A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por um declínio cognitivo global, incluindo uma perda progressiva de memória, orientação e raciocínio, associada com a degeneração especifica de neurônios colinérgicos. As alterações histopatológicas que definem a DA são protéicos de β-amilóide e tau hiperfosforilada em placas senis e emaranhados neurofibrilares, respectivamente. Porém, os mecanismos moleculares que levam a DA não estão bem caracterizados e ainda não há nenhum tratamento eficaz para prevenir ou reverter os seus sintomas. Parte dessa dificuldade se deve à escassez de modelos experimentais adequados. Previamente nosso grupo estabeleceu condições experimentais para a diferenciação do neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios dopaminérgicos a partir da adição de ácido retinóico (AR). Alguns estudos sugerem que esta linhagem, quando tratada com AR e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), apresenta uma mudança para um fenótipo colinérgico. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo caracterizar a diferenciação colinérgica desta linhagem e estabelecer as melhores condições de tratamento com ácido ocadáico (AO), que promove a hiperfosforilação e deposição da proteína tau, em combinação com oligômeros solúveis de β-amilóide (Aβ1-42), para uso como modelo in vitro ao estudo da DA. As células proliferativas foram cultivadas em meio DMEM/F12 com 10% de soro fetal ( FB). A diferenciação foi induzida com 10μM de AR em meio a cultura com 1% de SFB durante sete dias, sendo o BDNF (10 nM) acrescentado a partir do quarto dia. Determinamos a atividade da Acetilcolinesterase (AChE), da Colina Acetiltransferase (ChAT) e o imunoconteúdo de ChAT como marcadores colinérgicos. O co-tratamento com BDNF resultou em células com notável morfologia neuronal, apresentando aumento na densidade e comprimento de neuritos e nos marcadores colinérgicos. Após o estabelecimento do modelo colinérgico, as células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y foram desafiadas com uma curva de dose das neurotoxinas Aβ1-42 ou AO, e a neurotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) em combinação com a densidade de neuritos. A partir desses resultados, doses subletais das toxinas foram selecionadas para estabelecer o modelo in vitro da Doença de Alzheimer. Esses resultados fazem dessa linhagem celular uma ferramenta útil no campo da neurociência, podendo torná-la um modelo adequado para o estudo da Doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a global cognitive decline, including progressive loss of memory, orientation and reasoning associated with a specific degeneration of cholinergic neurons. Histopathological changes that define AD are amyloid-β hyperphosphorylated tau deposits in senile plaques and neurofibrillary tangles, respectively. However, the leading molecular mechanisms are not well elucidated and still there is no effective treatment to prevent or reverse the symptoms. Part of this difficulty is due to the lack of suitable experimental models. Our group previously established experimental conditions for the differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into dopaminergic neurons-like with retinoic acid (RA) addition. Some studies suggested that when treated with RA and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) this cell line has a shift to a cholinergic like phenotype. Thus, this study aims to characterize the cholinergic differentiation of SH-SY5Y cell line and to determine the best conditions for okadaic acid (OA) treatment, which promotes the deposition and hyperphosphorylation of tau protein, in combination with solubleoligomers of β- myl (Aβ - 42). Thereby we established a suitable AD in vitro model. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained in DMEM / F12 medium with 10% fetal bovine serum (FBS). Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 7 days, BDNF was added on 4th day. We determined Acetylcholinesterase (AChE) and Choline Acetyltransferase (ChAT) enzymatic activities and the ChAT immunocontent as cholinergic markers. Once the cholinergic like in vitro model was established, the differentiated SH- Y5Y cells were challeng with of Aβ -42 or AO dose curve, and neurotoxicity was evaluated by an 3-(4,5-dimethylthiazol-2il)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay in combination with neurite density. Hence, sublethal doses of neurotoxins were selected to determine the in vitro model of Alzheimer's disease. Taken together, these results suggested SH-SY5Y cell line as a useful and suitable model in Alzheimer's disease research.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por um declínio cognitivo global, incluindo uma perda progressiva de memória, orientação e raciocínio, associada com a degeneração especifica de neurônios colinérgicos. As alterações histopatológicas que definem a DA são protéicos de β-amilóide e tau hiperfosforilada em placas senis e emaranhados neurofibrilares, respectivamente. Porém, os mecanismos moleculares que levam a DA não estão bem caracterizados e ainda não há nenhum tratamento eficaz para prevenir ou reverter os seus sintomas. Parte dessa dificuldade se deve à escassez de modelos experimentais adequados. Previamente nosso grupo estabeleceu condições experimentais para a diferenciação do neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios dopaminérgicos a partir da adição de ácido retinóico (AR). Alguns estudos sugerem que esta linhagem, quando tratada com AR e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), apresenta uma mudança para um fenótipo colinérgico. