Un développement normal et optimal du système nerveux central durant l'embryogenèse est crucial pour l'organisation des circuits nociceptifs chez le nouveau-né. Durant le développement de l'enfant, les mécanismes impliqués dans la perception de la douleur maturent et sont influencés par l'exposition aux stress environnants. En effet, le stress peut induire un phénomène de l'analgésie liée au stress (stress induced analgesia,SIA). Ce phénomène peut impliquer les opioïdes et/ou la neurotensine (NT). D'ailleurs, il existe de nombreuses évidences que la NT endogène joue un rôle primordial dans le SIA de type naloxone-indépendant. La NT exerce ses effets analgésiques par sa liaison aux récepteurs NTS1 et NTS2. Nous proposons donc de déterminer le rôle du récepteur NTS2 dans le SIA chez le rat issu d'une colonie non stressée ainsi que chez la souris de type sauvage (WT) et la souris ayant été délétée du gène responsable de l'expression du récepteur NTS2 (KO NTS2). Nous avons évalué l'influence d'un stress sévère de type non-opioïdergique en utilisant le test de la nage en eau froide (15[degré]C) durant trois minutes, sur la modification de la perception de la douleur. Les expérimentations chez les rats mâles ont été effectuées aux jours postnataux 25 et 60 (P25 et P60). Les agonistes neurotensinergiques utilisés sont le JMV-431(30[mu]g/kg) et [bêta]-lactotensine (200[mu]g/kg), deux agonistes sélectifs du récepteur NTS2. Le NT69L (5?g/kg) a été utilisé comme agoniste spécifique des récepteurs neurotensinergiques (NTS1 et NTS2). Les agonistes neurotensinergiques ont été administrés de façon individuelle par voie intrathécale et la nage en eau froide a été effectuée 10 minutes suivant l'administration du composé en question. Les comportements douloureux ont été évalués grâce au test plantaire (Hargreaves test) 20, 30 et 40 minutes suivant l'administration du composé. Les résultats de la modification de la perception de la douleur suite à l'administration de chacun des agonistes à P25 ont révélé une augmentation du temps de retrait des pattes arrières au test plantaire au temps 20 minutes après l'injection. Les agonistes neurotensinergiques NTS2 amplifient l'effet du SIA en période infantile et cet effet est soutenu jusqu'au temps 30. Chez l'adulte (P60), les agonistes potentialisent également le SIA. Le SIA est aussi présent chez la souris. La modification de la perception de douleur a été évaluée au test plantaire et au test à la formaline (douleur tonique). Suite au stress de nage en eau froide, les souris WT étaient moins sensibles à la douleur que les souris KO NTS2 à 30 minutes. De plus, les résultats du test à la formaline ont aussi révélé, suite au stress sévère, que les souris KO NTS2 étaient plus sensibles à la douleur que les souris WT au cours de la phase inflammatoire. Afin de supporter ces résultats, nous avons récolté des échantillons de plasma pour dosage de corticostérone par radioimmunoassay (RIA). En condition basale, les souris KO NTS2 ont des concentrations plus basses que les souris WT. Les résultats ont aussi démontré des concentrations plus élevées de corticostérone en condition de stress en comparaison avec les individus non stressés. Également, on peut constater que les souris KO NTS2 stressées ont des niveaux de corticostérone plus bas que les individus de type sauvage ayant subi un stress. En utilisant une approche pharmacologique et génétique, nous avons ainsi démontré que le récepteur NTS2 était impliqué dans le SIA. Ces études ciblant le stress permettront d'améliorer notre compréhension entourant les facteurs externes pouvant influer sur le développement optimal des circuits nociceptifs au cours de l'enfance.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) font partie de la plus importante famille de récepteurs membranaires. Leur implication dans une grande majorité de processus physiologiques et pathologiques en fait une cible pharmaceutique de choix. Parmi les RCPG, nous avons déjà démontré que le récepteur de la neurotensine NTS2 joue un rôle important dans la régulation de la transmission de l'information nociceptive. Cependant, des études ont révélé que le récepteur NTS2 est principalement localisé dans des compartiments intracellulaires et est notamment stocké dans l'appareil de Golgi. Par conséquent, les processus de transport et de trafic du récepteur vers la membrane plasmique sont critiques pour son activation par des agonistes exogènes. Dans le but d'étudier les mécanismes qui conduisent à l’insertion du récepteur NTS2 à la surface cellulaire, nous avons procédé à un criblage en double hybride chez la levure pour identifier des protéines potentiellement impliquées dans la régulation