Thesis (doctoral)--Lund, 1983.

Ulm, Univ. Diss., 2006.

Kulturmodelle des respiratorischen Epithels werden zur Klärung multipler Fragestellungen, zum Beispiel der Untersuchung seltener respiratorischer Erkrankungen, wie der primären Ziliendyskinesie (PCD) herangezogen. Hierbei könnten in Zukunft Kulturmodelle integraler Bestandteil des Diagnosealgorithmus werden. Die Isolierung und Kultivierung von Primärzellen des menschlichen Respirationstrakts ist dabei wesentlich komplexer als die Nutzung etablierter Zelllinien. Jedoch ermöglicht die Verwendung der Primärzellkulturen eine exaktere Darstellung des mehrreihigen Flimmerepithels der oberen Atemwege. Die Gewinnung der Primärzellen kann mechanisch mit zusätzlichem enzymatischen Verdau, oder durch sequentielles Auswachsen der Zellen erfolgen. Angewendet werden sowohl Epithelzell-Monokulturen wie auch Cokulturen mit Fibroblasten. Die Nutzung des Air-Liquid Interface in Transwell Systemen ermöglicht in beiden Kulturen die Differenzierung zu einem Kinozilien tragenden Flimmerepithel. Hierbei ist nicht endgültig geklärt, welches Modell die in vivo Gegebenheiten besser darstellt und welche Vorteile diese haben. Außerdem liegen bislang keine Daten über die Zellstabilität und -regenerationsfähigkeit nach genotoxischer Behandlung sowie Informationen über chromosomale Veränderungen während des Zellkultivierungsprozesses über mehrere Passagen vor. Derartige Informationen sind allerdings für die Etablierung eines Kulturmodells der oberen Atemwege von essentieller Bedeutung. Das Ziel der Arbeit war die Untersuchung der DNA-Stabilität und -Regenerationsfähigkeit über drei Passagen nach genotoxischer Behandlung, vergleichend für beide Kulturmodelle sowie die Überprüfung der chromosomalen Stabilität innerhalb des Kultivierungsprozesses und der Funktionsfähigkeit beider Zellkulturen. Zu diesem Zweck wurde eine toxikologische Versuchsreihe von jeweils 10 Spendern für beide Kulturmodelle, Mono- bzw. Cokultur im Air-Liquid Interface über drei Passagen durchgeführt. Hierbei wurde die Grundschädigung, die Schädigung nach einstündiger Behandlung mit 300μl des Alkylanz Methylmethansulfonat (MMS) und nach einer 24-stündigen Regenerationszeit mit dem Comet Assay überprüft. Zur Untersuchung der chromosomalen Stabilität innerhalb des Kulturprozesses wurden parallel Chromosomenaberrationstests an unbehandelten Zellen über drei Passagen durchgeführt. Zur Überprüfung der Funktionsfähigkeit der Zellen wurde ein Interleukin-8 (IL-8) ELISA für 10 Versuchsansätze in der jeweils ersten Passage beider Kulturen verwendet. Hierbei wurde die IL-8-Konzentration im Überstand der unbehandelten Zellkulturen sowie nach 1μg/ml bzw. 10μg/ml Lipopolysaccarid(LPS)- Exposition untersucht. Für die Cokultur wurden sowohl beide Zelltypen gemeinsam als auch die Epithelzellen bzw. die Fibroblasten getrennt betrachtet. In beiden Modellen wurden zusätzlich rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahmen zur Untersuchung der ziliären Strukturen durchgeführt. Zur Überprüfung der Fibroblastenkontamination in der Monokultur wurden als einmaliger Versuchsablauf Vimentin- Färbungen über drei Passagen angewendet. Mit dem Comet Assay konnte in beiden Modellen eine gute Regeneration der DNA-Integrität nach MMS-induzierter DNA-Schädigung über alle Passagen nachgewiesen werden. Als einmaliger Versuchsansatz wurde das Enzym Methylpuringlykosylase (MPG) als Teil der Basenexzisionsreparatur nachgewiesen. Es ergaben sich Unterschiede in der Kultivierbarkeit der Zellen: die Monokultur zeigte eine gute Zellkultivierbarkeit bis zur dritten Passage. Es konnte jedoch mit der Vimentinfärbung eine Fibroblastenkontamination von Beginn an sowie eine Zunahme mit Höhe der Passage nachgewiesen werden. Es handelt sich hierbei demnach nicht um eine Reinkultur respiratorischer Epithelzellen. Die Cokultur ermöglicht getrennte Epithelzell- bzw. Fibroblastenkulturen, jedoch keine gute Kultivierbarkeit bis in höhere Passage. Methodisch konnte die prinzipielle Funktionsfähigkeit des Chromosomenaberrationstests an primären Nasenschleimhautzellen erstmals für eine große Stichprobenanzahl gezeigt werden. In den durchgeführten Chromosomenaberrationstests konnte eine gewisse Grundschädigung über alle Passagen nachgewiesen werden, jedoch sollten weitere Tests erfolgen, um diese Tendenz zu verifizieren. Die funktionelle Integrität wurde mit dem IL-8 ELISA nach LPS-Exposition sowie durch den Nachweis ziliärer Strukturen im REM exemplarisch bestätigt. Die erhobenen Daten liefern zusammengefasst wichtige Informationen über die Zellstabilität und -regenerationsfähigkeit der bislang verwendeten