Chez le xénope, le pronéphros constitue le rein fonctionnel du têtard. Le sang est filtré par le glomus et l'urine est modifiée lors de son transit dans le tubule. Au cours de ma thèse, nous avons analysé l'expression des quatre membres de la famille pou3f au cours du développement embryonnaire chez le xénope. Nous avons montré que leur expression neurale, otique ou encore épidermique est conservée entre le xénope et la souris, de même que l'expression rénale de pou3f3. Nous avons également mis en évidence une expression pronéphrique de pou3f4. Nous avons ensuite analysé le rôle de Pou3f4 au cours du développement du pronéphros. La perte de fonction de Pou3f4 entraine des défauts de différenciation terminale du tubule intermédiaire et distal. Sa surexpression aboutit au contraire à une augmentation de l'expression des marqueurs de différenciation slc12a1 et clcnkb1. Les morphants Pou3f4 présentent aussi des défauts de morphogenèse du tubule intermédiaire caractérisés par des circonvolutions réduites. Nos résultats montrent que Pou3f4 contrôle l'expression de l'ephrine efnA3 dans le tubule pronéphrique. La perte de fonction d'EfnA3 conduit à des défauts de morphogenèse du tubule, suggérant que Pou3f4, par la régulation de l'expression d'efnA3, est impliqué dans les mouvements cellulaires nécessaires à l'élongation antérieure du tubule. Enfin, nous avons observé que pou3f3 et pou3f4 ne se régulent pas l'un de l'autre. Nous avons en revanche mis en évidence une redondance fonctionnelle de ces gènes dans la morphogenèse et la différenciation du tubule puisque la perte de fonction combinée de Pou3f3 et Pou3f4 entraine un phénotype plus sévère que chaque simple perte de fonction. / In Xenopus, pronephros is the functional kidney at tadpole stage. The blood is filtrated by the glomus and the urine is modifed all along the tubule. Pou3f3 is required for intermediate and distal tubule formation in mouse. During my PhD, we have analyzed the expression of the four pou3f genes during Xenopus embryonic development. We found that neural, otic, or epidermic expression of the various pou3f genes is conserved between Xenopus and mouse. Pou3f3 expression in the pronephros is similar to that observed in mouse. We futher showed for the first time pou3f4 expression in the developping kidney. Then, we analyzed the role of Pou3f4 during pronephros development. Pou3f4 depletion inhibits the expression of terminal differentiation marker genes in the intermediate and distal tubule. Pou3f4 upregulates the expression of slc12a1 and clcnkb1 in the tubule. Moreoer, we found that Pou3f4 loss of function leads to intermediate tubule morphogenesis defects. While ephrin signaling pathway is largely described as playing crucial role in cellular movement, Pou3f4 controls efnA3 expression in the intermediate and distal tubule. EfnA3 depletion phenocopies Pou3f4 loss of function, suggesting that Pou3f4, by regulationg efnA3 expression, is implicated in cell movements necessary for anterior elongation of the tubule. Finally, we find that pou3f3 and pou3f4 do not regulate each other expression. However, they act redundantly in pronephros development since the combined Pou3f3 and Pou3f4 loss of function results in a more severe phenotype than each loss of function alone.

Les noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV) de l’hypothalamus montrent un phénomène réversible de plasticité structurale neurono-gliale dans diverses conditions physiologiques telles que la parturition, l’allaitement ou lors d’une surcharge en sel. En effet, les feuillets astrocytaires qui enveloppent normalement les somas et dendrites des neurones à ocytocine (OT) ou à vasopressine (AVP) se rétractent alors, autour des neurones à OT, laissant place à la formation de nouvelles synapses, surtout GABAergiques. Nous avons émis l’hypothèse voulant que ces mouvements cellulaires soient régulés par des molécules connues pour leurs rôles dans l’adhérence et la motilité cellulaires, notamment les récepteurs Eph et les éphrines (Efn). Nous avons étudié le rôle de l’un de ces récepteurs, EphA4, un récepteur à tyrosine kinase reconnaissant l’ensemble des Efn, A ou B, puis tenté d’identifier les Efn partenaires dans le NSO, à la suite d’une surcharge en sel. Pour démontrer la présence d’EphA4 dans le NSO et déterminer l’effet d’une surcharge en sel sur son expression et sa localisation, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie en microscopie électronique, sur des coupes de cerveaux de souris ou rats traités ou non à l’eau salée pendant 1-7 j, avec des ribosondes ou des anticorps spécifiques pour EphA4. Ces travaux ont démontré une augmentation de l’expression d’EphA4 dans le NSO, notamment dans des dendrites, après le régime salé. La distribution de