Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel. / Maternal diabetes is a major risk factor for congenital malformations. When the fetus is exposed to high, sustained, ambient glucose levels, widespread fetal damage may affect multiple organs, including the kidneys, evoking diabetic embryopathy syndrome. Renal malformations account for up to 40% of childhood renal failure cases. Hyperglycemia constitutes an adverse in utero environment that dynamically impairs nephrogenesis, resulting in renal agenesis, dysplasia, aplasia or hypoplasia. However, the molecular mechanisms by which high, ambient glucose levels lead to renal dysmorphogenesis and birth defects have not yet been delineated. Maternal diabetes also programs the offspring to develop other problems later in life, such as hypertension, obesity and type 2 diabetes. This phenomenon, called ‘perinatal programming’, has attracted worldwide attention in recent decades, yet the mechanisms by which it occurs are incompletely understood. My PhD studies are designed to elucidate the underlying molecular pathways by which maternal diabetes or hyperglycemic environments in utero impair nephrogenesis and subsequently make the offspring develop perinatal programming of hypertension in vitro, ex vivo and in vivo. We employed mouse embryonic metanephric mesenchyme cells, namely MK4 cells, for our in vitro experiments, and 2 transgenic (Tg) mouse lines, Hoxb7-GFP-Tg and Nephrin-CFP-Tg mice, for ex vivo and in vivo investigations. Hoxb7-GFP-Tg mice specifically express green fluorescent protein (GFP) in ureteric buds (UB), driven by the Hoxb7 promoter. Nephrin-CFP-Tg mice express cyan fluorescent protein (CFP) in glomeruli, driven by the podocyte-specific nephrin promoter. In our in vitro studies, we examined whether high glucose alters Pax2 gene expresson in MK4 cells. The cells were treated with either 5 mM D-glucose plus 20 mM D-mannitol or 25 mM D-glucose media with or without reactive oxygen species (ROS) blockers (DPI, rotenone), and inhibitors of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) (SB203580), p44/22 MAPK (PD98059), protein kinase C (PKC) (GF109203X), or nuclear factor kappa B (NK-kB) (PDTC) for 24-hr incubation. Our data showed that high D-glucose (25 mM) increased ROS generation and specifically induced Pax2 gene expression, but not other glucose analogs such as D-mannitol, L-glucose or 2-deoxy-D-glucose in MK4 cells. The stimulatory effect of high D-glucose on Pax2 gene expression could be blocked by ROS and NF-kB inhibitors in MK4 cells but not by inhibitors of p38 MAPK (SB203580), p44/22 MAPK (PD98059), and PKC (GFX) in MK4 cells. These data indicated that the stimulatory effect of high glucose on Pax2 gene expression is mediated, at least in part, via ROS generation and activation of NF-κB, but not via the PKC, p38 MAPK and p44/42 MAPK signalling pathways. In our ex vivo studies, we investigated the influence of a high-glucose milieu on UB branching morphogenesis. Kidney explants (E12 to E18) were microdissected from timed-pregnant Hoxb7-GFP mice and cultured with either 5 mM D-glucose plus 20 mM D-mannitol or 25 mM D-glucose media with or without ROS blockers (DPI, rotenone), catalase and phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/AKT inhibitor at different time points, depending on the experiment. We found that high D-glucose specifically stimulated UB branching in a time-dependent manner. High D-glucose stimulation of UB branching morphogenesis was mediated via Pax2 gene expression. High D-glucose-induced UB branching and Pax2 gene expression could be blocked by ROS and PI3K/AKT inhibitors. These studies demonstrated that high glucose alters UB branching morphogenesis via Pax2 gene and protein expression. The stimulatory effect of high glucose seems to be mediated via ROS generation and activation of the AKT signalling pathway. In our in vivo studies, we explored the fundamental role of maternal diabetes on renal morphogenesis impairment in offspring. In our experimental model, maternal diabetes was induced by streptozotocin in pregnant Hoxb7-GFP mice at embryonic day 13. The offspring were examined at several time points after birth (neonatal, 1 week, 2 weeks, and 3 weeks) with follow-up of kidney morphology, nephron number, gene expression, and apoptotic events in this short-term postnatal experiment. We observed that the offspring