Kulturmodelle. Insbesondere Informationen über chromosomale Veränderungen sollten in Zukunft genauer betrachtet werden. Von großem Interesse wäre außerdem die Überprüfung derartige Zelleigenschaften in Zellkulturen von PCD erkrankten Spendern. / Cell culture models of human nasal mucosa are widely used to clarify a broad variety of scientific questions. Particularly the research of orphan disease, like Primary Ciliary Dyskinesia (PCD), may represent a possible field of application. In the future, these models may play a major role in diagnostic algorithms of PCD. The process of isolating and cultivating primary cells is way more complex than using established cell lines. However, it allows a more precise description in analogies to in vivo conditions in the human respiratory tract. Primary cells could be extracted by mechanic and enzymatic isolation or by sequential outgrow. Epithelial cells can be cultivated in monocultures or with fibroblasts in cocultures. Using air-liquid interface conditions in Transwell systems enable the differentiation to ciliated respiratory epithelium. It is not yet clarified which model represents in vivo situation in a better way and what kind of advantages they have. Data about stability and regenerative capacity after DNA-damaging treatment, as well as information about chromosomal alterations during the multi-passages cultivating process, is sparse. This information has a high importance to establish a culture model for primary cells of the respiratory epithelium. This work aimed to explore the DNA-stability and regeneration capacity over three passages after genotoxic treatment compared for both culture models. Moreover, the chromosome stability during cultivating process and the functional activity should be verified. For this purpose, a series of toxicological experiments was conducted. For both models, primary cells of 10 different donors were cultivated over three passages. The comet assay was applied to analyze the baseline DNA-damage, the damage after one hour of treatment with 300l of the alkylating agent Methylmethanesulfonate (MMS) and the residual damage after a regeneration period of 24 hours. Moreover, the chromosomal stability throughout the cultivating process was verified by using chromosomal aberration tests for the untreated cells. An Interleukin-8 (IL-8) ELISA was conducted in ten experiments of each model during the first passage to assess an efficient cellular function. Hence, we examined the concentration of IL-8 in supernatant of the untreated cell cultures, as well as after exposure with 1g/ml and 10g/ml of Lipopolysaccaride (LPS). Within the coculture, we examined both cell types jointly and separately for epithelial cells and fibroblast cells. We performed Scanning Electron Microscope (SEM) images of both models to detect kinocilia. To detect the fibroblast contamination in the monoculture, vimentin staining was performed for three passages in a single test. The results of the comet assay revealed a good regenerative capacity of DNA-integrity after MMS-induced DNA-damage in both models for all passages. The enzyme Methylpurineglykosylase (MPG), which is part of the Base excision repair (BER) could be detected in a single test. Differences were seen within the cultivability of both methods. The monoculture showed a good cultivability for all passages. However, the vimentin staining proved a contamination with fibroblasts from the very first passage. Furthermore, an increase of the fibroblast amount in the higher passages was observed. This leads to the conclusion, that the monoculture model is not a pure culture of respiratory epithelium. Instead, the coculture enables a separate culture of fibroblasts and epithelial cells. Nevertheless, the coculture showed a worse cultivability. Applicability of the chromosomal aberration test for nasal mucosa cells could be proved for the first time in a large number of samples. Although the chromosomal aberration test showed a certain baseline damage over all passages, further tests should be done to verify the tendency. Furthermore, aspects of cell functionality were evaluated. The results of the IL-8 ELISA proved the functional activity in both methods. Further, the SEM images exemplary verified kinocilia differentiation. In summary, our findings deliver important information about the stability and regenerative capacity of the used cell culture models. Especially, data of chromosomal modifications should be examined in the near future. Furthermore, it would be of great interest to examine these cell characteristics within cell cultures of PCD donors.

