La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie neuromusculaire affectant un garçon sur 3200. Cette maladie se caractérise par l'absence d'une simple protéine, la dystrophine, qui assure normalelnent l'intégrité des fibres musculaires. Sans cette protéine, les fibres musculaires sont plus facilement endommagées, provoquant une dégénérescence musculaire. Rapidement, les facultés locomotrices diminuent, confinant habituellement le patient à un fauteuil roulant vers l'âge de 10 ans. L'utilisation d' une assi stance respiratoire s'avère généralement nécessaire au début de la vingtaine et le décès peut survenir dès l'âge de 17 ans. Les patients atteignent rarement la trentaine. La thérapie cellulaire se situe parmi les traitements curatifs potentiels et consiste à implanter au patient dystrophique des myoblastes contenant le gène normal de la dystrophine. Évidemment, cette thérapie présente quelques inconvénients, dont une réaction immune du patient contre les myoblastes transplantés. C'est ici qu'interviennent les travaux présentés dans ce mémoire avec comme objectif principal d'utiliser les Iymphocytes T régulateurs (Tregs) afin de créer un protocole de tolérance non-toxique pour les patients dystrophiques. Jusqu 'à maintenant, nous avons réussi à isoler efficacement et de manière reproductible ces Tregs en utilisant une armada d'anticorps spécifiques. Plus précisément, nous avons actuellement une pureté moyenne se situant entre 90% et 95%. Par après, en démontrant l'expression du FoxP3 au sein de ces cellules, ces travaux prouvent hors de tout doute que les cellules purifiées sont des Tregs au sens propre du tenne. Finalement, par des essais in vitro, nous avons efficacement démontré que les Tregs isolés conservaient leur capacité immunorégulatrice. En effet, suite à une stimulation artificielle, les lymphocytes T CD4⁺ mis en co-culture avec un ratio de Tregs de 1:4 se divisent deux fois moins que ceux sans Tregs. Afin de conclure ces travaux, il reste deux étapes majeures avant de crier victoire. Premièrement, il faut réussir à multiplier des Tregs spécifiques afin d'en avoir un nombre suffisant et d'avoir une plus grande spécificité. Deuxièmement, il faudra les réintroduire chez un modèle animal afin de tester s' ils empêchent le rejet d' une greffe allogénique.

La transplantation de myoblastes (cellules précurseurs du muscle) est une thérapie potentielle prometteuse pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne. À ce jour, aucun traitement efficace n'existe pour cette maladie. Cette thérapie consiste en l'injection des cellules directement dans le muscle malade. Comme tous les autres types de transplantation allogénique, les myoblastes sont rapidement rejetés par le système immunitaire, mais le rejet peut être contrôlé par l'emploi soutenu d'immunosuppresseurs. L'utilisation de ces immunosuppresseurs serait idéale si ce n'était de leurs effets indésirables importants. Pour contourner ce problème, il est possible d'induire une tolérance immunologique envers les myoblastes transplantés. Cet état de tolérance peut-être induit par deux voies principales : la tolérance périphérique et la tolérance centrale. Plusieurs protocoles d'induction de tolérance périphérique et centrale ont été démontrés efficaces dans la littérature chez des modèles animaux et, dans certains cas, chez l'humain. Nous avons donc appliqué certains de ces protocoles d'induction de tolérance à la transplantation de myoblastes. Lors de cette étude, il est démontré que l'induction de tolérance périphérique, avec les protocoles utilisés, n'ont permis que la prolongation de la survie des myoblastes et qu'une modulation centrale du système immunitaire pourrait améliorer les résultats de survie. C'est pourquoi nous nous sommes tournés vers l'utilisation de protocoles non-myéloablatifs de greffe de moelle osseuse utilisant des anticorps monoclonaux bloquant les signaux d'activation des lymphocytes. Par le développement de chimérisme, nous avons démontré, pour la première fois, l'induction d'une tolérance robuste et spécifique à la transplantation de myoblastes, sans aucune immunosuppression soutenue. Cette démonstration montre que l'induction de tolérance par modulation centrale pourrait un jour être appliquée à un traitement de transplantation de myoblastes pour la dystrophie musculaire de Duchenne, améliorant ainsi l'espoir d'une qualité de vie meilleure pour ces jeunes malades.