of diabetic mice had lower body weight, body size, kidney weight, small volume of glomeruli and a reduced number of nephrons in comparison to non-diabetic control offspring. Renal dysmorphogenesis may have been the result of increased cell apoptosis in glomeruli. Our findings showed that the offspring of diabetic mice displayed significantly more apoptotic podocytes as well as augmented active caspase-3 immunostaining in renal tubules compared to control mice offspring. Diabetic mice offspring presented heightened expression of intrarenal renin-angiotensin system (RAS) components, such as angiotensinogen and renin, with upregulation of p50 and p65 NF-kB isoforms. These data indicated that maternal diabetes activates the intrarenal RAS and induces glomerular apoptosis, resulting in impairment of renal morphogenesis in diabetic offspring. In conclusion, our findings indicated that a high-glucose milieu in utero or maternal diabetic alters UB morphogenesis, culminating in retardation of nephrogenesis with smaller kidney size. The underlying mechanism(s) is mediated, at least in part, via ROS generation and activation of the intrarenal RAS and NF-kB pathways. In the future, we aim to investigate the underlying mechanism(s) of how maternal diabetes induces perinatal programming of adult hypertension in offspring in vivo. This long-term postnatal study will be undertaken in 3 groups: adult offspring (20 weeks) of control mice, adult offspring of diabetic pregnant mice, and adult offspring of insulin-treated, diabetic, pregnant mice. We will follow-up by tracking hypertension, kidney morphology, and gene expression. Furthermore, we also plan to determine whether an antioxidant system (catalase) can protect against an hyperglycemic environment in utero that affects embryonic organogenesis via an increase in ROS generation. Catalase-Tg mice that specifically overexpress catalase in proximal tubules will be tested. Such Tg mice with catalase overexpression represent a model for exploring our hypothesis on the role of ROS in gestational diabetes.

Le diabète maternel est un facteur de risque majeur pour le développement de malformations congénitales. Dans le syndrome de l’embryopathie diabétique, l’exposition prolongée du fœtus à de hautes concentrations ambientes de glucose induit des dommages qui peuvent affecter plusieurs organes, dont les reins. Les malformations rénales sont la cause de près de 40 pourcent des cas d’insuffisance rénale infantile. L’hyperglycémie constitue un environnement utérin adverse qui nuit à la néphrogenèse et peut causer l’agenèse, la dysplasie (aplasie) ou l’hypoplasie rénale. Les mécanismes moléculaires par lesquels les hautes concentrations ambientes de glucose mènent à la dysmorphogenèse et aux malformations demeurent toutefois mal définis. Le diabète maternel prédispose aussi la progéniture au développement d’autres problèmes à l’âge adulte, tels l’hypertension, l’obésité et le diabète de type 2. Ce phénomène appelé ‘programmation périnatale’ a suscité l’intérêt au cours des dernières décennies, mais les mécanismes responsables demeurent mal compris. Mes études doctorales visaient à élucider les mécanismes moléculaires par lesquels le diabète maternel ou un environnement in utero hyperglycémique affecte la néphrogenèse et programme par la suite la progéniture a développer de l’hypertension par des observations in vitro, ex vivo et in vivo. Nous avons utilisé les cellules MK4, des cellules embryonnaires du mésenchyme métanéphrique de souris, pour nos études in vitro et deux lignées de souris transgéniques (Tg) pour nos études ex vivo et in vivo, soient les souris HoxB7-GFP-Tg et Nephrin-CFP-Tg. Les souris HoxB7-GFP-Tg expriment la protéine fluorescente verte (GFP) dans le bourgeon urétérique (UB), sous le contrôle du promoteur HoxB7. Les souris Nephrin-CFP expriment la protéine fluorescente cyan (CFP) dans les glomérules, sous le contrôle du promoteur nephrin spécifique aux podocytes. Nos études in vitro visaient à déterminer si les hautes concentrations de glucose modulent l’expression du gène Pax2 dans les cellules MK4. Les cellules MK4 ont été traitées pendant 24h avec du milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants ou inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK, PKC et NF-kB. Nos résultats ont démontré que le D-glucose élevé (25mM) augmente la génération des espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les cellules MK4 et induit spécifiquement l’expression du gène Pax2. Des analogues du glucose tels le D-mannitol, L-glucose ou le 2-Deoxy-D-glucose n’induisent pas cette augmentation dans les cellules MK4. La stimulation de l’expression du gène Pax2 par le D-glucose dans les cellules MK4 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de NF-kB, mais pas par des inhibiteurs de p38 MAPK, p44/42 MAPK ou PKC. Ces résultats indiquent que la stimulation de l’expression du gène Pax2 par les concentrations élevées de glucose est due, au moins en partie, à la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation NF-kB, et non pas via les voies PKC, p38 MAPK et p44/42 MAPK. Nos études ex vivo s’intéressaient aux effets d’un milieu hyperglycémique sur la morphogenèse de la ramification du bourgeon urétérique (UB). Des explants de reins embryonnaires (E12 à E18) ont été prélevés par micro-dissection de femelles HoxB7-GFP gestantes. Les explants ont ensuite été cultivés dans un milieu contenant soit 5mM D-glucose et 20mM D-mannitol ou 25mM D-glucose et avec ou sans antioxydants, catalase ou inhibiteur de PI3K/AKT pour diverses durées. Nos résultats ont démontré que le D-glucose stimule la ramification du UB de manière spécifique, et ce via l’expression du gène Pax2. Cette augmentation de la ramification et de l’expression du gène Pax2 peut être bloquée par des inhibiteurs des ROS et de PI3K/AKT. Ces études ont démontré que les hautes concentrations de glucose altèrent la morphogenèse de la ramification du UB via l’expression de Pax2. L’effet stimulant du glucose semble s’effectuer via la génération des ROS et l’activation de la voie de signalisation Akt. Nos études in vivo visaient à déterminer le rôle fondamental du diabète maternel sur les défauts de morphogenèse rénale chez la progéniture. Dans notre modèle animal, le diabète maternel est induit par le streptozotocin (STZ) chez des femelles HoxB7-GFP gestantes (E13). Les souriceaux ont été étudiés à différents âges (naissants et âgés de une, deux ou trois semaines). Nous avons examiné leurs morphologie rénale, nombre de néphrons, expression génique et les événements apoptotiques lors de cette étude à court terme. La progéniture des mères diabétiques avait un plus faible poids, taille et poids des reins, et possédait des glomérules plus petits et moins de néphrons par rapport à la progéniture des mères contrôles. La dysmorphogenèse rénale observée est peut-être causée par l’augmentation de l’apoptose des cellules dans la région du glomérule. Nos résultats ont montré que les souriceaux nés de mères diabétiques possèdent plus de podocytes apoptotiques et plus de marquage contre la caspase-3 active dans leurs tubules rénaux que la progéniture des mères contrôles. Les souriceaux des mères diabétiques montrent une augmentation de l’expression des composants du système rénine angiotensine (RAS) intrarénal comme l’angiotensinogène et la rénine, ainsi qu’une augmentation des isoformes p50 et p65 de NF-kB. Ces résultats indiquent que le diabète maternel active le RAS intrarénal et induit l’apoptose des glomérules, menant à une altération de la morphogenèse rénale de la progéniture. En conclusion, nos études ont permis de démontrer que le glucose élevé ou l’environnement in utero diabétique altère la morphogenèse du UB, qui résulte en un retard dans la néphrogenèse et produit des reins plus petits. Cet effet est dû, au moins en partie, à la génération des ROS, à l’activation du RAS intrarénal et à la voie NF-kB. Nos études futures se concentreront sur les mécanismes par lesquels le diabète maternel induit la programmation périnatale de l’hypertension chez la progéniture adulte. Cette étude à long terme porte sur trois types de progénitures : adultes nés de mères contrôles, diabétiques ou diabétiques traitées avec insuline pendant la gestation. Nous observerons la pression systolique, la morphologie rénale et l’expression de divers gènes et protéines. Nous voulons de plus déterminer si la présence d’un système antioxydant (catalase) peut protéger la progéniture des effets néfastes des ROS causés par l’environnement in utero hyperglycémique. Les souris Catalase-Tg expriment la catalase spécifiquement dans les tubules proximaux et nous permettrons d’explorer notre hypothèse sur le rôle des ROS dans notre modèle expérimental de diabète maternel. / Maternal