Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_francine_sinnott.pdf: 966836 bytes, checksum: 31b75fbc3400564832438403aff0c6e0 (MD5) Previous issue date: 2014-02-25 / Neosporosis is a disease caused by the obligate intracellular parasite Neospora caninum, causing reproductive disorders, such abortions and sltillbirths in several animals, being considered a major cause of abortion in cattle worldwide. The serological standard diagnosis is indirect fluorescent-antibody test (IFAT), but due to morphological and antigenic similarities of N. caninum with other protozoa of the phylum Apicomplexa, such as Toxoplasma gondii and Sarcocystis spp., false positive results may occur. To improve the diagnosis of this disease and reduce cross-reactions with other coccidian, the use of specific recombinant proteins of N. caninum has been described. The Nc-p43 surface protein encoded by the gene NcSRS2 is specific of the parasite and is present in tachyzoites and bradyzoites of N. caninum. Indirect ELISA format assays have been developed for the diagnosis of neosporosis, however the blocking ELISA may present additional level of specificity. In this context, the objective of this study was develop and standardize a blocking ELISA (b-ELISA) for the diagnosis of bovine neosporosis. To this end, NcSRS2 gene, previously cloned into plasmid vector, was used to produce the recombinant protein (rNc-p43) in prokaryotic expression system Escherichia coli. The purified protein was used to produce a polyclonal antibody (pAb/rNc-p43) in rabbit and this was further purified and characterized by indirect ELISA. For the development of the b-ELISA were used a total of 152 cattle sera (71 negative and 81 positive) and 10 positive cattle sera for toxoplasmosis, all previously confirmed by IFI. As controls, a pool of all positive sera and a pool of all negative sera were used, in addition to a normal calf serum, confirmed by IFAT, used with negative reference sera. The percent inhibition for each sample was determined by comparing the optical density (OD) mean of test sera to the OD mean of negative reference sera. The cut-off value was determined as the percent inhibition of negative pool. The results suggest that the b-ELISA is a tool that can be used for diagnosis of bovine neosporosis, with a sensitivity of 98.7% and specificity of 88.7% when compared with the IFAT. Antibodies against T. gondii present in positive samples for toxoplasmosis were not able to recognize the rNc-p43. The b-ELISA showed that serum samples positive for N. caninum is able to prevent the binding of pAb/rNc-p43, enabling detect different class of antibodies in a single assay. This technique is / Neosporose é a doença causada pelo parasito intracelular obrigatório Neospora caninum, causando problemas reprodutivos, como abortos e mortalidade neonatal em diversos animais, sendo considerada uma das principais causas de abortos em bovinos em todo o mundo. O diagnóstico sorológico padrão é a imunofluorescência indireta (IFI), porém devido a semelhanças morfológicas e antigênicas de N. caninum com outros protozoários do filo Apicomplexa, como Toxoplasma gondii e Sarcocystis spp., pode ocorrer resultados falsos positivos. Para melhorar o diagnóstico desta parasitose e diminuir as reações cruzadas com outros coccídeos, à utilização de proteínas recombinantes específicas de N. caninum vem sendo descrita. A proteína de superfície Nc-p43 codificada pelo gene NcSRS2 é específica do parasito e está presente em taquizoítos e bradizoítos de N. caninum. Ensaios no formato ELISA indireto vêm sendo desenvolvidos para o diagnóstico da neosporose, no entanto os ELISAs de bloqueio podem apresentar nível adicional de especificidade. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e padronizar um ELISA no formato bloqueio (b-ELISA) para o diagnóstico da neosporose bovina. Para tal, o gene NcSRS2, previamente clonado em vetor plasmidial, foi utilizado para produzir a proteína recombinante (rNc-p43) em sistema de expressão procarioto Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada para produzir um anticorpo policlonal (pAb/rNc-p43) em coelho e este foi posteriormente purificado e caracterizado através de ELISA indireto. Para o desenvolvimento do b-ELISA foram utilizados um total de 152 soros bovinos (71 negativos e 81 positivos) e 10 soros bovinos positivos para toxoplasmose, todos previamente confirmados por IFI. Como controles, um pool de todos os soros positivos e um pool de todos os soros negativos foi utilizado, além de um soro normal de terneiro, confirmado através de IFI, utilizado como controle negativo referencial. O percentual de inibição de cada amostra foi determinado pela comparação da média da densidade óptica (DO) de cada soro teste com a média da DO do controle negativo referencial. O ponto de corte foi determinado pelo percentual de inibição do pool negativo. Os resultados obtidos sugerem que o b-ELISA é uma ferramenta que pode ser utilizada no diagnóstico da neosporose bovina, com sensibilidade de 98.7% e especificidade de 88.7%, quando comparado com a IFI. Os anticorpos contra T. gondii presentes nas amostras positivas para toxoplasmose não foram capazes de reconhecer a rNc-p43. O b-ELISA demonstrou que as amostras de soros positivas para N. caninum são capazes de impedir a ligação do pAb/rNc-p43, possibilitando a detecção de diferentes classes de anticorpos em um único ensaio. Esta técnica pode ser uma alternativa de triagem para a detecção de anticorpos contra N. caninum em populações de bovinos.