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo caracterizar a diferenciação colinérgica desta linhagem e estabelecer as melhores condições de tratamento com ácido ocadáico (AO), que promove a hiperfosforilação e deposição da proteína tau, em combinação com oligômeros solúveis de β-amilóide (Aβ1-42), para uso como modelo in vitro ao estudo da DA. As células proliferativas foram cultivadas em meio DMEM/F12 com 10% de soro fetal ( FB). A diferenciação foi induzida com 10μM de AR em meio a cultura com 1% de SFB durante sete dias, sendo o BDNF (10 nM) acrescentado a partir do quarto dia. Determinamos a atividade da Acetilcolinesterase (AChE), da Colina Acetiltransferase (ChAT) e o imunoconteúdo de ChAT como marcadores colinérgicos. O co-tratamento com BDNF resultou em células com notável morfologia neuronal, apresentando aumento na densidade e comprimento de neuritos e nos marcadores colinérgicos. Após o estabelecimento do modelo colinérgico, as células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y foram desafiadas com uma curva de dose das neurotoxinas Aβ1-42 ou AO, e a neurotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) em combinação com a densidade de neuritos. A partir desses resultados, doses subletais das toxinas foram selecionadas para estabelecer o modelo in vitro da Doença de Alzheimer. Esses resultados fazem dessa linhagem celular uma ferramenta útil no campo da neurociência, podendo torná-la um modelo adequado para o estudo da Doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a global cognitive decline, including progressive loss of memory, orientation and reasoning associated with a specific degeneration of cholinergic neurons. Histopathological changes that define AD are amyloid-β hyperphosphorylated tau deposits in senile plaques and neurofibrillary tangles, respectively. However, the leading molecular mechanisms are not well elucidated and still there is no effective treatment to prevent or reverse the symptoms. Part of this difficulty is due to the lack of suitable experimental models. Our group previously established experimental conditions for the differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into dopaminergic neurons-like with retinoic acid (RA) addition. Some studies suggested that when treated with RA and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) this cell line has a shift to a cholinergic like phenotype. Thus, this study aims to characterize the cholinergic differentiation of SH-SY5Y cell line and to determine the best conditions for okadaic acid (OA) treatment, which promotes the deposition and hyperphosphorylation of tau protein, in combination with solubleoligomers of β- myl (Aβ - 42). Thereby we established a suitable AD in vitro model. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained in DMEM / F12 medium with 10% fetal bovine serum (FBS). Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 7 days, BDNF was added on 4th day. We determined Acetylcholinesterase (AChE) and Choline Acetyltransferase (ChAT) enzymatic activities and the ChAT immunocontent as cholinergic markers. Once the cholinergic like in vitro model was established, the differentiated SH- Y5Y cells were challeng with of Aβ -42 or AO dose curve, and neurotoxicity was evaluated by an 3-(4,5-dimethylthiazol-2il)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay in combination with neurite density. Hence, sublethal doses of neurotoxins were selected to determine the in vitro model of Alzheimer's disease. Taken together, these results suggested SH-SY5Y cell line as a useful and suitable model in Alzheimer's disease research.

A Doença de Alzheimer (DA) é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por um declínio cognitivo global, incluindo uma perda progressiva de memória, orientação e raciocínio, associada com a degeneração especifica de neurônios colinérgicos. As alterações histopatológicas que definem a DA são protéicos de β-amilóide e tau hiperfosforilada em placas senis e emaranhados neurofibrilares, respectivamente. Porém, os mecanismos moleculares que levam a DA não estão bem caracterizados e ainda não há nenhum tratamento eficaz para prevenir ou reverter os seus sintomas. Parte dessa dificuldade se deve à escassez de modelos experimentais adequados. Previamente nosso grupo estabeleceu condições experimentais para a diferenciação do neuroblastoma humano SH-SY5Y em neurônios dopaminérgicos a partir da adição de ácido retinóico (AR). Alguns estudos sugerem que esta linhagem, quando tratada com AR e fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), apresenta uma mudança para um fenótipo colinérgico. Dessa forma, este trabalho tem por objetivo caracterizar a diferenciação colinérgica desta linhagem e estabelecer as melhores condições de tratamento com ácido ocadáico (AO), que promove a hiperfosforilação e deposição da proteína tau, em combinação com oligômeros solúveis de β-amilóide (Aβ1-42), para uso como modelo in vitro ao estudo da DA. As células proliferativas foram cultivadas em meio DMEM/F12 com 10% de soro fetal ( FB). A diferenciação foi induzida com 10μM de AR em meio a cultura com 1% de SFB durante sete dias, sendo o BDNF (10 nM) acrescentado a partir do quarto dia. Determinamos a atividade da Acetilcolinesterase (AChE), da Colina Acetiltransferase (ChAT) e o imunoconteúdo de ChAT como marcadores colinérgicos. O co-tratamento com BDNF resultou em células com notável morfologia neuronal, apresentando aumento na densidade e comprimento de neuritos e nos marcadores colinérgicos. Após o estabelecimento do modelo colinérgico, as células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y foram desafiadas com uma curva de dose das neurotoxinas Aβ1-42 ou AO, e a neurotoxicidade foi avaliada pelo ensaio do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2il)-2,5-difeniltetrazolium (MTT) em combinação com a densidade de neuritos. A partir desses resultados, doses subletais das toxinas foram selecionadas para estabelecer o modelo in vitro da Doença de Alzheimer. Esses resultados fazem dessa linhagem celular uma ferramenta útil no campo da neurociência, podendo torná-la um modelo adequado para o estudo da Doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a global cognitive decline, including progressive loss of memory, orientation and reasoning associated with a specific degeneration of cholinergic neurons. Histopathological changes that define AD are amyloid-β hyperphosphorylated tau deposits in senile plaques and neurofibrillary tangles, respectively. However, the leading molecular mechanisms are not well elucidated and still there is no effective treatment to prevent or reverse the symptoms. Part of this difficulty is due to the lack of suitable experimental models. Our group previously established experimental conditions for the differentiation of human neuroblastoma SH-SY5Y cells into dopaminergic neurons-like with retinoic acid (RA) addition. Some studies suggested that when treated with RA and brain-derived neurotrophic factor (BDNF) this cell line has a shift to a cholinergic like phenotype. Thus, this study aims to characterize the cholinergic differentiation of SH-SY5Y cell line and to determine the best conditions for okadaic acid (OA) treatment, which promotes the deposition and hyperphosphorylation of tau protein, in combination with solubleoligomers of β- myl (Aβ - 42). Thereby we established a suitable AD in vitro model. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained in DMEM / F12 medium with 10% fetal bovine serum (FBS). Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 7 days, BDNF was added on 4th day. We determined Acetylcholinesterase (AChE) and Choline Acetyltransferase (ChAT) enzymatic activities and the ChAT immunocontent as cholinergic markers. Once the cholinergic like in vitro model was established, the differentiated SH- Y5Y cells were challeng with of Aβ -42 or AO dose curve, and neurotoxicity was evaluated by an 3-(4,5-dimethylthiazol-2il)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay in combination with neurite density. Hence, sublethal doses of neurotoxins were selected to determine the in vitro model of Alzheimer's disease. Taken together, these results suggested SH-SY5Y cell line as a useful and suitable model in Alzheimer's disease research.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) faz parte da etiologia de diversas patologias neurológicas e é causa de graves sequelas. Os mecanismos patofisiológicos dessa lesão começam com o insulto imediato após a HI e se estendem por dias ou semanas, pelo aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio associada a redução da defesas anti-oxidantes e reação glial, sendo a lesão secundária parte crucial no processo que culmina no dano final. A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) que parece ter uma importante ação neuroprotetora após a HI. A acetilcolinaesterase (AChE) é responsável pela degradação da ACh, inibidores dessa enzima vêm sendo utilizados para o tratamento de danos neurológicos. Sua ação positiva sobre a HI foi demonstrada em estudos realizados em nosso laboratório, onde a administração do extrato de Huperzia quadrifariata (inibidor de AChE) reduziu os déficits cognitivos e histológicos causados por essa lesão Para avaliar os efeitos das administrações pré e pós-hipóxia de galantamina, inibidor da AChE, no modelo de HI perinatal, ratos Wistar no 7º dia de vida pós-natal (DPN7) foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) durante 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de galantamina nos grupos HI+Galantamina 5 mg/kg pré-hipóxia (HIG5-Pré), HI+Galantamina 10 mg/kg pré-hipóxia (HIG10-Pré), HI+Galantamina 5 mg/kg pós-hipóxia (HIG5-Pós) e HI+Galantamina 10 mg/kg pós-hipóxia (HIG10-Pós). Os grupos Pré receberam galantamina imediatamente antes da hipóxia e os grupos Pós nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia. No DPN45 foi feita a análise do volume das estruturas encefálicas que demonstrou a redução do volume do hipocampo do grupo HIS em relação ao Sham e uma prevenção desse efeito no grupo HIG10-Pré, mas não nos demais grupos. Análises bioquímicas foram feitas no hipocampo ipsilesional 24 horas após a lesão e revelaram: através da citometria de fluxo uma redução na sobrevivência de neurônios no grupo HIS em relação ao Sham que foi prevenida no grupo HIG10-Pré; através de ELISA uma hipertrofia dos astrócitos no grupo HIS que foi revertida no grupo HIG10-Pré e um aumento na atividade da enzima anti-oxidante catalase. O tratamento pré-hipóxia com galantamina foi capaz de prevenir os déficits histológicos, aumentar a sobrevivência celular, reduzir a reação astrocitária e aumentar a atividade anti-oxidante em ratos submetidos à HI. / Neonatal hypoxia ischemia (HI) has a role in etiology of several neurological pathologies and causes severe sequelae. The pathophysiological mechanisms of this lesion start immediately after HI and last for days or weeks, with the secondary injury being a crucial part the process that culminates in the final damage. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter of the central nervous system that seems to have an important neuroprotective action after HI. Acetylcholinesterase (AChE) degradates ACh and inhibitors of this enzyme have been used to treat neurological damage. Its positive action on HI has been demonstrated in studies performed in our laboratory, where the administration of the alkaloid extract of Huperzia quadrifariata (An inhibitor of AChE) reduced the cognitive and histological deficits caused by this lesion. To evaluate the effects of the pre and post-hypoxia administrations of galantamine, a cholinesterase inhibitor, in the model oh perinatal HI, Wistar rats in the post-natal day 7 (PND7) were subjected to a combination of unilateral occlusion of the right charotid artery and of exposure to a hypoxic exposure (8% O2) for 60 minutes. Intraperitoneal injections of saline in the groups Sham anf HI+Saline (HIS) and of galantamine in the groups HI+Galantamine 5 mg/kg pre-hypoxia (HIG5-Pre), HI+Galantamine 10 mg/kg pre-hypoxia (HIG10-Pre), HI+Galantamine 5 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post) and HI+Galantamine 10 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post). The Pre groups received galantamine immediately before hypoxia and the Post groups in the intervals of 1, 24, 48 and 72 hours after HI. On PND45 the analysis of the volume of brain structures showed a reduction of the volume of the ipsilesional hippocampus in the HIS group when compared to the sham and a prevention of this effect in the HIG10-Pre, but not in any other group. Biochemical analysis was performed in the ipsilesional hippocampus 24 hours after the lesion and revealed: a reduction of the number of surviving neurons in the HIS group when compared to the Sham that was prevented in the HIG10-Pre; a hypertrophy of the astrocytes in the HIS group that was prevented in the HIG10-Pre group and an increase in the activity of the anti-oxidant enzyme catalase in the HIG10-Pre group. The treatment with galantamine was able to prevent the histological deficits, increase the survival of neurons, reduce astrocytic reaction and increase the anti-oxidant activity in rats submitted to HI.

O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por prejuízos na comunicação e interação social, assim como por comportamentos repetitivos. O TEA pode apresentar diversas comorbidades, como alterações gastrointestinais – incluindo constipação crônica, refluxo gastroesofageal, doença celíaca e cólicas intestinais. A etiologia do TEA ainda é desconhecida, mas pode envolver alterações genéticas e a fatores de risco ambientais durante a gestação, como a exposição ao ácido valproico (VPA). Dessa forma, a exposição embrionária ao VPA tornou-se uma ferramenta confiável para a indução de alterações do tipo autista em roedores. O presente estudo teve como objetivo avaliar alterações no sistema nervoso entérico (SNE) de animais expostos ao VPA durante a gestação. Para isso, ratas Wistar prenhes receberam uma única dose (injeção intraperitoneal) de 600 mg/kg de VPA ou solução fisiológica (salina) no dia embrionário 12,5 (E12,5). A prole de machos, com 30 dias de vida pós-natal, sofreu eutanásia e então removeu-se o íleo, que passou por delaminação. No plexo mioentérico ileal foram avaliados por imunofluorescência, neurônios totais (HuC/D+), neurônios excitatórios (ChAT+), neurônios inibitórios (NOS+) e células gliais (GFAP+). A análise apresentou menor densidade neuronal nos gânglios mioentéricos ileais no grupo VPA (p<0,05); área ganglionar semelhante; mesmo perfil de densidade e corpo celular para neurônios inibitórios; menor densidade de neurônios excitatórios com maior área do corpo celular (p<0,05) e aumento no número de células gliais em 2,3 vezes (p<0,001). Dessa forma, os resultados do trabalho mostram importantes alterações neurogliais no plexo mioentérico ileal mediadas pela exposição pré-natal ao VPA, abrindo novos caminhos ao entendimento da fisiopatologia do TEA. / Autism Spectrum Disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized by social interaction and communication deficits and repetitive behavior. The ASD may present several comorbidities, as gastrointestinal alterations – including chronic constipation, gastroesophageal reflux, celiac disease and intestinal cramps. The ASD etiology might be related togenetic alteration and environmental risk factors during pregnancy, as exposure to valproic acid (VPA), which became a reliable tool for induce autism-like alterations in rodents. The present study aimed to evaluate alterations in enteric nervous system (ENS) in an animal model of ASD prenatally exposed to VPA. Pregnant Wistar females received a single intraperitoneal injection of 600 mg/kg VPA or physiological saline (Control) on embryonic day 12.5 (E12.5). The 30 days old male offspring were euthanized by perfusion, and the ileum was removed and delaminated, followed by ileal myenteric ganglia (IMG) evaluation of total neurons (HuC/D+); excitatory neurons(ChAT+); inhibitory neurons(NOS+) and glial cells (GFAP+).The results showed less total neuronal density (p<0.05); no difference in ganglionic area; no difference in the inhibitory neurons population (density and body area); decreased neuronal density and increased body area of excitatory neurons (p<0.05) and 2.3 times increased in the number of glial cells (p<0.001). In conclusion, our results show important neuron-glia alterations in IMG mediated by prenatal exposure to VPA, opening new clues in the understanding of ASD pathophysiology.