Dans le but d'évaluer l'influence de l'infection rénale sur la toxicité de la gentamicine, une pyélonéphrite expérimentale à Escherichia coli est induite chez les rats. Plusieurs groupes d'animaux : infectés, traités ou infectés et traités ont été étudiés. Deux traitements à la gentamicine furent institués: 1- 10 mg/kg Q8H et 2- 30 mg/kg Q8H, pendant 3 jours. Plusieurs paramètres de toxicité rénale ont été analysés soient : la diurèse, l'osmolalité urinaire, la protéinurie, la B-galactosurie et Y-glutamyltransférase. Que ce soit a basse ou à haute dose, l'infection rénale semble potentialiser la néphrotoxicité de la gentamicine / Montréal Trigonix inc. 2018

Dans le cadre de l’évaluation de la néphrotoxicité métabolique du cadmium, nous avons étudié l'effet du chlorure de cadmium (CdCl2) sur la néoglucogenèse dans les tubules rénaux proximaux murins et humains. Les expériences de dose-effets in vitro montrent que le CdCl2 inhibe l’utilisation de lactate et la production de glucose de façon dose-dépendante. En outre, le CdCl2 induit une diminution importante des concentrations cellulaires de l'ATP et des principaux composés contenant des groupements thiols tels que les coenzymes A et le glutathion réduit. Les mesures enzymatiques et de spectroscopie RMN du carbone 13, montrent que le CdCl2 produit dans les tubules rénaux murins et humains respectivement aux concentrations de 10 et 100 μM, une inhibition des flux à travers la lactate déshydrogénase et l'ensemble de la voie de la néoglucogenèse. Nos résultats sont en faveur d’une action inhibitrice directe du cadmium sur les enzymes intervenant dans la voie de la néoglucogenèse. Toutefois, la baisse intracellulaire en ATP, coenzymes A et glutathion, aurait un effet potentialisateur de cette inhibition. Ainsi, cette étude fournit une base biochimique pour une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires des tubulopathies proximales survenant chez l'homme suite à une exposition chronique au cadmium. / As part of the assessment of metabolism nephrotoxicity of cadmium, we have studied the effect of cadmium chloride (CdCl2) on gluconeogenesis in isolated mouse and human renal proximal tubules. The dose-response experiments in vitro have shown that CdCl2 inhibits the use of lactate and glucose production in a dose-dependent fashion. Besides, the CdCl2 induced a significant decrease in cellular concentrations of ATP and the main compounds containing thiol groups such as coenzyme A and reduced glutathione. The enzymatic steps and 13C-NMR spectroscopy showed that CdCl2 produced in mouse and human kidney tubules respectively at concentrations of 10 and 100 μM, an inhibition of fluxes through lactate dehydrogenase and the entire gluconeogenic pathway. Our results are in favor of a direct inhibitory action of cadmium on enzymes involved in the gluconeogenic pathway. However, the decrease in intracellular ATP, glutathione and coenzyme A, would have a potentiating effect of this inhibition. Therefore, this study provides a biochemical basis for better understanding the cellular mechanisms of proximal tubular nephropathy occurring in humans following chronic exposure to cadmium.