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No presente trabalho foi realizada uma revisão bibliográfica das proteínas envolvidas na interação hospedeiro-parasito utilizadas como alvos vacinais e na aplicação em testes diagnósticos devido a sua especificidade. Dentre as proteínas descritas, os antígenos de superfície Nc-p43 e Nc-p29 são amplamente estudados devido a sua especificidade e capacidade de induzer uma resposta imune protetiva, além de não apresentar reação cruzada com outros parasitos Apicomplexas quando utilizadas em ensaios diagnósticos. Frente a isso, propomos a expressão das proteínas específicas de N. caninum, Nc-p43 e Nc-p29 em sistema procarioto, para avaliar sua antigenicidade frente a soros de animais naturalmente infectados por N. caninum e especificidade quando testados frente a soros de animais infectados por T. gondii. A proteína rNc-p43 foi utilizada na produção de um anticorpo policlonal, que foi purificado, conjugado a peroxidase (HPR) e isotiocianato de fluoresceína (FITC) afim de detectar as proteínas recombinantes e nativas Nc-p43, espectivamente. pAb e pAb/HRP foram capazes de reconhecer rNcp-43, enquanto pAb/FITC se mostrou eficiente na imunomarcação do complexo apical de taquizoítos. Um ensaio imunoenzimático de bloqueio (b-ELISA) foi realizado para avaliar a performance do pAb/HRP como ferramenta de diagnóstico. A porcentagem de inibição média para as amostras de soros positivos e negativos de bovinos com neosporose obteve diferença estatística (P <0,0001). Estes resultados sugerem que o pAb pode ligar-se aos mesmos epítopos da Ncp-43 que os anticorpos anti-N. caninum de amostras positivas testadas. O b-ELISA utilizando o pAb/HRP representa uma opção interessante aos testes de diagnóstico disponíveis para a neosporose, uma vez que menos passos estão envolvidos na sua realização e seu formato evita a reatividade cruzada com anticorpos anti-espécie específicos. Em resumo, este trabalho descreve a clonagem e expressão das proteínas Nc-p43 e Nc-p29 de N. caninum em sistema procarioto, a produção de um anticorpo policlonal monoespecífico contra a proteína recombinante Nc-p43 e a avaliação de sua aplicabilidade como ferramenta no diagnóstico para neosporose. / Neospora caninum is a protozoan phylogenetically related to several coccidia with importance in veterinary medicine. This obligate intracellular parasite causes abortions in cattle and neoromuscular paralysis in dogs. Interaction ligand/receiver are required that allow the parasite explore your ability invasive, being the initial contact mediated for immunodominant surface proteins as Ncp43 and Nc-p29. The study of antigens and recombinant proteins of N. caninum have generated a serie of informations aiming the improvement of diagnosis and differentiation of this protozoan and other agents related to it, especially Toxoplasma gondii.In the present work was carried out a literature review focusing in the proteins involved in host-parasite interaction used as vaccine targets and application in diagnostic tests due to its specificity. Among the described proteins, antigens of surface Nc-p43 and Nc-p29 are widely studied due to their specifity and ability to induzer a protective immunity, and not reported cross reaction with other Apicomplexa parasite when used in trials diagnostics. Furthermore, the expression of specific proteins of N. caninum, Ncp43 and Nc-p29, in prokaryote system, are here described, followed by their evaluating concerning their antigenicity, using sera from animals naturally infected with N. caninum; and their specificity through reaction with sera from animals infected with T. gondii. The rNc-p43 protein was used for polyclonal antibody production in rabbit, purified and conjugated to peroxidase (HPR) and fluorescein isothiocyanate (FITC), in order to detect the recombinant and native Nc-p43, respectivelly. pAb and pAb/HRP were able to recognize rNc-p43, which was evaluated by Dot blot and ELISA assays, while pAb/FITC was able to mark the apical complex of tachyzoites. A blocking enzyme-linked immunosorbent assay (b-ELISA) was performed to evaluate the performance of pAb/HRP as diagnostic tool. The average percentage of inhibition for the positive sera pool and the negative sera pool of cattle neosporosis was significantly different (p <0.0001). These results suggest that pAb may bind to the same epitopes of Ncp43 and anti-N. caninum antibodies positive samples tested. b-ELISA using pAb/HRP is an interesting option for diagnostic tests that are available for neosporosis since fewer steps are involved in their implementation and their shape prevents cross-reactivity with anti-species-specific antibodies. In short, this work describes the cloning and expression of Nc-p43 and Nc-p29 proteins N. caninum in prokaryotic system, to produce a monnoespecific polyclonal antibody against the recombinant protein Nc-p43 and evaluation of its suitability as a tool in diagnosis of neosporosis.