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) faz parte da etiologia de diversas patologias neurológicas e é causa de graves sequelas. Os mecanismos patofisiológicos dessa lesão começam com o insulto imediato após a HI e se estendem por dias ou semanas, pelo aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio associada a redução da defesas anti-oxidantes e reação glial, sendo a lesão secundária parte crucial no processo que culmina no dano final. A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) que parece ter uma importante ação neuroprotetora após a HI. A acetilcolinaesterase (AChE) é responsável pela degradação da ACh, inibidores dessa enzima vêm sendo utilizados para o tratamento de danos neurológicos. Sua ação positiva sobre a HI foi demonstrada em estudos realizados em nosso laboratório, onde a administração do extrato de Huperzia quadrifariata (inibidor de AChE) reduziu os déficits cognitivos e histológicos causados por essa lesão Para avaliar os efeitos das administrações pré e pós-hipóxia de galantamina, inibidor da AChE, no modelo de HI perinatal, ratos Wistar no 7º dia de vida pós-natal (DPN7) foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) durante 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de galantamina nos grupos HI+Galantamina 5 mg/kg pré-hipóxia (HIG5-Pré), HI+Galantamina 10 mg/kg pré-hipóxia (HIG10-Pré), HI+Galantamina 5 mg/kg pós-hipóxia (HIG5-Pós) e HI+Galantamina 10 mg/kg pós-hipóxia (HIG10-Pós). Os grupos Pré receberam galantamina imediatamente antes da hipóxia e os grupos Pós nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia. No DPN45 foi feita a análise do volume das estruturas encefálicas que demonstrou a redução do volume do hipocampo do grupo HIS em relação ao Sham e uma prevenção desse efeito no grupo HIG10-Pré, mas não nos demais grupos. Análises bioquímicas foram feitas no hipocampo ipsilesional 24 horas após a lesão e revelaram: através da citometria de fluxo uma redução na sobrevivência de neurônios no grupo HIS em relação ao Sham que foi prevenida no grupo HIG10-Pré; através de ELISA uma hipertrofia dos astrócitos no grupo HIS que foi revertida no grupo HIG10-Pré e um aumento na atividade da enzima anti-oxidante catalase. O tratamento pré-hipóxia com galantamina foi capaz de prevenir os déficits histológicos, aumentar a sobrevivência celular, reduzir a reação astrocitária e aumentar a atividade anti-oxidante em ratos submetidos à HI. / Neonatal hypoxia ischemia (HI) has a role in etiology of several neurological pathologies and causes severe sequelae. The pathophysiological mechanisms of this lesion start immediately after HI and last for days or weeks, with the secondary injury being a crucial part the process that culminates in the final damage. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter of the central nervous system that seems to have an important neuroprotective action after HI. Acetylcholinesterase (AChE) degradates ACh and inhibitors of this enzyme have been used to treat neurological damage. Its positive action on HI has been demonstrated in studies performed in our laboratory, where the administration of the alkaloid extract of Huperzia quadrifariata (An inhibitor of AChE) reduced the cognitive and histological deficits caused by this lesion. To evaluate the effects of the pre and post-hypoxia administrations of galantamine, a cholinesterase inhibitor, in the model oh perinatal HI, Wistar rats in the post-natal day 7 (PND7) were subjected to a combination of unilateral occlusion of the right charotid artery and of exposure to a hypoxic exposure (8% O2) for 60 minutes. Intraperitoneal injections of saline in the groups Sham anf HI+Saline (HIS) and of galantamine in the groups HI+Galantamine 5 mg/kg pre-hypoxia (HIG5-Pre), HI+Galantamine 10 mg/kg pre-hypoxia (HIG10-Pre), HI+Galantamine 5 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post) and HI+Galantamine 10 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post). The Pre groups received galantamine immediately before hypoxia and the Post groups in the intervals of 1, 24, 48 and 72 hours after HI. On PND45 the analysis of the volume of brain structures showed a reduction of the volume of the ipsilesional hippocampus in the HIS group when compared to the sham and a prevention of this effect in the HIG10-Pre, but not in any other group. Biochemical analysis was performed in the ipsilesional hippocampus 24 hours after the lesion and revealed: a reduction of the number of surviving neurons in the HIS group when compared to the Sham that was prevented in the HIG10-Pre; a hypertrophy of the astrocytes in the HIS group that was prevented in the HIG10-Pre group and an increase in the activity of the anti-oxidant enzyme catalase in the HIG10-Pre group. The treatment with galantamine was able to prevent the histological deficits, increase the survival of neurons, reduce astrocytic reaction and increase the anti-oxidant activity in rats submitted to HI.