cette expression correspondait à celle des neurones OT et était absente de la glia limitans. Nous avons ensuite déterminé l’effet d’une absence d’EphA4 sur les mouvements astrocytaires et la synaptogènese autour des dendrites à OT et AVP, en utilisant des souris EphA4 knockouts et des souris de type sauvage des mêmes portées. Nous avons ainsi mesuré la couverture astrocytaire des dendrites OT ou AVP, identifiées par immunocytochimie anti-OT ou anti-AVP, en microscopie électronique. Ces mesures ont confirmé la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse autour des dendrites OT, mais pas autour des dendrites AVP, chez les souris de type sauvage, et démontré que la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse sur les dendrites OT ne se produisait pas chez les souris knockouts soumises à la surcharge en sel. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle d’EphA4 dans cette plasticité structurale neurono-gliale. Afin d’identifier l’Efn partenaire d’EphA4 dans cette fonction, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les EfnB3 et -A3. L’hybridation in situ n’a pas démontré d’expression de l’EfnB3 dans le NSO, tandis que les résultats pour l’EfnA3 restent à quantifier. Cependant, l’immunohistochimie anti-EfnA3 montre un marquage d’astrocytes dans le NSO et la glia limitans, marquage qui semble augmenter après surcharge en sel, mais il reste à démontrer que l’anticorps anti-EfnA3 est bien spécifique et à quantifier les éventuels changements sur un plus grand nombre d’animaux. L’ensemble de ces observations démontre un rôle du récepteur EphA4 dans les mécanismes à la base des changements structuraux neurono-gliaux du NSO et pointe vers l’EfnA3 comme partenaire d’EphA4 dans ce modèle. / The supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) nuclei of the hypothalamus display reversible neurono-glial structural plasticity in various physiological conditions, such as parturition, lactation, or following salt loading. In such conditions, astrocytic leaflets that normally envelop the somas and dendrites of ocytocin (OT) or arginin-vasopressin (AVP) neurons retract from OT processes where they are replaced by new synapses, mainly GABAergic. Our hypothesis proposes that these cellular movements are regulated by molecules known for their roles in cell adhesion and motility, notably Eph receptors and ephrins (Efn). We have examined the role of one of these receptors, EphA4, a tyrosine-kinase receptor recognizing all ephrins, A or B, and then tried to identify the Efn interacting with EphA4 in these functions, following salt-loading. To demonstrate the presence of EphA4 in the SON and determine the effect of salt loading on its expression, we used in situ hybridization and immunohistochemistry in light and electron microscopy, on brain sections from rats or mice treated with salted water during 1-7 d, using riboprobes and antibodies specific for EphA4. These experiments demonstrated that EphA4 is expressed in the SON, with a distribution of its mRNA similar to that of OT neurons, and that it was absent from the glia limitans. Its expression increased following salt loading, particularly in dendrites. We then tested the effect of an absence of EphA4 on astrocytic process retraction and on synaptogenesis, using EphA4 kockout mice and wild-type littermates. We measured the ratio of astrocytic contact, and counted the number of synapses on the circumference of OT and AVP dendrites, identified in electron microscopy by immunocytochemistry, after 7 d of salt loading. The results confirmed the retraction of astrocytic processes from OT dendrites in wild-type animals after salt loading, and no change around AVP dendrites. However, there was no retraction from OT dendrites in EphA4 knockout mice, following salt loading. Altogether, these results constitute strong evidence for a role of EphA4 in the astrocyte leaflet retraction and accompanying synaptogenesis, specifically around OT dendrites. In order to identify the Efn interacting with EphA4 in this function, we used in situ hybridization and immunohistochemistry for EfnB3 and –A3. The in situ hybridization did not show the presence of EfnB3 in the SON, while the results for EfnA3 are currently being quantified. Nevertheless, anti-EfnA3 immunohistochemistry showed labelling in astrocytes and in the glia limitans of the SON, a labelling that seemed to increase following salt loading, although the specificity of the anti-EfnA3 antibody remains to be demonstrated on EfnA3 knockout mice, and its expression requires to be measured on a larger number of mice. The latter observations indicate EfnA3 as the potential partner (receptor/ligand) for EphA4 in the neurono-glial structural plasticity occurring in the SON following salt loading.

