsten KRAS-Mutationen. Obwohl diese Strategie geeignet war, um KRAS-mutierte Tumorzellen in 3 unterschiedlichen Krebszelllinien effizient und spezifisch zu entfernen, führte die langfristige Cas9-Expression zur Bildung von onkogenen, resistenten Klonen. Dieses Phänomen wird durch DNA-Doppelstrangbrüche und die nachfolgend einsetzende, endogene DNA-Reparaturmaschinerie begünstigt. Ich konnte zeigen, dass der Adenin-Basen-Editor im Gegensatz dazu nicht nur in der Lage ist, die KRAS-Mutation ohne Doppelstrangbruch zu inaktivieren, sondern diese auch zur Wildtyp-Sequenz reparieren kann. Mit Hilfe dieses Ansatzes erreichte ich insbesondere bei Vorliegen der G12D-Mutation, einen fast vollständigen Abbau der KRAS-korrigierten Zellen. Die Validierung in patienten-abgeleiteten KRAS-G12D-Organoiden bestätigte die effiziente Korrektur sowie die daraus resultierende erhöhte Sensitivität, wenn auch in einem geringeren Maße als in Zelllinien. Somit konnte in dieser Studie erstmals gezeigt werden, dass Basen-Editierung sowohl in Zelllinien als auch in Organoiden, welche aus Tumorzellen der Patienten stammen, erfolgreich eingesetzt werden kann. Darüber hinaus ist dieses System gut verträglich und induziert weder in Zelllinien noch in Organoiden bei Vorliegen des KRAS Wildtyps unerwünschte Nebeneffekte (sogenannte „Off-target-Effekte“). Langfristig kann die Anwendung von CRISPR-basierten- und Basen-Editierungs-technologien zum Ausschalten von KRAS-Mutationen nicht nur zu einem besseren Verständnis der RAS-Biologie führen, sondern zusammen mit neuen Verabreichungsformen und Technologien die Grundlage für eine dringend benötigte KRAS-Therapie bilden.