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une myopathie héréditaire due à l'absence de dystrophine. Parmi les thérapies possibles, la greffe autologue de myoblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (hiPSCs) provenant du patient dystrophique, préalablement corrigés génétiquement, est envisageable. Lors de la première partie de ma recherche, j'ai transplanté des hiPSCs de patient DMD différenciés en myoblastes chez la souris Rag/mdx. Ces cellules avaient été corrigées génétiquement à l'aide d'un vecteur lentiviral codant pour la micro-dystrophine, une dystrophine tronquée, mais toujours fonctionnelle. Mes résultats ont démontré l'expression de cette micro-dystrophine dans certaines fibres hybrides. Cependant, le protocole de différenciation des hiPSCs en myoblastes doit être amélioré. La deuxième partie de mon projet consistait donc à induire la myogenèse à l’aide de protéines recombinantes. Pour cela, des facteurs de transcription régulateurs de la myogenèse, fusionnés à un peptide de pénétration cellulaire, ont été produits et purifiés d’un système bactérien. Leur pénétration dans des cellules mésenchymateuses a été observée in vitro et leurs effets sur les cellules sont en cours d’étude. Lorsque ces approches thérapeutiques seront mises au point, elles pourraient être appliquées cliniquement pour traiter des patients dystrophiques. / Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a hereditary myopathy due to the absence of dystrophin. Among the possible therapies, there is the autologous transplantation of genetically corrected myoblasts derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) of a dystrophic patient. In the first part of my research project, I have transplanted myoblasts differentiated from iPSCs of a DMD patient in the Rag/mdx mouse. These cells had been previously genetically corrected with a lentiviral vector coding for micro-dystrophin, a functional truncated version of dystrophin. The results demonstrated the expression of this micro-dystrophin in some of the hybrid fibers. However, in order to increase the graft success, the protocol of differentiation of hiPSCs in myoblasts must be improved. The second part of my project was the induction of myogenesis from hiPSCs using recombinant proteins. To accomplish this, myogenic transcription factors fused with a cell penetrating peptide were produced and purified from the bacterial system. Their capacity to enter into mesenchymal-like cells in vitro was observed and their effects on the cells are currently under study. Once optimized, these therapeutic approaches could be clinically applied to treat dystrophic patients.

La dystrophie musculaire de Ouchenne (OMO) est une maladie héréditaire récessive caractérisée par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques. Aucun traitement curatif n'est actuellement disponible. La thérapie cellulaire pourrait être une solution potentielle pour les patients OMO. Elle est basée sur la transplantation de cellules myogéniques normales afin de restaurer l'expression de la dystrophine, protéine absente dans cette maladie. Une période de régénération limitée suivant un dommage fait au muscle dystrophique réduirait le nombre de fibres hybrides formées diminuant ainsi le succès de la greffe. Notre hypothèse est d'augmenter le temps de régénération musculaire en inhibant l'action de la myostatine à l'aide d'un récepteur tronqué. Les travaux de ce mémoire démontrent l'incorporation d'un récepteur tronqué de l'activine de type IIA, IIB ou les deux dans des cellules myogéniques humaines. La transplantation de ces cellules semble améliorer le succès de la greffe de myoblastes donc plus de fibres exprimant la dystrophine humaine.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une maladie héréditaire causée par la mutation du gène DYS qui code pour la dystrophine, une protéine exprimée au niveau des fibres musculaires et qui y joue un rôle important dans le maintient de la stabilité et de l'intégrité des membranes. Elle est caractérisée par la dégénérescence progressive des fibres musculaires ce qui aboutit à l'atrophie de la plupart des muscles. Il n'existe pas pour le moment un remède pour la maladie, mais plusieurs types de thérapies sont étudiés pour mettre au point un traitement. Dans notre laboratoire, on s'intéresse à développer une thérapie cellulaire basée sur la transplantation de myoblastes normaux dans le muscle dytrophique, afin de permettre la restauration de l'expression de la dystrophine au niveau des fibres réparées par la fusion des myoblastes transplantés. Cependant, le succès de cette approche