du trafic de NTS2. Nous avons utilisé le fragment correspondant à la troisième boucle intracellulaire du récepteur NTS2 comme appât pour cribler une banque d'ADNc de cerveau de rat. Cet essai a permis d'identifier la sécrétogranine III (SCG3), une protéine de la voie de sécrétion régulée, comme partenaire d'interaction du récepteur NTS2. Pour mieux caractériser cette association, les protéines taguées HA-NTS2 et YFP-SCG3 ont été co-exprimées dans les cellules HEK-293 et immunoprécipitées. L'analyse par immunobuvardage de type Western a révélé la présence de bandes à 45 et 80 KDa, correspondant au récepteur HA-NTS2 et à la protéine YFP-SCG3 respectivement, démontrant l'interaction par la co-immunoprécipitation des protéines. Des études de microscopie confocale effectuées sur des cellules HEK-293 coexprimant CFP-NTS2 et YFP-SCG3, ont également montré que les deux protéines colocalisent à l’échelle subcellulaire. Des analyses de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (frT) ont été réalisées afin de confirmer l'interaction moléculaire NTS2-SCG3. Enfin, dans le but de déterminer l'impact physiologique de la régulation de l'adressage à la membrane plasmique du récepteur NTS2 par la SCG3, nous avons développé deux DsiRNA afin de réduire l'expression de SCG3. Ces DsiRNA dirigés contre SCG3 validés in vitro seront prochainement utilisés in vivo chez le rat adulte afin d'examiner leurs effets sur le rôle du récepteur NTS2 dans le contrôle de la douleur. Ainsi, nos résultats suggèrent que la SCG3 pourrait servir de protéine escorte pour NTS2 dans son adressage vers la membrane plasmique. Aussi, nos résultats renforcent l'idée que les RCPG ne sont pas seulement adressés à la surface cellulaire par la voie constitutive mais qu'ils peuvent être transportés via la voie de sécrétion régulée. Finalement, ces résultats suggèrent que l'interaction physique entre NTS2 et SCG3 pourrait affecter la fonction physiologique du récepteur NTS2, y compris son rôle dans le contrôle de la douleur.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A sont les cibles de plus de 25% des médicaments sur le marché et nombreux sont ceux impliqués dans le traitement de la douleur. Les enjeux dans les traitements de la douleur chronique est énorme puisque nombreux sont ceux qui ne répondent pas à la médication usuelle. La recherche de nouvelles avenues thérapeutiques est indispensable afin d’aider les patients dont le soulagement est limité. Le récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2) et le récepteur APJ de l’apéline sont deux RCPG qui pourraient être des cibles pour deux éventuels traitements contre la douleur. Les objectifs de cette thèse étaient de caractériser des analogues synthétiques ciblant les récepteurs NTS2 ou APJ, examiner la distribution de ces récepteurs dans le cerveau, la moelle épinière et les ganglions spinaux pour ensuite déterminer leur implication dans la régulation du contrôle descendant au niveau spinal et supraspinal dans la région bulbaire rostro-ventrale (RVM) en conditions de douleurs aiguë et tonique. Nous avons observé que l’immunoréactivité du récepteur NTS2 était distribuée dans l’axe rostrocaudal de la substance grise périaqueductal (SGPA) et dans tous les noyaux de la RVM. Les résultats sont similaires avec l’anticorps anti-APJ démontrant que ces deux récepteurs sont impliqués dans le contrôle de la douleur. Aussi, les résultats en immunohistochimie dans la moelle épinière ont illustré la présence du récepteur APJ dans les laminae superficielles. Dans les ganglions spinaux, APJ colocalise dans les neurones substance P. Les résultats aux tests comportementaux avec administration intra-RVM d’analogues modifiés neurotensinergiques ont montré une analgésie impliquée par l’activation de NTS2 dans la RVM. L’analgésie provoquée par le récepteur NTS2 serait médiée via la relâche de sérotonine au niveau de la moelle épinière en conditions de douleurs aiguë et tonique. Les résultats en douleur tonique avec les analogues Apeline-13 modifiés en position carboxy-terminale illustrent que les modifications comportant les groupements 2-naphtalenalanine (2 Nal) et de l’acide aminoisobutyrique (Aib) permettent une plus forte analgésie générale, cependant nos expériences à ce jour ne nous permettent pas de statuer sur les différentes voies de signalisation activées dans ces conditions. La modélisation moléculaire pourrait nous aider davantage afin d’explorer les différentes caractéristiques des ligands biaisés. Ces études sur la relation structure-activité, distribution et fonctions des récepteurs NTS2 et APJ dans la modulation de douleur ne sont qu’un début vers des nouveaux traitements contre la douleur.

