HNF1beta est un facteur de transcription exprimé pendant le développement rénal dans le bourgeon urétéral et les dérivés épithéliaux du blastème métanéphrique. Les mutations de HNF1B/MODY5 représentent l’une des anomalies génétiques les plus fréquentes à l’origine des CAKUT (Congenital Abnormalities of Kidney and Urinary Tract). Afin d’étudier le rôle de HNF1beta au cours du développement rénal, j’ai utilisé un système CRE-LoxP pour inactiver Hnf1b dans différents compartiments et à différents temps au cours de la morphogenèse rénale chez la souris. Mes résultats ont montré que Hnf1b est nécessaire pour l’expression de gènes clés exprimés dans le bourgeon urétéral, incluant Wnt9b, Emx2, Pax2 et Lhx1.Leur absence est à l’origine de la formation de reins rudimentaires, caractérisés par un branchement anormal du bourgeon urétéral et une absence de transition mésenchyme-épithélium. D’autre part, l’inactivation spécifique de Hnf1b dans le blastème métanéphrique n’affecte pas les premiers dérivés épithéliaux mais conduit à la formation de précurseurs néphroniques anormaux. En l’absence de HNF1beta, les corps en S ne développent pas une protubérance de cellules épithéliales, à l’origine des tubules proximaux et des anses de Henlé. Au niveau moléculaire, ces anomalies sont associées à une diminution de l’expression de Dll1, un ligand de Notch, qui est directement contrôlé par HNF1beta. Cette diminution conduit à une activation défectueuse de la voie Notch dans le futur compartiment tubulaire du corps en virgule et du corps en S. Des résultats préliminaires concernant une inactivation très chimérique de Hnf1b dans le mésenchyme ont montré que dans ce modèle, les néphrons se forment normalement mais que les tubules sont plus courts et partiellement kystiques. Mes résultats ont montré que les modèles murins d’inactivation conditionnelle de Hnf1b récapitulent la plupart des anomalies observées chez les patients MODY5. L’ensemble de mes résultats améliore notre compréhension du programme génétique contrôlé par Hnf1b au cours du développement dont les anomalies peuvent conduire aux CAKUT chez les patients / HNF1β is a transcription factor expressed during nephrogenesis in the ureteric bud and in the tubular epithelia derived from the metanephric mesenchyme. Mutations in HNF1B/MODY5 represent one of the most prevalent human genetic defects responsible for Congenital Abnormalities of Kidney and Urinary Tract (CAKUT). To investigate the role played by HNF1beta during kidney development, I made use of a CRE-LoxP strategy to inactivate Hnf1b in different compartments and at different time points during mouse kidney morphogenesis. My results showed that Hnf1b is required for the expression of several key genes including Wnt9b, Emx2, Pax2 and Lhx. These genes are normally expressed in the ureteric bud and their absence leads to the formation of rudimentary kidneys, characterized by abnormal ureteric bud branching and lack of mesenchymal to epithelial transition. On the other hand, the specific inactivation of Hnf1b in the metanephric mesenchyme does not affect the early steps of epithelisation but leads to severe malformation of nephron precursors. In the absence of HNF1β, S-Shaped bodies lack the formation of a bulge of epithelial cells that normally give rise to Henle’s loops and proximal tubules. At the molecular level, these defects are associated with a decreased expression of Dll1, a Notch ligand that is directly controlled by HNF1β. This downregulation leads to a defective activation of the Notch pathway in the prospective tubular compartment of comma and S-shaped bodies. Preliminary results using a highly chimeric inactivation of Hnf1b in the mesenchyme showed that the spotted absence of Hnf1b does not prevent nephrogenesis. However, tubules are shorter and partially cystic. My results showed that murine models for Hnf1b deficiency recapitulates many of the malformations described in MODY5 patients. All together, my results improved our understanding of the genetic program controlled by HNF1β during kidney development whose dysfunction may lead to CAKUT in patients