Au cours de ce travail, nous avons recherché l’effet du nitrate et de l’acétate d’uranyle sur des tubules proximaux isolés de reins de souris et de reins humains métabolisant l’un de ses substrats physiologiques, le lactate. Notre étude montre que le nitrate et l’acétate d’uranyle diminuent la gluconéogenèse et le niveau intracellulaire d’ATP de manière dose-dépendante pour des concentrations de l’ordre du millimolaire. Après l’incubation dans un milieu Krebs dépourvu d’ions phosphate en présence de L-[1-13C]-, ou L-[2-13C]-, ou L-[3-13C]lactate, la consommation du substrat et la formation de produits ont été mesurées par des méthodes enzymatiques et par spectroscopie RMN du 13C. En combinant les résultats obtenus par chacune de ces méthodes à l’aide d’un modèle mathématique du métabolisme du lactate, il a pu être montré qu’à la concentration de 3 mM, le nitrate d’uranyle exerce un effet inhibiteur sur les flux enzymatiques de la lactate deshydrogénase (LDH) et de 3 enzymes clés de la gluconéogenèse ; chez la souris et l’homme, les flux sont inhibés respectivement de 14% et 20% (LDH), de 32% et 27% (pyruvate carboxylase), de 36% et 35% (phosphoénolpyruvate carboxykinase) et de 45% et 39% (glucose-6-phosphatase). De plus, une diminution de la quantité de glutathion est observée chez la souris (-36%) et chez l’homme (-12%). Contrairement à ce que l’on attendait, car les ions phosphate pourraient faciliter l’entrée de l’uranium dans la cellule, dans les tubules proximaux murins, l’ajout d’ions phosphate au milieu d’incubation ne semble pas accroître l’inhibition de la gluconéogenèse rénale par le nitrate d’uranyle 3 mM / As part of a study on uranium nephrotoxicity, we investigated the effect of uranyl nitrate and acetate in isolated human and mouse kidney cortex tubules metabolizing the physiological substrate lactate. In the millimolar range, uranyl nitrate and acetate reduced gluconeogenesis and the cellular ATP level in a dose-dependent fashion. After incubation in phosphate-free Krebs-Henseleit medium with 5 mM L-[1-13C]-, ou L-[2-13C]-, ou L-[3-13C]lactate, substrate utilization and product formation were measured by enzymatic and NMR spectroscopic methods. In the presence of 3 mM uranyl nitrate, glucose production and the intracellular ATP content were significantly reduced in both human and mouse tubules. Combination of enzymatic and NMR measurements with a mathematical model of lactate metabolism revealed an inhibition of fluxes through lactate dehydrogenase and the gluconeogenic enzymes in the presence of 3 mM uranyl nitrate; in human and mouse tubules, fluxes were reduced by 20% and 14% (lactate dehydrogenase), 27% and 32% (pyruvate carboxylase), 35% and 36% (phosphoenolpyruvate carboxykinase), and 39% and 45% (glucose-6-phosphatase), respectively. These effects were associated with a 12% and 36 % decrease in the cellular content of glutathione in human and mouse tubules, respectively. Contrary to what expected because phosphate was supposed to facilitate the entry of uranium, the addition of phosphate in the medium did not enhance the inhibitory effect of 3 mM uranyl nitrate on gluconeogenesis in isolated mouse tubules

Dans le cadre de l'évaluation de la néphrotoxicité métabolique du cadmium, nous avons étudié l'effet du chlorure de cadmium (CdCl2) sur la néoglucogenèse dans les tubules rénaux proximaux murins et humains. Les expériences de dose-effets in vitro montrent que le CdCl2 inhibe l'utilisation de lactate et la production de glucose de façon dose-dépendante. En outre, le CdCl2 induit une diminution importante des concentrations cellulaires de l'ATP et des principaux composés contenant des groupements thiols tels que les coenzymes A et le glutathion réduit. Les mesures enzymatiques et de spectroscopie RMN du carbone 13, montrent que le CdCl2 produit dans les tubules rénaux murins et humains respectivement aux concentrations de 10 et 100 μM, une inhibition des flux à travers la lactate déshydrogénase et l'ensemble de la voie de la néoglucogenèse. Nos résultats sont en faveur d'une action inhibitrice directe du cadmium sur les enzymes intervenant dans la voie de la néoglucogenèse. Toutefois, la baisse intracellulaire en ATP, coenzymes A et glutathion, aurait un effet potentialisateur de cette inhibition. Ainsi, cette étude fournit une base biochimique pour une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires des tubulopathies proximales survenant chez l'homme suite à une exposition chronique au cadmium.