Un cancer du sein invasif forme préférentiellement des métastases osseuses menant à des épisodes de douleur sévère. Pour soulager cette douleur chronique, le traitement de choix actuel demeure la morphine malgré ses effets secondaires induits par la prise de fortes doses. Le développement de modèles animaux de douleur osseuse cancéreuse a permis d'améliorer notre compréhension de cette physiopathologie, favorisant ainsi la découverte de traitements alternatifs. Le premier objectif de ma Thèse a donc consisté à développer un modèle animal de douleur cancéreuse mimant les douleurs induites par les métastases osseuses. Ce nouveau modèle est basé sur l'injection de cellules syngéniques du cancer du sein métastatique (E0771) au niveau du fémur de souris C57BL/6. Nous avons tout d'abord mis en évidence le caractère invasif et hormono-dépendant des E0771 in vitro et in vivo en observant l'expression de MMP9 et d'ER[alpha]. Par la suite, nous avons suivi l'impact de la croissance tumorale sur le remodelage osseux, l'évolution de la douleur et la plasticité neuronale. Dès le 11ème jour post-implantation, l'analyse par Faxitron, microtomographie et IRM révèle la présence d'une destruction de la matrice osseuse. Ce remodelage osseux progresse jusqu'au jour 18 et conduit à l'apparition de douleur chez les souris porteuses d'une tumeur osseuse. Cette douleur s'est manifestée sous forme d'allodynie mécanique, de douleur ambulatoire induite par le mouvement forcé et d'inconfort ambulatoire entre les jours 11 et 18. L'apparition de cette douleur corrèle avec une augmentation de l'activité neuronale au niveau spinal. La seconde partie de ma Thèse a consisté à examiner le potentiel analgésique d'agonistes neurotensinergiques injectés par voie intrathécale sur la douleur osseuse cancéreuse. Dans un premier temps, nous avons étudié les effets d'agonistes des récepteurs NTS1 et NTS2 sur la douleur persistante lors du test à la formaline. Nous avons ainsi pu démontrer que l'injection de 10 [micro]g/kg de PD149163 (agoniste sélectif NTS1) ou de 30 [micro]g/kg de JMV-431 (agoniste sélectif NTS2) induisait une réponse analgésique puissante. Ces mêmes analogues ont alors été testés sur des souris sauvages ou invalidées pour NTS1 ou NTS2, développant un cancer osseux métastatique. Les résultats obtenus indiquent que NTS1 et NTS2 ne semblent pas être impliqués dans la dégradation osseuse observée suite à l'injection des E0771. En revanche, l'activation de ces récepteurs réduit la douleur induite par la tumeur osseuse. Le PD149163 diminue l'allodynie mécanique, cependant ses effets secondaires locomoteurs limitent son efficacité analgésique. Pour sa part, le JMV-431 réduit l'allodynie mécanique et la douleur induite par le mouvement forcé. Les résultats obtenus avec les souris invalidées pour NTS1 ou NTS2 corrèlent avec les résultats observés avec les agonistes ou ont démontré l'implication possible de systèmes compensatoires. En conclusion, notre modèle reflète davantage la réalité clinique par l'utilisation de cellules syngéniques du cancer du sein et le récepteur NTS2 se révèle être une cible potentielle pour soulager la douleur cancéreuse osseuse.