Les anomalies congénitales du rein et du tractus urinaire (CAKUT) sont l’une des malformations les plus fréquentes chez l’homme, et résultent d’un défaut du programme de dévelopement des organes. La famille de gènes Sox code pour 20 facteurs de transcription qui assurent des fonctions multiples et essentielles pendant l’organogenèse chez l’homme et la souris. Nous avons précedemment montré que Sox8 et Sox9 sont nécessaires au branchement de l’uretère, et la perte de ces gènes résulte en une agénésie rénale. L’objectif de ce projet de thèse était de caractériser le role des gènes Sox-C (Sox4/11/12) in vivo chez la souris. L’analyse des patrons d’expression a révélé que Sox4 , Sox11 et Sox12 sont co-exprimés dans les cellules progénitirices des néphrons, destinées à subir une transition mésenchyme epithelium (MET) pour former des vésicules qui s'allongent pour aboutir au néphron fonctionnel. L’analyse phénotypique a révélé une redondance fonctionnelle entre Sox4 et Sox11 pendant les processus de MET et de maturation des néphrons: les double mutants développent une hypodysplasie rénale dûe à une réduction dramatique du nombre et de la taille des néphrons. Le pool de progéniteurs de néphrons est intact chez ces mutants mais incapable de s’engager dans la nephrogenèse, probablement dû à un changement d’identité cellulaire. Par ailleurs, en l’absence de Sox11, des bourgeons uretéraux ectopiques se forment, conduisant à des reins duplex, phénotype présent dans une proportion de patients CAKUT. De manière importante, nous avons identifié une série de variants SOX11 dans une cohorte de patients CAKUT, suggérant l'implication de mutations SOX11 dans cette maladie chez l'homme. / Congenital abnormalities of the kidney and the urinary tract (CAKUT) belong to the mostcommon birth defects in human and are caused by defects in the program governing organ development. The Sox gene family encodes 20 transcription factors that ensure multiple and essential functions during mouse and human organogenesis. We have previously shown that the homologous genes Sox8 and Sox9 are required for the branching process of the ureter and their loss results in renal agenesis. In this thesis project, we aimed to identify and characterize the role of the Sox-C genes (Sox4/11/12), in vivo using mouse models. Expression analysis revealed that Sox4, Sox11 and Sox12 are coexpressed in the self-renewing nephron precursors cells that are destined to undergo mesenchyme-to-eptihelial transition (MET) to form vesicles that elongate to give rise to the functional nephrons. Phenotypical analysis revealed a functional redundancy between Sox4 and Sox11 in MET and nephron maturation processes: double mutants display renal hypodysplasia, due to a dramatic reduction in the number and size of nephrons. The nephron precursor pool is intact in these mutants but unable to commit to nephrogenesis, probably because of a cell identity change. In addition, in the absence of Sox11, ectopic ureteric buds form, leading to duplex kidneys, a phenotype found in a proportion of CAKUT patients. Importantly, mutation analysis of a cohort suffering from CAKUT syndrome identified a series of SOX11 variants, thus suggesting an involvement of SOX11 mutations in this human disease.