Bien que le Tacrolimus soit un immunosuppresseur largement prescrit en transplantation rénale, ses effets néphrotoxiques limitent son utilisation. En effet, le Tacrolimus contribue au développement de lésions de fibrose interstitielle rénale et d’atrophie tubulaire à plus ou moins brève échéance. Parmi les mécanismes qui interviennent dans le processus de fibrogenèse, la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM) a été évoquée. Dans ce processus, une cellule épithéliale polarisée perd l’expression de certains de ses marqueurs épithéliaux (E-cadhérine, cytokératine, β-caténine membranaire...) au profit d’un phénotype mésenchymateux (expression de marqueurs mésenchymateux tels que vimentine ou translocation nucléaire de la β-caténine, sécrétion de composants de la matrice extracellulaire). Ainsi, afin d’identifier des déterminants moléculaires de la néphrotoxicité induite par le Tacrolimus et d’évaluer la contribution du processus de TEM, plusieurs approches in vitro et in vivo ont été combinées.Tout d’abord, un modèle de culture primaire de cellules tubulaires proximales rénales (CTP), cibles privilégiées des xénobiotiques au niveau rénal a été développé à partir de pièces opératoires. Ce modèle a été caractérisé : analyse de la stabilité sur 5 passages, de l’expression de marqueurs épithéliaux proximaux et mésenchymateux, et de la résistance trans-épithéliale... De plus, la comparaison de la capacité métabolique des échantillons de tissu rénal sain à différents modèles cellulaires (HEK293, HK-2, CTP) nous a permis de montrer que les CTP est le modèle le plus pertinent. De plus, l’exposition de cellules rénales au Tacrolimus induit une modification du phénotype des cellules.De plus, le développement d’un modèle murin de néphrotoxicité induite par le Tacrolimus a été réalisé (exposition durant 28 jours à une dose de 1 mg/kg/j de Tacrolimus par implantation sous-cutanée de pompes Alzet® ou par injection intra-péritonéale). Les données histologiques et d’expression génique montrent que les reins de souris traitées par Tacrolimus présentent des zones localisées d’expression des marqueurs mésenchymateux (vimentine) et de fibrose (collagène, α-SMA, miR-21). Par ailleurs, la variabilité interindividuelle des effets néphrotoxiques du Tacrolimus étant potentiellement associée à la présence de polymorphismes génétiques (SNP), les ADN de patients transplantés rénaux et de leur greffon ont été génotypés pour des SNP (i) affectant les CYP3A5 et ABCB1, intervenant dans la prise en charge du Tacrolimus, (ii) affectant la cavéoline-1, impliquée dans le processus de fibrose. Nos résultats montrent que deux SNP affectant le donneur (CYP3A5 6986A>G et ABCB1 3435C>T) sont significativement associés à une plus faible expression des marqueurs de TEM (expression de novo de la vimentine et translocation nucléaire de la β-caténine) et à un nombre moins important de lésions de fibrose rénale sur les biopsies de greffons à 3 mois post-greffe. Enfin, les patients porteurs d’un greffon de génotype CAV1 rs4730751AA ont une perte de fonction rénale plus rapide. Ces patients semblent développer plus fréquemment des lésions de fibrose. Dans le cadre de la transplantation rénale, ces résultats suggèrent que certains SNP du donneur influencent la néphrotoxicité du Tacrolimus et que son métabolisme in situ est un élément clé dans la compréhension de la fibrogenèse du greffon.Au total, les résultats obtenus nous ont permis d’identifier des facteurs individuels de vulnérabilité à la toxicité du Tacrolimus. De telles données, utilisées comme outil prédictif d’une néphrotoxicité plus ou moins importante, aideraient à un meilleur choix de traitement immunosuppresseur. A terme, sur le plan médico-économique, notre étude pourrait permettre d’améliorer la prise en charge de la néphrotoxicité des immunosuppresseurs, et ainsi réduire les coûts de traitement liés aux pertes de greffons induites par la toxicité du Tacrolimus. / Although widely prescribed in kidney transplantation, Tacrolimus use is limited by its nephrotoxic effects. Indeed, Tacrolimus contributes to the development of renal interstitial fibrosis lesions and tubular atrophy with a large variability between patients. Among the mechanisms involved in fibrogenesis, the epithelial-mesenchymal transition (EMT) has been proposed. EMT is a dynamic process by which a polarized epithelial cell loses its epithelial markers (E-cadherin, cytokeratin, membrane β-catenin...) and acquires a mesenchymal phenotype (de novo expression of vimentin