Le travail présenté dans ce manuscrit a pour objectif la synthèse d'analogues sélectifs NTS2 de la neurotensine et l'étude de leur potentiel analgésique. La faible biodisponibilité de la neurotensine, caractérisée par sa courte durée de demi-vie et le non passage de la barrière hémato-encéphalique, est l'un des problèmes majeurs pour son activité biologique. Dans un premier temps, nous avons développé la synthèse d'aminoacides non naturels hydrophobes : la (triméthyl)silylalanine, des glycines N-substituées et des α-aminoacides insaturés, alliant la non reconnaissance par les enzymes et l'amélioration du passage des membranes. Puis, certains d'entre eux ont été incorporés à la séquence minimale active NT[8-13] afin d'évaluer leur impact sur l'affinité et/ou l'activité de ce fragment. Pour cela, nous avons synthétisé une série de peptides et pseudopeptides afin d'étudier d'une part leur affinité vers les récepteurs NTS1 et NTS2 et, pour certains d'entre eux, leur activité in vivo par des expérimentations sur le modèle de la douleur en collaboration avec l'université de Sherbrooke. Enfin, nous avons préparé une première série d'analogues de la neuromédine, agoniste des récepteurs de la NT et métabolite issu d'un précurseur commun, la pro-neurotensine. / The aim of this work concerns the synthesis of selective NTS2 neurotensin analogues as potent antinociceptive agents followed by biological activities studies. Poor bioavailability of neurotensin is one of the major obstacles for therapeutic effects. Indeed, this tridecapeptide has a short half-life time due to enzymatic degradation and is too hydrophilic to cross blood-brain barrier. First, we developed different methods to obtain hydrophobic unnatural amino acids like (trimethyl)silylalanine, N-substituted glycines and unsatured α-amino acids. All these peptide building blocks combine lipophilic properties facilitating membrane permeability and enzymatic unrecognition advantages. Some of them have been incorporated in the C-terminal active fragment NT[8-13] in order to evaluate their impact on affinity and/or biological activities. Thus, a series of new peptides and pseudopeptides was prepared and in vivo behavior was studied using a pain model designed in Sherbrooke university. Finally, we synthesized new analogues of neuromedin which is a neurotensin agonist issued from a common precursor, the pro-neurotensine.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la famille de récepteurs membranaires la plus étendue. Présentement, 30% des médicaments disponibles sur le marché agissent sur plus ou moins 4% des RCPG connus. Cela indique qu’il existe encore une multitude de RCPG à explorer, qui pourraient démontrer un potentiel thérapeutique intéressant pour des pathologies encore sans traitement disponible. La douleur chronique, qui affecte 1 canadien sur 5, fait partie de ces affections pour lesquelles les thérapies sont faiblement efficaces. Dans le but éventuel de pallier à ce problème, le projet de ce mémoire consistait à mieux comprendre les mécanismes régissant l’adressage membranaire du récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2), un RCPG dont l’activation induit des effets analgésiques puissants de type non opioïdergique. Des données du laboratoire ayant révélé une interaction entre la 3e boucle intracellulaire de NTS2 et la sécrétogranine III (SgIII), une protéine résidente de la voie de sécrétion régulée, notre objectif était de caractériser le rôle de SgIII dans la fonctionnalité du récepteur NTS2. Pour ce faire, l’interaction entre les deux protéines a d’abord été vérifiée par co-immunoprécipitation, GST pull down, essais de colocalisation subcellulaire et par FRET. Nous avons également utilisé un outil d’interférence à l’ARN (DsiRNA) pour invalider la protéine SgIII dans un modèle cellulaire neuronal et chez l’animal. Des essais de radioliaison sur le modèle cellulaire ont révélé une diminution de l’adressage de NTS2 à la membrane plasmique lorsque SgIII était supprimée. De la même façon, une invalidation de SgIII chez le rat inhibe les effets analgésiques d’un agoniste NTS2-sélectif (JMV-431), qui sont normalement observés dans le test de retrait de la queue (douleur aiguë). Nous avons cependant identifié que des stimulations au KCl, à la capsaïcine et à la neurotensine induisaient plutôt une insertion du récepteur à la membrane dans les cellules neuronales. Puisque l’interaction entre SgIII et la 3e boucle intracellulaire du récepteur NTS2 est peu probable selon un système de sécrétion classique, un modèle hypothétique de transition dans les corps multi-vésiculaires a été vérifié. Ainsi, la présence de NTS2 et de SgIII a été révélée dans des préparations exosomales de DRG F11, en plus d’une transférabilité du récepteur par le milieu extracellulaire. En somme, ces résultats démontrent la dépendance du récepteur NTS2 envers SgIII et la voie de sécrétion régulée, en plus d’identifier certains facteurs pouvant augmenter son expression à la surface cellulaire. Le projet contribue ainsi à ouvrir la voie vers des approches pour potentialiser les propriétés de NTS2 in vivo¸ en plus d’une piste d’explication concernant le trafic intracellulaire du récepteur.