O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por prejuízos na comunicação e interação social, assim como por comportamentos repetitivos. O TEA pode apresentar diversas comorbidades, como alterações gastrointestinais – incluindo constipação crônica, refluxo gastroesofageal, doença celíaca e cólicas intestinais. A etiologia do TEA ainda é desconhecida, mas pode envolver alterações genéticas e a fatores de risco ambientais durante a gestação, como a exposição ao ácido valproico (VPA). Dessa forma, a exposição embrionária ao VPA tornou-se uma ferramenta confiável para a indução de alterações do tipo autista em roedores. O presente estudo teve como objetivo avaliar alterações no sistema nervoso entérico (SNE) de animais expostos ao VPA durante a gestação. Para isso, ratas Wistar prenhes receberam uma única dose (injeção intraperitoneal) de 600 mg/kg de VPA ou solução fisiológica (salina) no dia embrionário 12,5 (E12,5). A prole de machos, com 30 dias de vida pós-natal, sofreu eutanásia e então removeu-se o íleo, que passou por delaminação. No plexo mioentérico ileal foram avaliados por imunofluorescência, neurônios totais (HuC/D+), neurônios excitatórios (ChAT+), neurônios inibitórios (NOS+) e células gliais (GFAP+). A análise apresentou menor densidade neuronal nos gânglios mioentéricos ileais no grupo VPA (p<0,05); área ganglionar semelhante; mesmo perfil de densidade e corpo celular para neurônios inibitórios; menor densidade de neurônios excitatórios com maior área do corpo celular (p<0,05) e aumento no número de células gliais em 2,3 vezes (p<0,001). Dessa forma, os resultados do trabalho mostram importantes alterações neurogliais no plexo mioentérico ileal mediadas pela exposição pré-natal ao VPA, abrindo novos caminhos ao entendimento da fisiopatologia do TEA. / Autism Spectrum Disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized by social interaction and communication deficits and repetitive behavior. The ASD may present several comorbidities, as gastrointestinal alterations – including chronic constipation, gastroesophageal reflux, celiac disease and intestinal cramps. The ASD etiology might be related togenetic alteration and environmental risk factors during pregnancy, as exposure to valproic acid (VPA), which became a reliable tool for induce autism-like alterations in rodents. The present study aimed to evaluate alterations in enteric nervous system (ENS) in an animal model of ASD prenatally exposed to VPA. Pregnant Wistar females received a single intraperitoneal injection of 600 mg/kg VPA or physiological saline (Control) on embryonic day 12.5 (E12.5). The 30 days old male offspring were euthanized by perfusion, and the ileum was removed and delaminated, followed by ileal myenteric ganglia (IMG) evaluation of total neurons (HuC/D+); excitatory neurons(ChAT+); inhibitory neurons(NOS+) and glial cells (GFAP+).The results showed less total neuronal density (p<0.05); no difference in ganglionic area; no difference in the inhibitory neurons population (density and body area); decreased neuronal density and increased body area of excitatory neurons (p<0.05) and 2.3 times increased in the number of glial cells (p<0.001). In conclusion, our results show important neuron-glia alterations in IMG mediated by prenatal exposure to VPA, opening new clues in the understanding of ASD pathophysiology.