Les noyaux supraoptiques (NSO) et paraventriculaires (NPV) de l’hypothalamus montrent un phénomène réversible de plasticité structurale neurono-gliale dans diverses conditions physiologiques telles que la parturition, l’allaitement ou lors d’une surcharge en sel. En effet, les feuillets astrocytaires qui enveloppent normalement les somas et dendrites des neurones à ocytocine (OT) ou à vasopressine (AVP) se rétractent alors, autour des neurones à OT, laissant place à la formation de nouvelles synapses, surtout GABAergiques. Nous avons émis l’hypothèse voulant que ces mouvements cellulaires soient régulés par des molécules connues pour leurs rôles dans l’adhérence et la motilité cellulaires, notamment les récepteurs Eph et les éphrines (Efn). Nous avons étudié le rôle de l’un de ces récepteurs, EphA4, un récepteur à tyrosine kinase reconnaissant l’ensemble des Efn, A ou B, puis tenté d’identifier les Efn partenaires dans le NSO, à la suite d’une surcharge en sel. Pour démontrer la présence d’EphA4 dans le NSO et déterminer l’effet d’une surcharge en sel sur son expression et sa localisation, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie en microscopie électronique, sur des coupes de cerveaux de souris ou rats traités ou non à l’eau salée pendant 1-7 j, avec des ribosondes ou des anticorps spécifiques pour EphA4. Ces travaux ont démontré une augmentation de l’expression d’EphA4 dans le NSO, notamment dans des dendrites, après le régime salé. La distribution de cette expression correspondait à celle des neurones OT et était absente de la glia limitans. Nous avons ensuite déterminé l’effet d’une absence d’EphA4 sur les mouvements astrocytaires et la synaptogènese autour des dendrites à OT et AVP, en utilisant des souris EphA4 knockouts et des souris de type sauvage des mêmes portées. Nous avons ainsi mesuré la couverture astrocytaire des dendrites OT ou AVP, identifiées par immunocytochimie anti-OT ou anti-AVP, en microscopie électronique. Ces mesures ont confirmé la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse autour des dendrites OT, mais pas autour des dendrites AVP, chez les souris de type sauvage, et démontré que la rétraction des feuillets astrocytaires et la synaptogenèse sur les dendrites OT ne se produisait pas chez les souris knockouts soumises à la surcharge en sel. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle d’EphA4 dans cette plasticité structurale neurono-gliale. Afin d’identifier l’Efn partenaire d’EphA4 dans cette fonction, nous avons utilisé l’hybridation in situ et l’immunohistochimie pour les EfnB3 et -A3. L’hybridation in situ n’a pas démontré d’expression de l’EfnB3 dans le NSO, tandis que les résultats pour l’EfnA3 restent à quantifier. Cependant, l’immunohistochimie anti-EfnA3 montre un marquage d’astrocytes dans le NSO et la glia limitans, marquage qui semble augmenter après surcharge en sel, mais il reste à démontrer que l’anticorps anti-EfnA3 est bien spécifique et à quantifier les éventuels changements sur un plus grand nombre d’animaux. L’ensemble de ces observations démontre un rôle du récepteur EphA4 dans les mécanismes à la base des changements structuraux neurono-gliaux du NSO et pointe vers l’EfnA3 comme partenaire d’EphA4 dans ce modèle. / The supraoptic (SON) and paraventricular (PVN) nuclei of the hypothalamus display reversible neurono-glial structural plasticity in various physiological conditions, such as parturition, lactation, or following salt loading. In such conditions, astrocytic leaflets that normally envelop the somas and dendrites of ocytocin (OT) or arginin-vasopressin (AVP) neurons retract from OT processes where they are replaced by new synapses, mainly GABAergic. Our hypothesis proposes that these cellular movements are regulated by molecules known for their roles in cell adhesion and motility, notably Eph receptors and ephrins (Efn). We have examined the role of one of these receptors, EphA4, a tyrosine-kinase receptor recognizing all ephrins, A or B, and then tried to identify the Efn interacting with EphA4 in these functions, following salt-loading. To demonstrate the presence of EphA4 in the SON and determine the effect of salt loading on its expression, we used in situ hybridization and immunohistochemistry in light and electron microscopy, on brain sections from rats or mice treated with salted water during 1-7 d, using riboprobes and antibodies specific for EphA4. These experiments demonstrated that EphA4 is expressed in the SON, with a distribution of its mRNA similar to that of OT neurons, and that it was absent from the glia limitans. Its expression increased following salt loading, particularly in dendrites. We then tested the effect of an absence of EphA4 on astrocytic process retraction and on synaptogenesis, using EphA4 kockout mice and wild-type littermates. We measured the ratio of astrocytic contact, and counted the number of synapses on the circumference of OT and AVP dendrites, identified in electron microscopy by immunocytochemistry, after 7 d of salt loading. The results confirmed the retraction of astrocytic processes from OT dendrites in wild-type animals after salt loading, and no change around AVP dendrites. However, there was no retraction from OT dendrites in EphA4 knockout mice, following salt loading. Altogether, these results constitute strong evidence for a role of EphA4 in the astrocyte leaflet retraction and accompanying synaptogenesis, specifically around OT dendrites. In order to identify the Efn interacting with EphA4 in this function, we used in situ hybridization and immunohistochemistry for EfnB3 and –A3. The in situ hybridization did not show the presence of EfnB3 in the SON, while the results for EfnA3 are currently being quantified. Nevertheless, anti-EfnA3 immunohistochemistry showed labelling in astrocytes and in the glia limitans of the SON, a labelling that seemed to increase following salt loading, although the specificity of the anti-EfnA3 antibody remains to be demonstrated on EfnA3 knockout mice, and its expression requires to be measured on a larger number of mice. The latter observations indicate EfnA3 as the potential partner (receptor/ligand) for EphA4 in the neurono-glial structural plasticity occurring in the SON following salt loading.