évalué par le nombre de fibres formées après la transplantation qui expriment la dystrophine, est limité. Ce succès limité est dû entre autre à la durée limitée de la période de régénération qui suit le dommage fait au muscle dystrophique. Afin de remédier à ce problème, notre hypothèse de travail est d'augmenter la régénération après le dommage induit par la transplantation de myoblastes, en augmentant la capacité proliférative et la capacité de fusion de ces derniers. Pour cela, l'inhibition du signal induit par une protéine présente normalement dans le muscle, la myostatine, pourrait être bénéfique. Ainsi, les travaux dont fait l'objet la présente thèse démontrent que le blocage du signal de la myostatine dans le muscle de la souris dystrophique, en utilisant des approches différentes, permet en effet d'améliorer le succès de la greffe de myoblastes normaux, mais aussi d'entraîner une hypertrophie musculaire et une augmentation de la force musculaire. / Duchenne muscular dystrophy is a hereditary disease caused by the mutation of DYS gene, which codes for dystrophin, a protein expressed in the myofibers where it plays an important role in the stability and the integrity of membranes. The disease is characterized by the progressive degeneration of the muscle fibers, which induces the atrophy of most of the muscles. To date, there is no cure for this pathology, but several types of therapies are studied to develop a treatment. In our laboratory, we are interested to develop a cell therapy based on the transplantation of normal myoblasts in the dystrophic muscle, to allow the restoration of the expression of dystrophin in fibers repaired by the fusion of the transplanted myoblasts. However, the success of this approach evaluated by the number of fibers formed after the transplantation, which express dystrophin, is limited due in part to the short period of regeneration following the muscle damage. To bypass this problem, our research work presented in the present thesis aimed to increase the regeneration after the damage caused by the myoblast transplantation procedure, by improving the proliferative and fusion capacities of the transplanted myoblasts. This was achieved by inhibiting a protein normally present in the muscle, i.e., myostatin. Thus, the results of this thesis show that the blockade of the myostatin signal in dystrophic mice, using different approaches, not only improved the success of normal myoblast graft, but also induced fiber hypertrophy and increased muscle strength.

La transplantation de myoblastes (TM) est une des thérapies potentielles des plus prometteuses pour la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Une des limites de cette approche est le rejet des myoblastes du donneur par le système immunitaire de l’hôte. L’induction d’une tolérance immunologique envers les myoblastes greffés permettrait de contourner les effets secondaires conséquents à une immunosuppression soutenue, aujourd’hui indispensable à la survie de la greffe. Notre objectif est donc d'induire une tolérance immunologique via l’établissement d’un chimérisme mixte par un protocole non-myéloablatif, chez des souris dystrophiques. Le protocole testé a permis d'induire une tolérance périphérique transitoire au donneur ainsi que l'établissement de taux variables de chimérisme mixte. Cependant, il n’a pas permis d’induire une tolérance à la TM. Bien que nous n’avons pas obtenu les résultats escomptés quant à la TM, des améliorations, telle qu’une association à court terme à la rapamycine, pourraient être envisagées en vue d'une application en clinique. / Myoblast transplantation (MT) is one of the most promising potential therapies for Duchenne muscular dystrophy (DMD). One limitation of this approach is the rejection of the donor myoblast by the host immune system. Induction of donor-specific immune tolerance would avoid the toxicities of chronic immunosuppressive therapy that is currently required to prevent graft rejection. Our objective is to induce immunological tolerance through the establishment of mixed-chimerism using a non-myeloablative protocol, into DMD mice. Our results show that the tested protocol permits the induction of transient peripheral tolerance status to the donor. It also allows the establishment of variable rate of mixed-chimerism. However, this protocol failed to induce tolerance to MT. Although we did not obtain the expected results on the MT, improvements, such as association with a short-term rapamycin treatment, may be considered to enhance the outcome of the proposed protocol in perspective of clinical application for DMD patients.