Chez le xénope, le pronéphros constitue le rein fonctionnel du têtard. Le sang est filtré par le glomus et l'urine est modifiée lors de son transit dans le tubule. Au cours de ma thèse, nous avons analysé l'expression des quatre membres de la famille pou3f au cours du développement embryonnaire chez le xénope. Nous avons montré que leur expression neurale, otique ou encore épidermique est conservée entre le xénope et la souris, de même que l'expression rénale de pou3f3. Nous avons également mis en évidence une expression pronéphrique de pou3f4. Nous avons ensuite analysé le rôle de Pou3f4 au cours du développement du pronéphros. La perte de fonction de Pou3f4 entraine des défauts de différenciation terminale du tubule intermédiaire et distal. Sa surexpression aboutit au contraire à une augmentation de l'expression des marqueurs de différenciation slc12a1 et clcnkb1. Les morphants Pou3f4 présentent aussi des défauts de morphogenèse du tubule intermédiaire caractérisés par des circonvolutions réduites. Nos résultats montrent que Pou3f4 contrôle l'expression de l'ephrine efnA3 dans le tubule pronéphrique. La perte de fonction d'EfnA3 conduit à des défauts de morphogenèse du tubule, suggérant que Pou3f4, par la régulation de l'expression d'efnA3, est impliqué dans les mouvements cellulaires nécessaires à l'élongation antérieure du tubule. Enfin, nous avons observé que pou3f3 et pou3f4 ne se régulent pas l'un de l'autre. Nous avons en revanche mis en évidence une redondance fonctionnelle de ces gènes dans la morphogenèse et la différenciation du tubule puisque la perte de fonction combinée de Pou3f3 et Pou3f4 entraine un phénotype plus sévère que chaque simple perte de fonction. / In Xenopus, pronephros is the functional kidney at tadpole stage. The blood is filtrated by the glomus and the urine is modifed all along the tubule. Pou3f3 is required for intermediate and distal tubule formation in mouse. During my PhD, we have analyzed the expression of the four pou3f genes during Xenopus embryonic development. We found that neural, otic, or epidermic expression of the various pou3f genes is conserved between Xenopus and mouse. Pou3f3 expression in the pronephros is similar to that observed in mouse. We futher showed for the first time pou3f4 expression in the developping kidney. Then, we analyzed the role of Pou3f4 during pronephros development. Pou3f4 depletion inhibits the expression of terminal differentiation marker genes in the intermediate and distal tubule. Pou3f4 upregulates the expression of slc12a1 and clcnkb1 in the tubule. Moreoer, we found that Pou3f4 loss of function leads to intermediate tubule morphogenesis defects. While ephrin signaling pathway is largely described as playing crucial role in cellular movement, Pou3f4 controls efnA3 expression in the intermediate and distal tubule. EfnA3 depletion phenocopies Pou3f4 loss of function, suggesting that Pou3f4, by regulationg efnA3 expression, is implicated in cell movements necessary for anterior elongation of the tubule. Finally, we find that pou3f3 and pou3f4 do not regulate each other expression. However, they act redundantly in pronephros development since the combined Pou3f3 and Pou3f4 loss of function results in a more severe phenotype than each loss of function alone.

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Introduction : La Vitamine A (rétinol, ROL) et son métabolite l’acide rétinoïque (AR) sont essentielles pour l’embryogénèse. L’excès comme l’insuffisance d’AR sont nocives. L’AR est régularisé dans l’embryon par des gènes spécifiques (ALDH, CRABP, CYP). Hypothèse : Les grandes variations d’AR dans le plasma des adultes normaux, nous ont orienté à mesurer les rétinoïdes (ROL et RA) dans le sang de cordon ombilical, pour évaluer des corrélations avec des polymorphismes des gènes impliquées dans le métabolisme de l’AR et le développement rénal-(RALDH2, CRABP2, CYP26A1; B1). Vérifier pour des corrélations entre ces rétinoïdes et/ou avec la taille de reins à la naissance. Méthodes : Extraction du ROL et RA du sang de cordon ombilical de 145 enfants et analyse par HPLC. Le volume des reins a été mesuré par ultrasonographie et l’ADN génomique leucocytaire extrait (FlexiGene DNA-Kit). 