or nuclear translocation of β-catenin, secretion of extracellular matrix components). Thus, to identify molecular determinants of Tacrolimus-induced nephrotoxicity and to evaluate the contribution of EMT, several in vitro and in vivo approaches were combined.First, a model of primary culture of renal proximal tubular cells (PT cells), the main target of xenobiotics in kidney, has been developed and characterized: phenotypic stability, functional properties, expression of proximal and mesenchymal markers and transepithelial resistance. In addition, the comparison of the metabolic capacity of the healthy renal tissue samples to different cell models (HEK293, HK-2 CTP) has revealed that PT cells is the most appropriate model. Furthermore, renal cells exposure to Tacrolimus induced a modification of the cell phenotype.Moreover, the development of a murine model of Tacrolimus-induced nephrotoxicity has been performed (28 days-exposure at 1 mg/kg/day by subcutaneous implantation of Alzet® pumps or by intra-peritoneal injection). Histological and gene expression data indicated that kidney of Tacrolimus-treated mice exhibited localized expression of mesenchymal markers (vimentin) and fibrosis areas (collagen, α-SMA, miR-21).Furthermore, as the interindividual variability of Tacrolimus nephrotoxic effects is potentially associated with genetic polymorphisms (SNPs), renal transplant recipients and their corresponding graft were genotyped for (i) CYP3A5 and ABCB1 SNPs, involved in Tacrolimus cellular processing, (ii) caveolin-1 SNP, involved in fibrosis. Our results showed that two SNPs affecting the donor (CYP3A5 6986A> G and ABCB1 3435C> T) were significantly associated with a lower expression of EMT markers (vimentine de novo expression and nuclear translocation of β-catenin) together with less fibrosis lesions evaluated on renal graft biopsies performed at 3 months post-transplant. Finally, patients with a CAV1 rs4730751AA graft displayed a more severe renal function decrease. These patients also developed more frequently fibrotic lesions. In the context of renal transplantation, these results suggest that some donor SNPs modulate Tacrolimus-induced nephrotoxicity and that its in situ metabolism is a key element in the graft fibrogenesis understanding.Overall, these data allowed us to identify some molecular determinants of Tacrolimus-induced nephrotoxicity. Early identification of patients at high risk of Tacrolimus renal toxicity represents one of the most important and future challenges in kidney transplantation to tailor treatment before the development of irreversible lesions. Although preliminary, our data suggest that the genetic make-up of donors as well as the early detection of nephrotoxicity markers such as mesenchymal markers, may improve to the medical management of renal transplant patients.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le chloroacétaldéhyde (CAA), un des principaux produits du métabolisme hépatique de l'ifosfamide (IFO), est considéré comme responsable de la néphrotoxicité de ce médicament. Les mécanismes exacts de cette néphrotoxicité ne sont pas complètement élucidés. Dans la première partie de cette étude, nous avons essayé de préciser les mécanismes physiopathologiques de la toxicité du CAA sur un modèle de tranches de cortex rénal de rat, puis, dans la deuxième partie, nous avons recherché un effet anticancéreux éventuel du CAA sur des cellules de cancer du sein humain (MCF-7). La néphrotoxicité du CAA, utilisé à des concentrations proches de celles mesurées chez les patients traités par l'IFO, soit 0 - 75 µM, s'est manifestée par une chute d'ATP et du glutathion ainsi que par une inhibition du métabolisme du lactate. Certaines enzymes de la néoglucogenèse, notamment la glyceraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, ont été inhibées par le CAA. Le complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale ainsi que l'oxydation du lactate ont été également inhibées par le toxique. D'autre part, le CAA (10 et 25 µM) a inhibé la prolifération des cellules MCF-7 sans que cette inhibition soit accompagnée d'une chute d'ATP cellulaire. Le transport cellulaire et le métabolisme du glucose ainsi que certaines enzymes de la glycolyse ont été également inhibés par le CAA. Parmi celles-ci, l'hexokinase semble être l'enzyme qui catalyse l'étape limitante de la voie de la glycolyse. En conclusion, le CAA est bien impliqué dans les mécanismes de la néphrotoxicité de l'IFO, mais de plus, il pourrait, via l'inhibition de la glycolyse, contribuer à l'effet thérapeutique de l'IFO.