diabetes is a major risk factor for congenital malformations. When the fetus is exposed to high, sustained, ambient glucose levels, widespread fetal damage may affect multiple organs, including the kidneys, evoking diabetic embryopathy syndrome. Renal malformations account for up to 40% of childhood renal failure cases. Hyperglycemia constitutes an adverse in utero environment that dynamically impairs nephrogenesis, resulting in renal agenesis, dysplasia, aplasia or hypoplasia. However, the molecular mechanisms by which high, ambient glucose levels lead to renal dysmorphogenesis and birth defects have not yet been delineated. Maternal diabetes also programs the offspring to develop other problems later in life, such as hypertension, obesity and type 2 diabetes. This phenomenon, called ‘perinatal programming’, has attracted worldwide attention in recent decades, yet the mechanisms by which it occurs are incompletely understood. My PhD studies are designed to elucidate the underlying molecular pathways by which maternal diabetes or hyperglycemic environments in utero impair nephrogenesis and subsequently make the offspring develop perinatal programming of hypertension in vitro, ex vivo and in vivo. We employed mouse embryonic metanephric mesenchyme cells, namely MK4 cells, for our in vitro experiments, and 2 transgenic (Tg) mouse lines, Hoxb7-GFP-Tg and Nephrin-CFP-Tg mice, for ex vivo and in vivo investigations. Hoxb7-GFP-Tg mice specifically express green fluorescent protein (GFP) in ureteric buds (UB), driven by the Hoxb7 promoter. Nephrin-CFP-Tg mice express cyan fluorescent protein (CFP) in glomeruli, driven by the podocyte-specific nephrin promoter. In our in vitro studies, we examined whether high glucose alters Pax2 gene expresson in MK4 cells. The cells were treated with either 5 mM D-glucose plus 20 mM D-mannitol or 25 mM D-glucose media with or without reactive oxygen species (ROS) blockers (DPI, rotenone), and inhibitors of p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) (SB203580), p44/22 MAPK (PD98059), protein kinase C (PKC) (GF109203X), or nuclear factor kappa B (NK-kB) (PDTC) for 24-hr incubation. Our data showed that high D-glucose (25 mM) increased ROS generation and specifically induced Pax2 gene expression, but not other glucose analogs such as D-mannitol, L-glucose or 2-deoxy-D-glucose in MK4 cells. The stimulatory effect of high D-glucose on Pax2 gene expression could be blocked by ROS and NF-kB inhibitors in MK4 cells but not by inhibitors of p38 MAPK (SB203580), p44/22 MAPK (PD98059), and PKC (GFX) in MK4 cells. These data indicated that the stimulatory effect of high glucose on Pax2 gene expression is mediated, at least in part, via ROS generation and activation of NF-κB, but not via the PKC, p38 MAPK and p44/42 MAPK signalling pathways. In our ex vivo studies, we investigated the influence of a high-glucose milieu on UB branching morphogenesis. Kidney explants (E12 to E18) were microdissected from timed-pregnant Hoxb7-GFP mice and cultured with either 5 mM D-glucose plus 20 mM D-mannitol or 25 mM D-glucose media with or without ROS blockers (DPI, rotenone), catalase and phosphoinositide-3-kinase (PI3K)/AKT inhibitor at different time points, depending on the experiment. We found that high D-glucose specifically stimulated UB branching in a time-dependent manner. High D-glucose stimulation of UB branching morphogenesis was mediated via Pax2 gene expression. High D-glucose-induced UB branching and Pax2 gene expression could be blocked by ROS and PI3K/AKT inhibitors. These studies demonstrated that high glucose alters UB branching morphogenesis via Pax2 gene and protein expression. The stimulatory effect of high glucose seems to be mediated via ROS generation and activation of the AKT signalling pathway. In our in vivo studies, we explored the fundamental role of maternal diabetes on renal morphogenesis impairment in offspring. In our experimental model, maternal diabetes was induced by streptozotocin in pregnant Hoxb7-GFP mice at embryonic day 13. The offspring were examined at several time points after birth (neonatal, 1 week, 2 weeks, and 3 weeks) with follow-up of kidney morphology, nephron number, gene expression, and apoptotic events in this short-term postnatal experiment. We observed that the offspring of diabetic mice had lower body weight, body size, kidney weight, small volume of glomeruli