10 échantillons d’ADN ont été exclus (qualité). Les htSNP : ALDH1A2, CRABP2, CYP26A1;B1 du génome humain (HapMap) ont été séquencés et génotypés (Sequenom iPlex PCR).Des testes bio-statistiques des fréquences génotypiques et alléliques ont été effectués (Single-Locus, χ2, Kruskal-Wallis, Allelic-Exact).Des corrélations (ROL, RA, SNPs, V-reins) ont été analysés (Kendall-tau /Oakes). Résultats : La Δ RA (0.07-550.27 nmol/l) non corrélé avec la Δ ROL (51.39-3892.70 nmol/l). Il n’y a pas d’association ROL ou RA avec les volumes des reins ou avec les SNPs/ CYP21A1;B1. Corrélations trouvées : 1. (p=0.035), polymorphisme génétique ALDH1A2-SNP (rs12591551:A/C) hétérozygote/CA, (25enfants, 19%) avec moyennes d’AR (62.21nmol/l). 2. (p=0.013), polymorphisme CRABP2-SNP (rs12724719:A/G) homozygote/AA (4 enfants, 3%) avec hautes valeurs moyennes d’AR (141,3 nmol/l). Discussion-Conclusion : Les grandes ΔRA suggèrent une variabilité génique individuelle du métabolisme de ROL. Les génotypes (CA)-ALDH1A2/ SNP (rs12591551:A/C) et (AA) -CRABP2/SNP (rs12724719:A/G) sont associés à des valeurs moyennes hautes d’AR, pouvant protéger l’embryogénèse lors d’une hypovitaminose A maternelle. / Introduction: Vitamin A (retinol, ROL) modulate the embryogenesis thorough RA, its metabolite. Excess or deficiency being pathologic, the RA is tight regulated in the embryo thorough specific genes (ALDH, CRABP, CYP, etc.) important for Vitamin A metabolism. Hypothesis: High RA variations in healthy adults plasma, oriented to ROL, RA evaluation in human cord blood, in regard of possible correlations with polymorphisms of genes involved in RA metabolism and kidney development (RALDH2, CRABP2, CYP26A1,B1). Correlations between ROL and RA and/or with birth kidney size might also occur. Methods: Cord blood ROL and RA were extracted and HPLC analysed, from 145 Montreal healthy newborns. Kidney volumes already measured by ultrasonography. Genomic leucocytary DNA extraction was performed with FlexiGene DNA-Kit. 10 samples excluded (DNA quality). htSNP choices: ALDH1A2, CRABP2, CYP26A1;B1 were made on HapMap human genome. Sequencing, genotyping (Sequenom iPlex PCR) was made for these genes eventual SNPs. Biostatistics tests for genotype and allelic frequencies (Single-Locus, χ2, Kruskal-Wallis, Allelic-Exact) and Kendall-tau /Oakes analysis for eventual ROL, RA, SNPs, V-reins correlations, were performed. Results: No correlation found between Δ RA (0.07-550.27 nmol/L) and Δ ROL (51.39-3892.70 nmol/L). No association ROL or RA with kidney volumes nor with SNPs/ CYP21A1;B1. Found correlations: 1. (p=0.035), polymorphism ALDH1A2-SNP (rs12591551:A/C) heterozygous/CA, (25babies, 19%) with RA (mean ~62.21nmol/L). 2. (p=0.013), polymorphism CRABP2-SNP (rs12724719: A/G) homozygous/AA (4babies, 3%) with RA (mean~141, 3 nmol/L). Discussion/Conclusion: Big Δ RA not correlated with Δ ROL suggests individual genetic variance on RA metabolism. Genotypes (CA)-ALDH1A2/SNP (rs12591551:A/C) and (AA)-CRABP2/SNP (rs12724719: A/G) are associated with high cord blood RA mean and may be embryogenesis protective in a maternal hypovitaminosis-A, environment.

RÉSUMÉ: Introduction : La Vitamine A (rétinol, ROL) et son métabolite l’acide rétinoïque (AR) sont essentielles pour l’embryogénèse. L’excès comme l’insuffisance d’AR sont nocives. L’AR est régularisé dans l’embryon par des gènes spécifiques (ALDH, CRABP, CYP). Hypothèse : Les grandes variations d’AR dans le plasma des adultes normaux, nous ont orienté à mesurer les rétinoïdes (ROL et RA) dans le sang de cordon ombilical, pour évaluer des corrélations avec des polymorphismes des gènes impliquées dans le métabolisme de l’AR et le développement rénal-(RALDH2, CRABP2, CYP26A1; B1). Vérifier pour des corrélations entre ces rétinoïdes et/ou avec la taille de reins à la naissance. Méthodes : Extraction du ROL et RA du sang de cordon ombilical de 145 enfants et analyse par HPLC. Le volume des reins a été mesuré par ultrasonographie et l’ADN génomique leucocytaire extrait (FlexiGene DNA-Kit). 