O presente estudo teve como principal objetivo aprimorar os efeitos antitumorais de uma nova estratégia imunoterapêutica para controle de tumores induzidos pelo vírus do papiloma humano tipo 16 (HPV-16). Para tal finalidade foi utilizado um novo conceito de imunoterapia ativa, baseada em uma vacina de DNA recombinante, desenvolvida no Laboratório de Desenvolvimento de Vacinas da USP (pgDE7h) e diferentes abordagens experimentais delineadas com a finalidade de aumentar a eficácia terapêutica do tratamento. Desta forma, o presente trabalho focou no desenvolvimento de novos sistemas de entrega para a vacina de DNA empregando três nanocarregadores distintos, de natureza lipídica, proteica ou peptídica, e a avaliação da eficácia terapêutica desses frente a tumores pré-estabelecidos. O presente trabalho também avaliou a combinação da imunoterapia, baseada no vetor pgDE7h, com a quimioterapia, empregando o composto cisplatina, de forma a permitir o tratamento de tumores em estágios mais avançados de crescimento. Os resultados demonstram que a associação do plasmídeo vacinal com vesículas peptídicas mostrou-se capaz de ativar células dendríticas murinas in vitro e promover aumento na sobrevivência de animais frente ao modelo de tumores subcutâneos, sem induzir toxicidade. Quando combinada ao tratamento com cisplatina, a vacina, principalmente associada à eletroporação, demonstrou um efeito sinérgico, promovendo regressão total de tumores, aumento expressivo na ativação de linfócitos T CD8 E7-específicos, indução de resposta de memória efetora e memória residente e controle de populações imunossupressoras de forma sistêmica e no microambiente tumoral. Em resumo, a pesquisa ampliou os conhecimentos sobre a ação da imunoterapia ativa contra tumores induzidos por HPV e abriu perspectivas importantes para sua utilização em condições clínicas. / The present study aimed to improve the antitumor effects of a new immunotherapeutic strategy for the control of tumors induced by human papillomavirus type 16 (HPV-16). For this purpose, a new concept of active immunotherapy based on a recombinant DNA vaccine developed at the Laboratory of Vaccine Development at USP (pgDE7h) was used, and different experimental approaches were designed to increase the therapeutic efficacy of the treatment. Thus, the present work focused on the development of new delivery systems for the DNA vaccine using three distinct nanocarregadores, of a lipid, protein or peptidic nature, and the evaluation of the therapeutic efficacy of these in front of pre-established tumors. The present study also evaluated the combination of pgDE7h-based immunotherapy with chemotherapy using the cisplatin compound to allow the treatment of tumors in more advanced stages of growth. The results demonstrate that the association of the peptide-vesicle vaccine plasmid was shown to activate murine dendritic cells in vitro and promote increased survival of animals against the subcutaneous tumor model without inducing toxicity. When combined with cisplatin treatment, the vaccine, mainly associated with electroporation, demonstrated a synergistic effect, promoting total tumor regression, expressive increase in the activation of CD8 E7-specific T lymphocytes, induction of effector and resident memory response and control of immunosuppressive populations in a systemic way and in the tumor microenvironment. In summary, the research expanded knowledge about the action of active immunotherapy against HPV-induced tumors and opened important perspectives for its use under clinical conditions.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para tratamento de câncer que usa um fotossensibilizador (FS) na presença de luz e oxigênio molecular gerando espécies altamente reativas de oxigênio que levam as células tumorais à morte. Porém a hidrofobicidade de alguns FSs podem induzir a agregação em sistemas biológicos, com redução da sua atividade fotodinâmica. A incorporação de FSs em sistemas nanocarreadores pode ser uma alternativa para superar este problema. O objetivo deste trabalho foi preparar e caracterizar dois FSs hidrofóbicos (Hipericina e Tetra-carboxiftalocianinade zinco) encapsulados em nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) para um potencial uso em terapia fotodinâmica. Os FSs incorporados em nanopartículas lipídicas sólidas foram preparados utilizando a técnica de ultra-sonicação e a caracterização físico-química foi realizada. O tamanho médio das nanopartículas de hipericina e tetra-carboxiftalocianinade zinco foram de 153 e 245 nm respectivamente, índice de polidispersão de 0,28 para Hy-NLS e 0,29 para FtZnT-NLS. Uma das vantagens dos sistemas de encapsulação utilizando NLS é o alto valor de eficiência de encapsulação (EE%) e neste estudo foram obtidos valores de eficiência de encapsulação superior a 80% para a Hy-NLS e FtZnT-NLS. De modo a obter a eficiência fotodinâmica da Hy e FtZnT antes e depois do encapsulamento em NLS, as constantes de velocidade de foto-decomposição utilizando dois agentes captadores de 1O2 (1,3 Difenilisobenzofurano e ácido úrico) foram determinadas. As constantes de velocidade de foto-decomposição tiveram aumento significativo após o encapsulamento que ocorreu provavelmente devido a um aumento no tempo de vida do estado triplete causado pelo aumento da solubilidade. Hy-NLS e FtZnT-NLS apresentaram um aumento acima de 30% e 60% respectivamente na acumulação intracelular e uma melhoria na fototoxicidade correlacionado com o aumento da acumulação intracelular. Todas essas vantagens sugerem que hipericina e a tetra-carboxiftalocianinade zincoencapsuladas em nanopartículas lipídicas sólidas tem potencial para serem utilizadas em terapia fotodinâmica. / Photodynamic therapy (PDT) is a technique for treating cancer using a photosensitizer (PS) in the presence of light and molecular oxygen generating highly reactive oxygen species that lead to tumor cell death. The hydrophobicity of some photosensitizers can induce aggregation in biological systems, reducing its photodynamic activity. The incorporation of PSs in nanocarriers can be an alternative to overcome this problem. The aim of this work was to prepare and characterize two hydrophobic photosensitizers (Hypericin and Zinc tetra-carboxylicphthalocyanine) encapsulated in solid lipid nanoparticles (SLN) for potential use in photodynamic therapy. The PSs incorporated into solid lipid nanoparticles were prepared using the ultrasonication technique, and physico-chemical characterization was performed. The average size of the nanoparticles with hypericin and zinc tetra-carboxylicphthalocyanine was 153 and 245 nm respectively, the polydispersivity index of 0.28 to Hy-SLN and 0.29 to FtZnT-SLN. One of the advantages of encapsulation systems using SLN is the high value of encapsulation efficiency (EE %). In this study were obtained values of encapsulation efficiency greater than 80% for the Hy-SLN and FtZnT-SLN. In order to obtain the photodynamic efficiency of Hy and FtZnT before and after encapsulation in SLN, rate constants using photo-decomposition of two scavengers of 1O2 agents (1,3-Diphenylisobenzofuran and uric acid) were determined. The rate constants of photo-decomposition had significant increase after encapsulation which occurred probably due to an increase in the lifetime of the triplet state caused by the increased solubility. Hy-SLN and FtZnT-SLN showed an increase above 30% and 60% respectively in the intracellular accumulation and an improvement in phototoxicity correlated with increased intracellular accumulation. So, all these advantages suggest that hypericin and zinc tetra-carboxylicphthalocyanine encapsulated in solid lipid nanoparticles have potential to be used in photodynamic therapy.