and a reduced number of nephrons in comparison to non-diabetic control offspring. Renal dysmorphogenesis may have been the result of increased cell apoptosis in glomeruli. Our findings showed that the offspring of diabetic mice displayed significantly more apoptotic podocytes as well as augmented active caspase-3 immunostaining in renal tubules compared to control mice offspring. Diabetic mice offspring presented heightened expression of intrarenal renin-angiotensin system (RAS) components, such as angiotensinogen and renin, with upregulation of p50 and p65 NF-kB isoforms. These data indicated that maternal diabetes activates the intrarenal RAS and induces glomerular apoptosis, resulting in impairment of renal morphogenesis in diabetic offspring. In conclusion, our findings indicated that a high-glucose milieu in utero or maternal diabetic alters UB morphogenesis, culminating in retardation of nephrogenesis with smaller kidney size. The underlying mechanism(s) is mediated, at least in part, via ROS generation and activation of the intrarenal RAS and NF-kB pathways. In the future, we aim to investigate the underlying mechanism(s) of how maternal diabetes induces perinatal programming of adult hypertension in offspring in vivo. This long-term postnatal study will be undertaken in 3 groups: adult offspring (20 weeks) of control mice, adult offspring of diabetic pregnant mice, and adult offspring of insulin-treated, diabetic, pregnant mice. We will follow-up by tracking hypertension, kidney morphology, and gene expression. Furthermore, we also plan to determine whether an antioxidant system (catalase) can protect against an hyperglycemic environment in utero that affects embryonic organogenesis via an increase in ROS generation. Catalase-Tg mice that specifically overexpress catalase in proximal tubules will be tested. Such Tg mice with catalase overexpression represent a model for exploring our hypothesis on the role of ROS in gestational diabetes.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

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Nous avons précédemment rapporté que le diabète maternel altère la néphrogenèse chez la progéniture diabétique de notre modèle murin de diabète maternel. Notre analyse par puce à ADN réalisée sur les reins néonatals de ces descendants de grossesse diabétique a révélé que l'expression de la protéine interagissant avec hedgehog (Hhip) était significativement surexprimée par rapport au groupe contrôle. En tant qu'antagoniste de Sonic hedgehog (Shh) qui joue un rôle essentiel dans la différenciation cellulaire, la croissance et le modelage tissulaire pendant le développement des reins et la fibrose rénale, Hhip se lie à Shh et atténue sa bioactivité. Il a été rapporté que la protéine Hhip est principalement exprimée dans les cellules endothéliales vasculaires et les cellules adjacentes à celles exprimant Shh. Cependant, le rôle fonctionnel de l'expression de Hhip dans les reins en développement et matures est à peine connu. Nous avons tout d'abord établi le profil d'expression de Hhip dans les reins embryonnaires. Dans notre modèle murin de diabète maternel, nous avons observé que l'expression du gène Hhip est différemment surexprimée dans le mésenchyme métanéphrique différencié et l'épithélium du bourgeon urétérique de la progéniture. En utilisant des cellules mésenchymateuses métanéphriques en culture (cellules MK4), nous avons démontré que le D-glucose élevé (25 mM D-glucose) stimulait spécifiquement l'expression de Hhip de façon dépendante du temps, puis ciblait la signalisation TGFβ1. De plus, la surexpression de Hhip augmentait l'expression des gènes pro-apoptotiques [NF-kB (P50/p65) et p53] et inhibait l'expression des gènes prolifératifs (i.e. Shh, Pax2, N-myc et p27Kip1). Finalement, nous avons démontré que le diabète maternel qui altère le développement des reins pourrait jouer un rôle dans les interactions de la voie Hhip et TGFβ1-SMAD (Diabetologia 2014). Après la naissance, dans le rein normal non-diabétique, l'expression de Hhip est quiescente; une expression basale et limitée de Hhip (ARNm et protéine) est détectable dans les cellules endothéliales glomérulaires matures, les podocytes et les cellules épithéliales tubulaires rénales. Alors que les lésions des cellules épithéliales glomérulaires (GECs) et des podocytes sont la caractéristique de la lésion rénale précoce de la néphropathie diabétique (DN), nous avons examiné plus en détail le rôle de l'expression rénale de Hhip dans certains modèles de diabète murin—e.g. souris Akita, souris db/db et souris Hhip hétérozygote (Hhip +/−) rendus diabétiques avec de faibles doses de streptozotocine (LDSTZ). Nos données révèlent que l'hyperglycémie (ou un taux élevé de glucose in vitro) active l'expression du gène Hhip dans les cellules endothéliales glomérulaires et les podocytes. En particulier, l'hétérozygosité de Hhip protège l'intégrité glomérulaire avec moins de pertes de podocytes et améliore les paramètres rénaux [c.