10 échantillons d’ADN ont été exclus (qualité). Les htSNP : ALDH1A2, CRABP2, CYP26A1;B1 du génome humain (HapMap) ont été séquencés et génotypés (Sequenom iPlex PCR).Des testes bio-statistiques des fréquences génotypiques et alléliques ont été effectués (Single-Locus, χ2, Kruskal-Wallis, Allelic-Exact).Des corrélations (ROL, RA, SNPs, V-reins) ont été analysés (Kendall-tau /Oakes). Résultats : La Δ RA (0.07-550.27 nmol/l) non corrélé avec la Δ ROL (51.39-3892.70 nmol/l). Il n’y a pas d’association ROL ou RA avec les volumes des reins ou avec les SNPs/ CYP21A1;B1. Corrélations trouvées : 1. (p=0.035), polymorphisme génétique ALDH1A2-SNP (rs12591551:A/C) hétérozygote/CA, (25enfants, 19%) avec moyennes d’AR (62.21nmol/l). 2. (p=0.013), polymorphisme CRABP2-SNP (rs12724719:A/G) homozygote/AA (4 enfants, 3%) avec hautes valeurs moyennes d’AR (141,3 nmol/l). Discussion-Conclusion : Les grandes ΔRA suggèrent une variabilité génique individuelle du métabolisme de ROL. Les génotypes (CA)-ALDH1A2/ SNP (rs12591551:A/C) et (AA) -CRABP2/SNP (rs12724719:A/G) sont associés à des valeurs moyennes hautes d’AR, pouvant protéger l’embryogénèse lors d’une hypovitaminose A maternelle. Mots clé: sang de cordon ombilical, ROL-rétinol, AR-acide rétinoïque, HPLC, SNP- polymorphisme, ALDH1A2, CRABP2, CYP26A1,développement rénal,embryogénèse. / ABSTRACT Introduction: Vitamin A (retinol, ROL) modulate the embryogenesis thorough RA, its metabolite. Excess or deficiency being pathologic, the RA is tight regulated in the embryo thorough specific genes (ALDH, CRABP, CYP, etc.) important for Vitamin A metabolism. Hypothesis: High RA variations in healthy adults plasma, oriented to ROL, RA evaluation in human cord blood, in regard of possible correlations with polymorphisms of genes involved in RA metabolism and kidney development (RALDH2, CRABP2, CYP26A1,B1). Correlations between ROL and RA and/or with birth kidney size might also occur. Methods: Cord blood ROL and RA were extracted and HPLC analysed, from 145 Montreal healthy newborns. Kidney volumes already measured by ultrasonography. Genomic leucocytary DNA extraction was performed with FlexiGene DNA-Kit. 10 samples excluded (DNA quality). htSNP choices: ALDH1A2, CRABP2, CYP26A1;B1 were made on HapMap human genome. Sequencing, genotyping (Sequenom iPlex PCR) was made for these genes eventual SNPs. Biostatistics tests for genotype and allelic frequencies (Single-Locus, χ2, Kruskal-Wallis, Allelic-Exact) and Kendall-tau /Oakes analysis for eventual ROL, RA, SNPs, V-reins correlations, were performed. Results: No correlation found between Δ RA (0.07-550.27 nmol/L) and Δ ROL (51.39-3892.70 nmol/L). No association ROL or RA with kidney volumes nor with SNPs/ CYP21A1;B1. Found correlations: 1. (p=0.035), polymorphism ALDH1A2-SNP (rs12591551:A/C) heterozygous/CA, (25babies, 19%) with RA (mean ~62.21nmol/L). 2. (p=0.013), polymorphism CRABP2-SNP (rs12724719: A/G) homozygous/AA (4babies, 3%) with RA (mean~141, 3 nmol/L). Discussion/Conclusion: Big Δ RA not correlated with Δ ROL suggests individual genetic variance on RA metabolism. Genotypes (CA)-ALDH1A2/SNP (rs12591551:A/C) and (AA)-CRABP2/SNP (rs12724719: A/G) are associated with high cord blood RA mean and may be embryogenesis protective in a maternal hypovitaminosis-A, environment. Key words: umbilical cord blood, ROL-retinol, AR-retinoic acid, HPLC, SNP- polymorphism, ALDH1A2, CRABP2, CYP26A1,kidney development,embryogenesis. / Note d'excellence 10%: « Le Jury, à l'unanimité, juge ce mémoire excellent et le classe parmi les 10% des mémoires de la discipline » - selon le Rapport définitif du jury d'éxamen d'un mémoire de maîtrise.