Submitted by Priscila Nascimento (priscila.nascimento@bio.fiocruz.br) on 2016-04-11T17:27:57Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado em Oncologia - INCa Ana Emília Goulart.pdf: 3332973 bytes, checksum: abe7cedda85b0558a252f168374ab1f4 (MD5) / Approved for entry into archive by Priscila Nascimento (priscila.nascimento@bio.fiocruz.br) on 2016-04-11T17:28:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado em Oncologia - INCa Ana Emília Goulart.pdf: 3332973 bytes, checksum: abe7cedda85b0558a252f168374ab1f4 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-11T17:28:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado em Oncologia - INCa Ana Emília Goulart.pdf: 3332973 bytes, checksum: abe7cedda85b0558a252f168374ab1f4 (MD5) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Tecnológico em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Introdução: O PCA3 é um RNA não codificante (ncRNA), expresso especificamente na próstata, estando envolvido no controle da sobrevivência de células de carcinoma de próstata (CaP), através da via de sinalização do receptor de androgênio (AR). Objetivo: Investigar se diversos genes relacionados ao câncer – incluindo os envolvidos na Transição Epitelial Mesenquimal (EMT), os que apresentam potencial stemness e os co-reguladores do AR – podem estar envolvidos no processo de resposta ao silenciamento do PCA3. Além disso, objetivamos promover o silenciamento estável do PCA3 através da construção de um vetor lentiviral carreando short hairpin RNA (shRNA) específico para este ncRNA, vislumbrando estratégias terapêuticas para o CaP. Metodologia: Empregamos small interfering RNA (siRNA) ou shRNA com expressão baseada em vetores lentivirais para diminuir a expressão de PCA3 em células LNCaP e avaliar os efeitos deste silenciamento na sobrevivência destas células. Para isto, analisamos por qRT-PCR a expressão do PCA3 e de diversos genes relacionados ao câncer. Utilizamos microscopia confocal para analisar a expressão da proteína vimentina. Empregamos citometria de fluxo para verificar o percentual de células LNCaP GFP+ e, azul de tripan para avaliar o número de células viáveis, após o silenciamento estável do PCA3. Resultados: Dentre os co-reguladores do AR, ARA 70, ARA 54, Smad3 e EBP1 apresentaram expressão aumentada nas células LNCaP interferidas com siPCA3 em relação às células LNCaP interferidas com siScrbl, enquanto Smad 4 e ciclina D1 apresentaram expressão diminuída. Dentre 84 genes relacionados ao câncer, 16 apresentaram expressão alterada em células LNCaP- siPCA3 em relação ao controle. Destes, 30% codificam moléculas de transdução de sinais e fatores de transcrição. Observou-se expressão aumentada de E-caderina, Claudina-3, Citoqueratina-18, Snail, Twist e Slug em células LNCaP -siPCA3 em relação ao controle, enquanto observou-se expressão diminuída de Claudina-4, Citoqueratina-8 e Vimentina. O padrão de marcação de vimentina foi similar em células LNCaP – siPCA3 e células LNCaP – siScrbl. Não foi detectada a expressão de genes com potencial stemness nas condições testadas. Células transduzidas com vetores lentivirais carreando shPCA3 apresentaram diminuição estável da expressão do PCA3. Foi observada redução estável de cerca de 60% de células LNCaP GFP+ transduzidas com shPCA3, além de redução no número de células viáveis. Conclusão: O silenciamento do PCA3 reduz o número de células viáveis, através de um processo que envolve moléculas de transdução de sinais e fatores de transcrição que podem orquestrar a sobrevivência das células de CaP. A diminuição no número de células viáveis após a transfecção com siPCA3 parece não ser modulada pelo programa EMT clássico, embora a reversão parcial deste programa possa estar regulando a diminuição da sobrevivência celular induzida por siPCA3. A desregulação da expressão de coreguladores do AR observada pode estar envolvida na inibição da expressão dos genes alvo do AR. Nossos dados sugerem que este ncRNA desempenha papel regulador na transcrição gênica, sendo capaz de modular a expressão de genes de diversas vias de sinalização relacionadas ao câncer. Nossos resultados sugerem ainda que a redução estável do PCA3 apresenta potencial aplicação em estratégia terapêuticas que visem modular negativamente a sobrevivência das células de CaP. / Introduction: PCA3 is a prostate specific non coding RNA (ncRNA), involved in the control of prostate cancer (PCa) cell survival, through modulating androgen receptor (AR) signaling. Objective: In order to better characterize the molecular mechanisms by which PCA3 is controlling LNCaP cell survival, we aimed to investigate whether several cancer related genes, including those involved in epithelial-mesenchymal transition (EMT), stemness potential and AR co-regulators could be involved in this process in response to PCA3 downregulation. Moreover, we aimed to promote PCA3 stable silencing through a lentiviral vector containing a PCA3 short hairpin RNA (shRNA) specific sequence. Methodology: We used small interfering RNA (siRNA) or lentivirus vectorbased shRNA to downregulate PCA3 expression and evaluate the effects of this ncRNA knockdown on LNCaP cell survival. After PCA3 downregulation, cells were analyzed by qRT-PCR to investigate PCA3 and several cancer related genes expression. Confocal microscopy was performed to analyze vimentin expression. Flow cytometry was performed to analyze the percentage of LNCaP GFP positive cells and trypan blue staining to analyse the number of viable cells after PCA3 stable silencing. Results: Among AR co-regulators genes investigated, ARA70, ARA54, Smad 3 and EBP1 were upregulated in siPCA3- transfected cells in relation to scramble sequence LNCaP transfected cells, while Smad 4 and cyclin D1 were downregulated. We found that among 84 cancer-related genes tested, 16 were differentially expressed in LNCaP siPCA3-transfected cells when compared to transfected cells with a scramble sequence. Of these, 30% are genes coding for signal transduction molecules and transcription factors. Gene expression profile of EMT-related genes revealed that E-cadherin, Claudin-3, Cytokeratin-18, Snail, Twist and Slug are upregulated in LNCaP siPCA3-transfected cells compared to control, while Claudin-4, Cytokeratin-8 and Vimentin are downregulated. Vimentin expression staining patterns were similar between LNCaP siPCA3-transfect cells and control. Expression of stemness markers were not detected in these tested conditions. LNCaP cells transduced with lentiviral vectors carrying the GFP gene and shPCA3 stably dowregulated PCA3 expression, producing a reduction of 60% of LNCaP GFP+ cells compared to shScrbl transduced or non-transduced LNCaP cells. In addition, the number of viable cells was reduced after PCA3 stable silencing. Conclusion: PCA3 downregulation by RNAi leads to a loss of viability, through a process that involves key signal transduction molecules and transcription factors that could orchestrate PCa cells survival. Our results also suggested that the decrease in the number of LNCaP viable cells, observed after siPCA3 transfection, seems to don´t be modulated by the classical EMT program, although a partial reversion of this program could regulate the reduction of cell survival induced by siPCA3. Observed deregulated expression of AR co-regulators could be involved in the inhibition of the AR target genes expression. Our data suggest that that this ncRNA perform a regulatory role in gene expression, being able to modulate gene expression of several signaling pathways related to cancer. Moreover, our results suggest that the stable downregulation of PCA3 expression shows potential as a PCa therapeutic approach by negatively modulation cell survival.