-à-d., une diminution du ratio albumine/créatinine urinaire (ACR, une caractéristique de l'apparition de la maladie rénale) et les caractéristiques de la DN (hypertrophie rénale, augmentation du taux de filtration glomérulaire, glomérulosclérose et fibrose)]. Prises dans leur ensemble, nos données suggèrent que l’augmentation de l'expression rénale de Hhip due aux concentrations élevées de glucose peut déclencher directement le processus d'apoptose et de fibrose des cellules endothéliales glomérulaires observé dans le diabète et qu’elle joue un rôle clé dans le développement et la progression de la DN (Sci. Report 2018). Mots-clés : Expression des gènes de Hhip, diabète maternel, néphrogenèse, néphropathie diabétique, dérivé réactif de l'oxygène / We previously reported that maternal diabetes impairs nephrogenesis in diabetic progeny in our maternal diabetes murine model. Our gene-array performed in neonatal kidneys of those affected offspring revealed that hedgehog interacting protein (Hhip) expression was significantly upregulated, as compared to the control group. As an antagonist of sonic hedgehog (Shh) which plays an essential role in cell differentiation, growth and tissue patterning during kidney development and kidney fibrosis, Hhip binds to Shh and attenuates its bioactivity. It is reported that Hhip is predominantly expressed in vascular endothelial cells and cells adjacent to those expressing Shh. However, the functional role of Hhip expression in the developing and mature kidney is barely known. We first established the expression pattern of Hhip in embryonic kidneys. We observed in our murine model of maternal diabetes that Hhip gene expression is differentially up-regulated in differentiated metanephric mesenchyme and ureteric bud epithelium of the offspring. Using cultured metanephric mesenchymal cells (MK4 cells), we demonstrated that high D-glucose (25 mM D-Glucose) specifically stimulated Hhip expression in a time-/dose-dependent manner, and then targeted TGFβ1 signaling. In addition, overexpression of Hhip increased the expression of pro-apoptotic genes [NF-kB (p50/p65) and p53] and inhibited the expression of proliferative genes (i.e., Shh, Pax2, N-myc, and p27kip1). Finally, we demonstrated that maternal diabetes impairing kidney development might mediate the interactions of Hhip and TGFβ1-Smad pathway (Diabetologia 2014). After birth, in normal non-diabetic state, Hhip expression is quiescent; a limited basal Hhip expression (mRNA and protein) is detectable in mature glomerular endothelial cells, podocytes and renal tubular epithelial cells. While glomerular epithelial cells (GECs) and podocyte injury is the hallmark of early renal injury in diabetic nephropathy (DN), we further examined the role of renal Hhip expression in murine diabetes models--e.g., Akita mice, db/db mice and heterozygous Hhip deficiency (Hhip+/−) mice rendered diabetic with low-dose streptozotocin (LDSTZ). Our data revealed that hyperglycemia (or high glucose in vitro) activates Hhip gene expression in glomerular endothelial cells and podocytes. In particular, Hhip heterozygosity protects glomerular integrity with less podocyte loss and improved renal outcomes [i.e., decreased urinary albumin/Creatinine (Cre) ratio (ACR, a hallmark of onset of kidney disease) and DN-features (renal hypertrophy, increased glomerular filtration rate, glomerulosclerosis and fibrosis)]. Taken together, our data suggest that high glucose-elevated renal Hhip expression may directly trigger the process of apoptosis and fibrosis in glomerular endothelial cells in diabetes and it plays a key role in the development and progression of DN (Sci. Report 2018). Keywords: Hhip gene expression, maternal diabetes, nephrogenesis, diabetic nephropathy, reactive oxygen species