À cause de l’absence de dystrophine, les fibres musculaires d’un enfant atteint de la Dystrophie Musculaire de Duchenne (DMD) sont fragiles et leurs ruptures fréquentes entraînent une dégénérescence progressive du tissu musculaire. Basée sur les mécanismes de la régénérescence musculaire, la transplantation de myoblastes consiste à fournir des précurseurs myogéniques sains afin que ces derniers participent à la réparation du tissu musculaire dystrophique. Bien que cette approche ait permis de restaurer l’expression de dystrophine lors d’études cliniques menées auprès de patients DMD, la faible dispersion des fibres exprimant la dystrophine s’est révélée un problème majeur requérant que des injections de myoblastes soient effectuées à tous les millimètres afin d’obtenir un succès de greffe optimal. Une faible migration des cellules greffées à l’extérieur des sites d’injection étant suspectée comme principale cause de la restriction des fibres hybrides au niveau des sites d’injections, l’objectif de nos travaux fut d’établir que l’IGF-1, le bFGF et l’interleukine-4 présentent des propriétés chémokinésiques et que leur co-injection avec les cellules greffées est une approche physiologique et efficace pour favoriser la migration intramusculaire des myoblastes squelettiques humains ou de singe. Bien que la co-injection de facteurs de croissance fût envisagée dans l’espoir que les cellules ayant migré puissent fusionner avec les fibres retrouvées à l’extérieur de la trajectoire d’injection, les résultats de transplantation obtenus chez le primate suggèrent que l’augmentation du potentiel migratoire n’est pas, à elle seule, une approche suffisante pour accroître la quantité et la dispersion des fibres hybrides. Globalement, nos travaux ont permis de mieux comprendre et de redéfinir les facteurs limitant le succès de la transplantation de myoblastes. Bien que les cellules myogéniques aient effectivement un potentiel migratoire limité, l’absence de fusion entre les cellules greffées et les fibres non endommagées est sans doute la cause réelle de la restriction des fibres hybrides. Tant que ce problème subsistera, toutes les approches permettant d’améliorer la migration des cellules greffées ne pourront se révéler efficaces pour améliorer la dispersion des fibres et pour réduire la quantité d’injections requises pour le traitement d’un patient dystrophique. / Due to the absence of dystrophin, muscle fibers of Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) patients are fragile and their constant ruptures induce a progressive lost of muscular tissues. Myoblast transplantation (MT) is an experimental treatment for DMD. Following their intramuscular injection, healthy myogenic precursor cells are able to fuse with host fibers and restore dystrophin expression. Although MT had efficiently restore dystrophin expression in DMD patients; transplantation success following a single injection is limited. The low dispersion of dystrophin expressing fibers is a major problem that requires myoblast injections every millimetre to obtain an optimal graft success. Since poor transplanted cell migration outside the injection sites has been proposed to explain the restriction of hybrid myofibers, motogenic factors were tested to verify whether their co-injection with transplanted myoblasts is a physiological and effective approach to stimulate proteolytic activity as well as myoblast intramuscular migration. Results demonstrated that insulin growth factor-1, basic fibroblast growth factor and interleukin-4 show strong chemokinetic potential for human skeletal myoblasts and increase the migration distances reached by transplanted cells. By improving cell migration through muscular tissue, we hoped that growth factors co-injection would help transplanted cells to fuse with myofibers located outside the injection sites. However, experiments conducted in monkeys suggest that improvement of transplanted cell migration is not, per se, a sufficient approach to increase the quantity and dispersion of hybrid fibers. Generally, our work helped to clarify and redefine a major problem, which limits graft success. Even if short-term observations suggest that transplanted cells are not always trapped inside the injection sites, myofibers including grafted cell nuclei remain restricted to the injection trajectories one month post transplantation. Lack of fusion with undamaged myofibers located outside the injection sites will probably have to be resolved to improve dispersion of hybrid myofibers and thus reduce the number of injections required for the treatment of DMD patients. As long as this fusion problem remains, all approaches, which increase transplanted cell migration, will not be sufficient to increase MT success.

Les thérapies génique et cellulaire sont à l'avant-garde de la recherche sur le traitement des dystrophies musculaires. La thérapie par transfert de myoblastes a été proposée comme traitement potentiel de ces dystrophies et les transplantations de myoblastes ont donné des résultats significatifs. Dans cette optique, une thérapie cellulaire autologue est à favoriser et cette approche implique une modification génétique ex vivo. Cette méthode nécessite une efficacité exemplaire du transfert, de l'implantation et de l'expression de l'ADN recombinant. Les myoblastes du muscle squelettique humain sont cependant plus ou moins réfractaires à certains vecteurs viraux. Nous avons donc procédé à l'étude de l'efficacité de vecteurs dérivés d'un rétrovirus, d'un lentivirus, d'un adénovirus et de virus adéno-associés, dans la transduction d'un transgène dans les myoblastes humains. Nous établissons que les vecteurs rétroviraux et lentiviraux démontrent un potentiel remarquable dans une perspective de thérapie génique ex vivo, dédiée à la musculature squelettique humaine. / Gene and cell therapies are at the forefront of research for the treatment of muscular dystrophies. Myoblast transfer therapy was proposed as a potential treatment for these diseases and myoblast transplantation experiments yielded significant results. In this approach, an autologous cell therapy would be preferable and this implies ex vivo gene therapy. However, gene delivery and expression must be optimal in this context and human myoblast is refractory to some viral vectors. For that reason, we have studied the transduction capacities, on such cells, of viral vectors derived from retrovirus, lentivirus, adenovirus and adeno-associated virus. We concluded that the retroviral and lentiviral vectors are the best suited for ex vivo gene therapy of human skeletal muscle cells dedicated to cell therapy.