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La transplantation hépatique est une technique chirurgicale maîtrisée, mais le devenir à long terme du greffon et de l’hôte doit encore être amélioré. L’étude pharmacogénétique des inhibiteurs de la calcineurine (CNI) devrait permettre de comprendre la variabilité de leurs effets thérapeutiques et toxiques. Dans un premier temps, nous avons réalisé une revue de la littérature concernant la pharmacogénétique des CNI en greffe d’organe et surtout hépatique en particulier les trois polymorphismes les plus impliqués dans la pharmacocinétique des CNI (CYP3A4*22, CYP3A5*3 et ABCB1 exons 12, 21, 26) et leurs éventuelles associations avec le devenir clinique du patient. L’état actuel des connaissances valide l’intérêt du génotype CYP3A5*3 pour adapter au mieux la posologie précoce de tacrolimus seulement en greffe rénale. Dans un second temps, nous avons mené une étude de cohorte rétrospective visant à étudier la pertinence et l’intérêt des génotypes du donneur et du receveur d’organe mentionnés précédemment, intervenant dans le métabolisme (CYP3A4*22, CYP3A5*3) et le transport membranaire (ABCB1 exons 12, 21 et 26) de la cyclosporine et du tacrolimus en transplantation hépatique. 170 patients avec un suivi de plus de 10 ans en moyenne ont été inclus. Les principaux résultats montrent que : l’allèle CYP3A5 *1 du receveur était associé significativement à un risque plus élevé de perte de greffon à long terme comparé à l’allèle CYP3A5 *3 ; l’allèle TT de l’exon 12 d’ABCB1 du receveur était associé à un risque moins élevé de rejet chronique ; et l’exposition à des doses élevées de CNI, la valeur initiale de la fonction rénale et l’âge du receveur étaient également indépendamment associés au risque d’altération de la fonction rénale. La caractérisation de ces marqueurs pharmacogénétiques en transplantation hépatique pourrait permettre d’adapter les traitements immunosuppresseurs pour chaque patient transplanté. D’autres voies de recherche (pharmacogénétique de la voie calcineurine, biomarqueurs précoces des lésions du greffon, ...) seront nécessaires pour identifier un profil personnalisé pour chaque greffé afin d’adapter au mieux la stratégie thérapeutique à long terme. / Liver transplantation is now a well mastered surgery with standardized procedures, but the long-term clinical outcomes of the graft and the patient remain uncertain. The pharmacogenetic study of the calcineurin inhibitors (CNI) cyclosporine and tacrolimus should help to understand the variability of their pharmacokinetics and therapeutic or side effects. In the first part of this work, we reviewed the main pharmacogenetic studies of CNI in liver transplantation, focusing on the three polymorphisms mostly involved in CNI pharmacokinetics (CYP3A4*22, CYP3A5*3 et ABCB1 exons 12, 21, 26) and their possible associations with clinical outcomes. To date, the only pharmacogenetic test consensually recommended in organ transplantation is the CYP3A5*3 variant for a better selection of the initial tacrolimus dose in kidney transplantation. The second part of this work was a retrospective cohort study in liver transplantation to investigate the influence of the above mentioned donor’s and recipient’s genotypes, involved in the metabolism (CYP3A4*22, CYP3A5*3) and the membrane transport (ABCB1 exons 12, 21 and 26) of cyclosporine and tacrolimus. 170 patients were enrolled in this study with a mean follow-up of more than ten years. Our main results are that: the recipient CYP3A5*1 allele was associated with a higher risk of graft loss than the CYP3A5*3 allele; the recipient ABCB1 exon 12 TT genotype was associated with a lower risk of chronic rejection than the CC genotype; overexposure to CNI, initial renal function and recipient age were associated with a higher risk of post-transplantation renal dysfunction. No genetic factor was associated with patient survival, acute rejection, liver function tests, recurrence of viral or other initial liver disease, or nephrotoxicity. Prospective characterization of both recipient and donor CYP3A4, CYP3A5 and ABCB1 polymorphisms could help to optimize immunosuppressive therapy for each candidate to liver transplantation. Further studies (pharmacogenetics of calcineurin pathway, early biomarkers of graft dysfunction, ...), should help to define a personalized profile for each transplant patient in order to best adapt the immunosuppressive strategy on the long term.