A hipóxia-isquemia neonatal (HI) faz parte da etiologia de diversas patologias neurológicas e é causa de graves sequelas. Os mecanismos patofisiológicos dessa lesão começam com o insulto imediato após a HI e se estendem por dias ou semanas, pelo aumento da liberação de espécies reativas de oxigênio associada a redução da defesas anti-oxidantes e reação glial, sendo a lesão secundária parte crucial no processo que culmina no dano final. A acetilcolina (ACh) é um neurotransmissor do sistema nervoso central (SNC) que parece ter uma importante ação neuroprotetora após a HI. A acetilcolinaesterase (AChE) é responsável pela degradação da ACh, inibidores dessa enzima vêm sendo utilizados para o tratamento de danos neurológicos. Sua ação positiva sobre a HI foi demonstrada em estudos realizados em nosso laboratório, onde a administração do extrato de Huperzia quadrifariata (inibidor de AChE) reduziu os déficits cognitivos e histológicos causados por essa lesão Para avaliar os efeitos das administrações pré e pós-hipóxia de galantamina, inibidor da AChE, no modelo de HI perinatal, ratos Wistar no 7º dia de vida pós-natal (DPN7) foram submetidos à combinação da oclusão unilateral da artéria carótida direita e exposição a uma atmosfera hipóxica (8% de O2) durante 60 minutos. Foram aplicadas injeções intraperitoniais de salina para os grupos Sham e HI+Salina (HIS) e de galantamina nos grupos HI+Galantamina 5 mg/kg pré-hipóxia (HIG5-Pré), HI+Galantamina 10 mg/kg pré-hipóxia (HIG10-Pré), HI+Galantamina 5 mg/kg pós-hipóxia (HIG5-Pós) e HI+Galantamina 10 mg/kg pós-hipóxia (HIG10-Pós). Os grupos Pré receberam galantamina imediatamente antes da hipóxia e os grupos Pós nos intervalos de 1, 24, 48 e 72 horas após a cirurgia. No DPN45 foi feita a análise do volume das estruturas encefálicas que demonstrou a redução do volume do hipocampo do grupo HIS em relação ao Sham e uma prevenção desse efeito no grupo HIG10-Pré, mas não nos demais grupos. Análises bioquímicas foram feitas no hipocampo ipsilesional 24 horas após a lesão e revelaram: através da citometria de fluxo uma redução na sobrevivência de neurônios no grupo HIS em relação ao Sham que foi prevenida no grupo HIG10-Pré; através de ELISA uma hipertrofia dos astrócitos no grupo HIS que foi revertida no grupo HIG10-Pré e um aumento na atividade da enzima anti-oxidante catalase. O tratamento pré-hipóxia com galantamina foi capaz de prevenir os déficits histológicos, aumentar a sobrevivência celular, reduzir a reação astrocitária e aumentar a atividade anti-oxidante em ratos submetidos à HI. / Neonatal hypoxia ischemia (HI) has a role in etiology of several neurological pathologies and causes severe sequelae. The pathophysiological mechanisms of this lesion start immediately after HI and last for days or weeks, with the secondary injury being a crucial part the process that culminates in the final damage. Acetylcholine (ACh) is a neurotransmitter of the central nervous system that seems to have an important neuroprotective action after HI. Acetylcholinesterase (AChE) degradates ACh and inhibitors of this enzyme have been used to treat neurological damage. Its positive action on HI has been demonstrated in studies performed in our laboratory, where the administration of the alkaloid extract of Huperzia quadrifariata (An inhibitor of AChE) reduced the cognitive and histological deficits caused by this lesion. To evaluate the effects of the pre and post-hypoxia administrations of galantamine, a cholinesterase inhibitor, in the model oh perinatal HI, Wistar rats in the post-natal day 7 (PND7) were subjected to a combination of unilateral occlusion of the right charotid artery and of exposure to a hypoxic exposure (8% O2) for 60 minutes. Intraperitoneal injections of saline in the groups Sham anf HI+Saline (HIS) and of galantamine in the groups HI+Galantamine 5 mg/kg pre-hypoxia (HIG5-Pre), HI+Galantamine 10 mg/kg pre-hypoxia (HIG10-Pre), HI+Galantamine 5 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post) and HI+Galantamine 10 mg/kg post-hypoxia (HIG5-Post). The Pre groups received galantamine immediately before hypoxia and the Post groups in the intervals of 1, 24, 48 and 72 hours after HI. On PND45 the analysis of the volume of brain structures showed a reduction of the volume of the ipsilesional hippocampus in the HIS group when compared to the sham and a prevention of this effect in the HIG10-Pre, but not in any other group. Biochemical analysis was performed in the ipsilesional hippocampus 24 hours after the lesion and revealed: a reduction of the number of surviving neurons in the HIS group when compared to the Sham that was prevented in the HIG10-Pre; a hypertrophy of the astrocytes in the HIS group that was prevented in the HIG10-Pre group and an increase in the activity of the anti-oxidant enzyme catalase in the HIG10-Pre group. The treatment with galantamine was able to prevent the histological deficits, increase the survival of neurons, reduce astrocytic reaction and increase the anti-oxidant activity in rats submitted to HI.