Diese Studie beschäftigt sich mit den toxischen Effekten von Zinkoxid Nanopartikeln (ZnO NP) auf humane Nasenschleimhautzellen. Speziell wurde eine mögliche Kumulation von DNS-Schäden und deren Reparatur analysiert. Zu diesem Zweck wurde ein dreidimensionales Kultursystem, sogenannte Miniorgankulturen, aus humaner nasaler Mukosa verwendet. Eine Charakterisierung der verwendeten Zinkoxid Nanopartikel erfolgte unter dem Transmissionselektronenmikroskop (TEM), mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) und durch eine Zetapotentialmessung. Nach einer Woche Kultivierung fand eine Exposition der MOK mit einer Zinkoxid Nanopartikel Suspension in einer Konzentration von 0,1 µg/ml und 5 µg/ml statt. Als Positivkontrolle wurde in diesem Versuch 200µM Methymethansulfonat (MMS) zugesetzt. Es erfolgten drei jeweils einstündige Inkubationsphasen, wobei nach jeder Stunde ein Teil der MOKs für den Cometassay entnommen wurde. Nach dreimaliger Exposition wurden die verbliebenen MOKs für 24 Stunden zur Regeneration in unversetztem Nährmedium belassen und dann dem Cometassay zugeführt. Ergänzend wurde ein Sandwich ELISA zur Detektion von Caspase 3 durchgeführt. Zn2+ Ionen wurden im Zellkulturmedium analysiert. Der Nachweis von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) erfolgte fluoreszenzmikroskopisch. Die DLS konnte eine durchschnittliche Partikelaggregatgröße von 354 nm nachweisen und das Zetapotential betrug -11,2 mV. Die im Cometassay festgestellten DNS-Schäden zeigten bei einer Zinkoxid Nanopartikel Konzentration von 0,1 µg/ml erst nach der Regenerationsphase von 24 Stunden einen signifikanten Anstieg, während 5 µg/ml Zinkoxid Nanopartikel zu jedem Zeitpunkt einen signifikanten Anstieg der DNS Fragmentation bewirkten. Das Ausmaß an Strangbrüchen nach 24 Stunden stieg auch hier nach 24stündiger Regenerationsphase nochmals an. 200 µM MMS induzierten ebenfalls einen signifikanten Anstieg der OTM-Werte bei einer, zwei und drei Stunden. Im Laufe der Regenerationsphase führten Reparaturmechanismen zu einem Absinken der OTM-Werte. Der Sandwich ELISA zeigte keinen signifikanten Anstieg der Caspase 3 Werte. Im Nährmedium konnte eine Zn2+ Ionenkonzentration von 2,8 µmol/ml nach einer Inkubation mit 0,1 µg/ml Zinkoxid Nanopartikeln festgestellt werden. Bei einer Inkubation mit 5 µg/ml Zinkoxid Nanopartikeln zeigte sich eine Ionenkonzentration von 52,7 µmol/ml. Intrazelluläre ROS konnte nur bei einer Exposition mit 5 µmol/ml Zinkoxid Nanopartikeln nachgewiesen werden. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass Zinkoxid Nanopartikel in den verwendeten Konzentrationen genotoxisch wirken, aber keine zytotoxische Wirkung entfalten. Die Schädigung kumuliert und schreitet während der Regenerationsphase noch fort. Eine multifaktorielle Schädigung der DNS, sowohl durch direkte Interaktion der Partikel mit dem Erbgut, als auch über entstandene ROS und Zn2+ Ionen, ist anzunehmen. / This study examines the toxic effects of zincoxide nanoparticles (ZnO NPs) in nasal mucosa cells. Especially the possible accumulation of DNA damages und their reparation was analysed. For this purpose we used mini organ cultures (MOCs) out of human nasal mucosa. The zinc oxide nanoparticles were characterized under a transmission electron microscope and by zeta potential measurement. After one week of cultivation, the MOCs were exposed to a ZnO NP suspension. The