A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma técnica para tratamento de câncer que usa um fotossensibilizador (FS) na presença de luz e oxigênio molecular gerando espécies altamente reativas de oxigênio que levam as células tumorais à morte. Porém a hidrofobicidade de alguns FSs podem induzir a agregação em sistemas biológicos, com redução da sua atividade fotodinâmica. A incorporação de FSs em sistemas nanocarreadores pode ser uma alternativa para superar este problema. O objetivo deste trabalho foi preparar e caracterizar dois FSs hidrofóbicos (Hipericina e Tetra-carboxiftalocianinade zinco) encapsulados em nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) para um potencial uso em terapia fotodinâmica. Os FSs incorporados em nanopartículas lipídicas sólidas foram preparados utilizando a técnica de ultra-sonicação e a caracterização físico-química foi realizada. O tamanho médio das nanopartículas de hipericina e tetra-carboxiftalocianinade zinco foram de 153 e 245 nm respectivamente, índice de polidispersão de 0,28 para Hy-NLS e 0,29 para FtZnT-NLS. Uma das vantagens dos sistemas de encapsulação utilizando NLS é o alto valor de eficiência de encapsulação (EE%) e neste estudo foram obtidos valores de eficiência de encapsulação superior a 80% para a Hy-NLS e FtZnT-NLS. De modo a obter a eficiência fotodinâmica da Hy e FtZnT antes e depois do encapsulamento em NLS, as constantes de velocidade de foto-decomposição utilizando dois agentes captadores de 1O2 (1,3 Difenilisobenzofurano e ácido úrico) foram determinadas. As constantes de velocidade de foto-decomposição tiveram aumento significativo após o encapsulamento que ocorreu provavelmente devido a um aumento no tempo de vida do estado triplete causado pelo aumento da solubilidade. Hy-NLS e FtZnT-NLS apresentaram um aumento acima de 30% e 60% respectivamente na acumulação intracelular e uma melhoria na fototoxicidade correlacionado com o aumento da acumulação intracelular. Todas essas vantagens sugerem que hipericina e a tetra-carboxiftalocianinade zincoencapsuladas em nanopartículas lipídicas sólidas tem potencial para serem utilizadas em terapia fotodinâmica. / Photodynamic therapy (PDT) is a technique for treating cancer using a photosensitizer (PS) in the presence of light and molecular oxygen generating highly reactive oxygen species that lead to tumor cell death. The hydrophobicity of some photosensitizers can induce aggregation in biological systems, reducing its photodynamic activity. The incorporation of PSs in nanocarriers can be an alternative to overcome this problem. The aim of this work was to prepare and characterize two hydrophobic photosensitizers (Hypericin and Zinc tetra-carboxylicphthalocyanine) encapsulated in solid lipid nanoparticles (SLN) for potential use in photodynamic therapy. The PSs incorporated into solid lipid nanoparticles were prepared using the ultrasonication technique, and physico-chemical characterization was performed. The average size of the nanoparticles with hypericin and zinc tetra-carboxylicphthalocyanine was 153 and 245 nm respectively, the polydispersivity index of 0.28 to Hy-SLN and 0.29 to FtZnT-SLN. One of the advantages of encapsulation systems using SLN is the high value of encapsulation efficiency (EE %). In this study were obtained values of encapsulation efficiency greater than 80% for the Hy-SLN and FtZnT-SLN. In order to obtain the photodynamic efficiency of Hy and FtZnT before and after encapsulation in SLN, rate constants using photo-decomposition of two scavengers of 1O2 agents (1,3-Diphenylisobenzofuran and uric acid) were determined. The rate constants of photo-decomposition had significant increase after encapsulation which occurred probably due to an increase in the lifetime of the triplet state caused by the increased solubility. Hy-SLN and FtZnT-SLN showed an increase above 30% and 60% respectively in the intracellular accumulation and an improvement in phototoxicity correlated with increased intracellular accumulation. So, all these advantages suggest that hypericin and zinc tetra-carboxylicphthalocyanine encapsulated in solid lipid nanoparticles have potential to be used in photodynamic therapy.