Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Kathryn Cardim Araujo (kathryn.cardim@gmail.com) on 2009-10-29T09:47:08Z No. of bitstreams: 1 2006_Ana Paula Ferreira Leite.pdf: 1615018 bytes, checksum: a155875e60053bb996f379b5a54f45e0 (MD5) / Approved for entry into archive by Tania Milca Carvalho Malheiros(tania@bce.unb.br) on 2009-10-30T12:15:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2006_Ana Paula Ferreira Leite.pdf: 1615018 bytes, checksum: a155875e60053bb996f379b5a54f45e0 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-10-30T12:15:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006_Ana Paula Ferreira Leite.pdf: 1615018 bytes, checksum: a155875e60053bb996f379b5a54f45e0 (MD5) Previous issue date: 2006-03-31 / A possibilidade de expressão de proteínas constituintes das sedas de aranhas em larga escala com a cinética desejada usando sistemas heterólogos, pode permitir sua aplicação em vários produtos médicos como curativos e microfilamentos de suturas para neurocirurgias. Neste contexto, foi construída uma biblioteca de cDNA da glândula da seda da aranha Nephilengys cruentata, onde foram encontrados, além dos genes estruturais da seda, outros ainda não descritos. Dentre estes, a predição da estrutura primária da seqüência codificante do clone H09, denominada proteína H09, apresentou identidade com uma esfingomielinase-D, principal responsável pelo loxoscelismo, condição clinica produzida por venenos provenientes de aranhas do gênero Loxosceles sp. O objetivo deste trabalho foi o estudo comparativo, filogenético e da expressão da seqüência codificante referente ao clone H09. A transcrição do mRNA correspondente ao clone H09 foi confirmada por meio de Northern Blot e RT-PCR havendo hibridização e amplificação somente para transcritos da glândula da seda de Nephilengys cruentata. De acordo com a análise filogenética, a proteína H09 apresentou um nível de similaridade de 29 a 35% com dez esfingomielinases descritas em Loxosceles sp. Utilizando análise tridimencional comparativa com o mesmo grupo de esfingomielinases e algumas defensinas do banco de dados Swiss-Prot, foi feita a predição da função da proteína H09, que se posicionou entre ambos os grupos indicando uma possível função de defesa. Para obtenção de grande quantidade de proteína H09, a seqüência codificante foi clonada no vetor de expressão pET21a e utilizadas três cepas de E. coli, Origami, PLYSs, que é própria para expressão de gene tóxicos e PRIL que possui copias adicionais de codons raros em E. coli. Estas linhagens foram transformadas na tentativa de expressar a proteína recombinante. Diversos parâmetros como tempo de indução, concentração de IPTG, temperatura de incubação, rotação e meio de cultura foram também testados na otimização do protocolo de expressão. Em nenhuma das condições avaliadas foi detectada a produção de H09 por meio de Western Blot. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The possibility to produce spider silk proteins in large scale and desirable function utilizing heterologous expression systems, will allow its application in different areas of medicine such as microfilaments for neurosurgeries. On these perspectives, a cDNA library from silk glands of Nephylengys cruentata was generated and have allowed the identification of silk-protein-encoding the structural sequences and novel genes still not described. The prediction of the primary structure codifying the clone H09, denominated protein H09, have presented identity with a sphingomyelinase-D, responsible for the disease called Loxocelism, a clinical condition produced by the venom derived from spider of the genus Loxoceles sp. The aim of this work was the comparative phylogenetic study and expression of the codifying sequence of the clone H09. To confirm the transcription of the mRNA related to the H09 clone, a northern blot and a RT-PCR were conducted comparing the silk glands transcripts from the N. cruentata venom. The results have shown that there was hybridization and amplification only in the first one. The phylogenetic analysis of the protein H09 have shown high similarity related with ten sphingomyelinase previously described. The function prediction of the clone H09 was conducted through a tri-dimensional comparative analysis with the same sphingomyelinase group and a few defensins. The results have shown an intermediate position of the clone H09 related to the other proteins. To obtain a large quantity of the protein H09, the codifying sequence was cloned in the vector pET21 and the three strains of E. coli were transformed in order to express the recombinant protein. Several parameters were evaluated such as induction, concentration of IPTG, temperature, shaker speed and culture medium in order to optimize the expression protocol. Among the utilized strains, PLISs is appropriated to express toxic proteins and PRIL carries additional copies of rare codon in E. coli. Among all the evaluated conditions there was no detection of the H09 protein utilizing “Western blot”.