concentrations were 0,1 µg/ml and 5 µg/ml. 200µM methylmethane sulfonate (MMS) was used as positive control. The MOCs were incubated three times for one hour. After each hour some of the MOCs were analysed with the Cometassay. The last MOCs stayed for 24 hours in the cell culture medium for regeneration. A sandwiche ELISA was performed to detect Caspase 3. Zn2+ ions were analysed in the cell culture medium. To detect reactive oxygen species (ROS), the cells were analysed under a fluorescence microscope. The average particle size was 345 nm. The zeta potential was –11,mV. DNA damage was detected to ZnO-NPs at 0.1 μg/ml ZnO-NPs after a 24h lasting regeneration time. 5 µg/ml ZnO NPs damaged the DNA at every point of time. The sandwich ELISA showed no significant increase of Caspase 3 in the medium. 0,1 µg/ml ZnO NPs resulted in a Zn2+ ion concentration of 2,8 µmol/ml and 5 µg/ml in a concentration of 52,7 µmol/ml. ROS could only be detected after an incubation with 5 µg/ml ZnO NPs. Thus the results suggest that ZnO NP in these concentrations are genotoxic but not zytotoxic. The damage cumulates and is increasing throughout the regeneration time. A multifactorial damage of the DNA, through direct interaction of the particles and also through ROS and zinc ions, is to suppose.

University, Diss.--Leiden, 2005. / Zsfassung in niederl. Sprache.

Rauchen stellt in den Industrienationen das bedeutendste vermeidbare Gesundheitsrisiko dar. Die Rolle des suchtauslösenden Alkaloids Nikotin in der Tabak assoziierten Kanzerogenese wird kontrovers diskutiert. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung genotoxischer Effekte von Nikotin in Zellen des oberen und unteren Aerodigestivtrakt sowie deren intrazellulärer Mechanismen. Dazu wurden Zellen aus humaner Nasenschleimhaut und humaner Bronchialschleimhaut enzymatisch isoliert sowie bronchiales Zelllinienepithel kultiviert und mit Nikotin unterschiedlicher Dosierungen für eine Stunde inkubiert. Zur Untersuchung beteiligter Signalkaskaden wurden Koinkubationen von Nikotin und dem nicht-kompetitiven nikotinergen Acetylcholinrezeptorblocker Mecamylamin und dem Antioxidans N-Acetylcystein durchgeführt. Die Erfassung Nikotin induzierter DNASchäden erfolgte mit Hilfe des Comet Assays. Zur Untersuchungen von Zellzyklusalterationen sowie Apoptoseinhibition durch Nikotin kam die Durchflusszytometrie zum Einsatz. Die Ergebnisse der Einzelzellgelelektrophorese zeigten eine dosisabhängige DNASchädigung im einstündigen Inkubationsversuch durch Nikotin. Diese Schäden waren gewebeabhängig ab einer Konzentration von 100μM in Zelllinienepithel (n=5) und 1mM in Nasenschleimhautzellen (n=8) signifikant. In humanem Bronchialzellepithel konnte bei dem Stichprobenumfang von n=4 keine signifikante DNA-Schädigung durch die getesteten Nikotindosierungen nachgewiesen werden. Durch eine Koinkubation mit dem Antioxidans N-Acetylcystein sowie dem nicht kompetitiven nACh Rezeptorblocker Mecamylamin konnte eine im Comet Assay nachweisbare Nikotin induzierte DNA-Schädigung verhindert werden. Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Klärung einer möglichen Modulation der Apoptose durch Nikotin an bronchialem Zelllinienepithel zeigten keine signifikante Induktion oder Inhibition. Eine Beeinflussung des Zellzyklus durch Nikotin konnte in der Durchflusszytometrie nicht erfasst werden. Zusammenfassend induziert Nikotin DNA-Schäden in Epithelien des Atemtraktes. An diesem Effekt sind oxidative sowie nAch-Rezeptor abhängige Stoffwechselschritte beteiligt. Vor dem Hintergrund einer potentiellen Beteiligung von Nikotin an der Tumorinitiation und -progression muss eine Nikotinersatztherapie besonders kritisch abgewogen werden. / Tobacco smoking is the single most preventable cause of the death in the world. The role of tobacco´s main alcaloide nicotine in smoking related cancer is still unclear. Aim of this study was to investigate the genotoxicity of nicotine in epithelia of the human aerodigestive tract and the intracellular pathways which lead to DNA-damage. The genotoxicity was assessed by the comet assay. To assess cell cycle alterations and inhibition of apoptosis flow cytometry was performed. Cells of human nasal epithelia and cells of human bronchial epithelia were encymatically isolated and afterwards incubated with nicotine in different dosages for one hour. For investigation of the cellular pathways of DNA-damage cells were co-incubated with Nicotine and either N-Acetylcysteine, a known antioxidative substance, or Mecamylamine, a nAch-receptor blocking agent. Results showed a dosage dependend DNA-damage in nasal epithelia after one-hour-treatment with nicotine. Flow cytometry showed no alterations in cell cycle and no influence on apoptosis in nicotine treated cells. Coincubation of nicotine and N-Acetylcysteine or Mecamylamine reduced the nicotine induced DNA-damage significantly. Nicotine induces DNA damage in epithelia of the human aerodigestive tract. This damage is caused by oxidative effects and nAch-receptor dependend pathways.

Objective: Allergic rhinitis (AR) and chronic rhinosinusitis with nasal polyps (CRSwNP) are of high importance in otorhinolaryngology. Some of their symptoms are related to changes in the nasal trigeminal sensitivity. The aim of this study was to compare nasal trigeminal sensitivity in patients with AR, CRSwNP, and healthy controls (HC). - Methods: A total of 75 individuals participated (age 19–78 years; 34 AR, 10 CRSwNP and 31 HC). Olfactory function was determined using the extended Sniffin’ Sticks test battery. Trigeminal sensitivity was assessed with CO₂ detection thresholds.Trigeminal negative mucosal potentials (NMP) and EEG-derived event-related potentials (ERP) were recorded in response to selective olfactory (phenylethyl alcohol) and trigeminal (CO₂) stimuli using high-precision air-dilution olfactometry. - Results: In comparison to HC, AR patients had lower CO₂ thresholds, also reflected in shorter peak latencies in NMP and trigeminal ERP measurements. CRSwNP patients had a decreased sensitivity for trigeminal stimuli, also reflected in prolonged trigeminal ERP latencies, and reduced olfactory function compared to HC. - Conclusion: AR patients seemed to be more sensitive to trigeminal stimuli than CRSwNP patients. Importantly, the differences could be shown on psychophysical and electrophysiological levels. The changes in trigeminal sensitivity appear to be present already at the level of the respiratory epithelium. The differences between the two groups may depend on the specific inflammatory changes accompanying each disorder, the degree of inflammatory activity, or duration of the inflammatory disorder. However, because the sample sizes are relatively small, these results need to be confirmed in the future studies with larger groups.