La dystrophie myotonique est une maladie génétique multisystémique touchant entre autre les muscles. Elle est causée par la présence d'un triplet CTG répété en 3'UTR du gène de la DMPK. Cette mutation cause notamment la rétention de l'ARNm mutant dans le noyau des myoblastes, ce qui conduit à la formation de foci contenant des agglomérats d'ARN et de protéines. Notre équipe a développé plusieurs thérapies visant à détruire l'ARNm muté : deux ARN interférents, un ribozyme et un ARN antisens. Ces thérapies fonctionnent en cultures cellulaires mais leur effet n'avait pas été testé in vivo. Mon projet consistait donc en la transplantation de myoblastes "corrigés" dans des muscles de souris afin d'observer l'effet des thérapies in vivo. Des vecteurs lentiviraux contenant chacun une thérapie ont été générés, puis les lentivirus correspondants ont été produits. Les myoblastes ont été infectés, sélectionnés, puis greffés dans les tibialis antérieurs de souris SCID (immunodéficientes) préalablement irradiés. Un mois après la greffe, les souris ont été sacrifiées et leurs tibialis ont été analysés. Une immunohistochimie a été réalisée sur ces coupes avec l'anticorps antidystrophine humaine, afin de différencier les fibres musculaires d'origine humaine des fibres murines. La taille des fibres corrigées a été comparée à la taille des fibres témoins. Les transplantations effectuées n'ont malheureusement pas fonctionné sans doute à cause d'une mauvaise injection des myoblastes.

La dystrophie musculaire de Duchenne est une myopathie récessive liée au chromosome X. Cette pathologie est due à une mutation dans le gène codant pour la dystrophine. Cette protéine est responsable du maintien de l'intégrité de la fibre musculaire. La thérapie cellulaire basée sur la transplantation de cellules souches myogéniques ou myoblastes constitue une approche potentielle pour véhiculer le gène sain de la dystrophine afin de corriger l'absence de la protéine. Cette approche est limitée par la faible migration des myoblastes greffés, le rejet immunitaire des cellules injectées et la mort précoce et massive des myoblastes transplantés durant les 3 premiers jours après la greffe. Nous nous sommes intéressés dans la présente thèse à identifier les différents facteurs qui peuvent être responsables de cette mort importante. Ces facteurs incluent : . la réaction inflammatoire, (2) l'anoikis, (3) le stress physique et (4) l'ischémie/hypoxie. Parmi ces éléments, nous avons évalué le rôle de l'anoikis et de l'hypoxie et nous avons ainsi démontré que ces deux facteurs étaient en partie responsables de la mort des cellules. Dans un second temps, nous avons proposé deux alternatives possibles pour améliorer la survie et le succès des greffes de myoblastes. Une des approches consiste à traiter les myoblastes à un choc thermique avant de les transplanter. Ce traitement a permis d'améliorer le succès des greffes de myoblastes de 4 fois environ. L'exercice physique constitue également une approche qui, associé à une transplantation de cellules myogéniques, potentialise le succès de la transplantation. Par ailleurs, dans le but de faire le suivi des greffes de myoblastes, nous avons développé une technique qui consiste à modifier génétiquement les myoblastes pour qu'ils expriment le transporteur humain du sodium et de l'iode (hNIS). La survie et la prolifération des cellules transplantées sont évaluées en procédant à des injections intrapéritonéale de technétium. On procède ensuite à une radiographie de la région greffée à l'aide d'une camera-y. Nos résultats montrent que la réduction du nombre de myoblastes qui meurent suivant leur transplantation constitue une approche potentielle pour améliorer le succès de greffe.