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Raquel Viana (tempestade_b@hotmail.com) on 2009-11-05T18:08:18Z No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2009-11-10T13:22:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) / Made available in DSpace on 2009-11-10T13:22:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2008betuliademoraissouto.pdf: 2890430 bytes, checksum: 567ba1f351800aa293b7ae5a1a034f2b (MD5) Previous issue date: 2008-03 / Sedas são compostos protéicos secretadas por glândulas especializadas encontradas em diferentes grupos de artrópodes. Aranhas produzem uma diversidade de fibras, que são predominantemente compostas por proteínas repetitivas (espidroínas), codificadas por uma família multigênica. A caracterização dessa família está focada em espidroínas sintetizadas por espécies de Araneomorphae (aranhas verdadeiras), enquanto poucas seqüências de Mygalomorphae (tarântulas) são conhecidas. Sedas formam uma família diversa de materiais naturais com extraordinárias propriedades mecânicas, como resistência e extensibilidade, além da biocompatibilidade demonstrada. A possibilidade de produzir novos biomateriais com propriedades similares às das espidroínas levou à inúmeros estudos dessas proteínas. Apesar das potenciais características mecânicas, a inabilidade de domesticar as aranhas para produzir quantidades suficientes de proteínas conduziu ao desenvolvimento de estratégias alternativas para a produção das sedas utilizando a tecnologia do DNA recombinante. Proteínas com resistência e elasticidade definidas podem ser produzidas utilizando engenharia genética de maneira a misturar os módulos repetitivos em proporções específicas, produzindo biomateriais com grande potencial para uso na medicina e engenharia. Este trabalho envolve a expressão recombinante de seda de aranhas em Escherichia coli, por meio da manipulação genética de genes isolados das glândulas produtoras de seda das espécies Nephilengys cruentata (Araneomorphae) e Avicularia juruensis (Mygalomorphae). A proteína AJSilk Gland Protein – 1 de A. juruensis identificada neste trabalho pode ajudar no melhor entendimento da diversidade e evolução da família de genes das espidroínas. Além disso, genes sintéticos foram construídos para codificar um análogo à Flag-like de N. cruentata. Esses genes artificiais foram obtidos por meio de uma estratégia controlada, usada para proteínas repetitivas compostas por diferentes unidades repetitivas in tandem. Resultados de análises por SDS-PAGE e “Western blot” e a purificação (em coluna de afinidade) demonstraram que as proteínas Flag recombinantes foram expressas com sucesso em microorganismos. __________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Silks are protein compounds secreted by specialized glands, and are found in different groups of arthropods. Spiders can produce a number of silk fibers (spidroins) that are predominately composed of repetitive amino acid modules encoded by a multigenic family. The characterization of this multigenic family has focused on spidroins synthesized by Araneomorphae species (true spiders), whereas only a few sequences are known from the Mygalomorphae species (tarantulas). Silks represent a diverse family of natural materials with extraordinary mechanical properties such as high tensile strength and extensibility, as well as a great biocompatibility. The possibility of producing new biomaterials properties similar to spidroins motivated this research. Despite their superior mechanical characteristics, the inability of domesticating spiders to produce enough protein for industrial applications had lead to alternative strategies for silk production, mainly through the recombinant DNA technology. By using genetic engineering aproaches to mix the conserved and repetitive modules in specific proportions, proteins with defined strength and elasticity can be designed, and they may have many potential medical and engineering uses. This work involves the recombinant expression of spider silk proteins in Escherichia coli through the manipulation of silk genes isolated from glands of the Brazilian species Nephilengys cruentata (Araneomorphae) and Avicularia juruensis (Mygalomorphae). The protein AJSilk Gland Protein – 1 from A. juruensis was identified in this work and could enlighten some diversity and evolution issues of the spidroin multigenic family. In addition, synthetic genes were designed to encode analogs of the N. cruentata Flag-like gene. These artificial genes were constructed by using a controlled strategy to generate repetitive proteins composed of tandem different repeat units. The results of SDS-PAGE, Western blot analysis and the purification (using a affinity column) of the spider flagelliform recombinant proteins demonstrated that the strategy was successfully conducted to produce these spider proteins in microorganisms.