O Transtorno do Espectro Autista (TEA) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por prejuízos na comunicação e interação social, assim como por comportamentos repetitivos. O TEA pode apresentar diversas comorbidades, como alterações gastrointestinais – incluindo constipação crônica, refluxo gastroesofageal, doença celíaca e cólicas intestinais. A etiologia do TEA ainda é desconhecida, mas pode envolver alterações genéticas e a fatores de risco ambientais durante a gestação, como a exposição ao ácido valproico (VPA). Dessa forma, a exposição embrionária ao VPA tornou-se uma ferramenta confiável para a indução de alterações do tipo autista em roedores. O presente estudo teve como objetivo avaliar alterações no sistema nervoso entérico (SNE) de animais expostos ao VPA durante a gestação. Para isso, ratas Wistar prenhes receberam uma única dose (injeção intraperitoneal) de 600 mg/kg de VPA ou solução fisiológica (salina) no dia embrionário 12,5 (E12,5). A prole de machos, com 30 dias de vida pós-natal, sofreu eutanásia e então removeu-se o íleo, que passou por delaminação. No plexo mioentérico ileal foram avaliados por imunofluorescência, neurônios totais (HuC/D+), neurônios excitatórios (ChAT+), neurônios inibitórios (NOS+) e células gliais (GFAP+). A análise apresentou menor densidade neuronal nos gânglios mioentéricos ileais no grupo VPA (p<0,05); área ganglionar semelhante; mesmo perfil de densidade e corpo celular para neurônios inibitórios; menor densidade de neurônios excitatórios com maior área do corpo celular (p<0,05) e aumento no número de células gliais em 2,3 vezes (p<0,001). Dessa forma, os resultados do trabalho mostram importantes alterações neurogliais no plexo mioentérico ileal mediadas pela exposição pré-natal ao VPA, abrindo novos caminhos ao entendimento da fisiopatologia do TEA. / Autism Spectrum Disorder (ASD) is a neurodevelopmental disorder characterized by social interaction and communication deficits and repetitive behavior. The ASD may present several comorbidities, as gastrointestinal alterations – including chronic constipation, gastroesophageal reflux, celiac disease and intestinal cramps. The ASD etiology might be related togenetic alteration and environmental risk factors during pregnancy, as exposure to valproic acid (VPA), which became a reliable tool for induce autism-like alterations in rodents. The present study aimed to evaluate alterations in enteric nervous system (ENS) in an animal model of ASD prenatally exposed to VPA. Pregnant Wistar females received a single intraperitoneal injection of 600 mg/kg VPA or physiological saline (Control) on embryonic day 12.5 (E12.5). The 30 days old male offspring were euthanized by perfusion, and the ileum was removed and delaminated, followed by ileal myenteric ganglia (IMG) evaluation of total neurons (HuC/D+); excitatory neurons(ChAT+); inhibitory neurons(NOS+) and glial cells (GFAP+).The results showed less total neuronal density (p<0.05); no difference in ganglionic area; no difference in the inhibitory neurons population (density and body area); decreased neuronal density and increased body area of excitatory neurons (p<0.05) and 2.3 times increased in the number of glial cells (p<0.001). In conclusion, our results show important neuron-glia alterations in IMG mediated by prenatal exposure to VPA, opening new clues in the understanding of ASD pathophysiology.

A diabetes mellitus (DM) pode levar a distúrbios da motilidade gastrointestinal que podem se tornar clinicamente relevantes em alguns pacientes. Modelos de Dm em roedores indicam anormalidades morfofuncionais do sistema nervoso entérico nessa doença. Neste trabalho, avaliamos se o DM experimental pode levar a alterações na eferência colinérgica excitatória, densidade neuronal e expressão dos canais de sódio voltagemdependente (Nav) no plexo mioentérico do íleo. Hiperglicemia induzida por estreptozotocina em ratas foi desenvolvida durante oito semanas. Experimentos de imunofluorescência de tripla marcação revelaram que a densidade de neurônios por área do íleo no DM foi significativamente reduzida quando comparada ao controle. Foram observadas reduções médias de 52,2% do total de neurônios (p=0,0001); 50,0% dos neurônios colinérgicos (p=0,0068) e 54,8% dos neurônios nitrérgicos (p=0,0042). Também foram observadas reduções significativas de neurônios por área de gânglio (28,2% do total, p=0,0002; 27,7% de colinérgicos, p= 0,0002 e 32,1% de neurônios nitrérgicos, p=0,0016). A densidade de fibras colinérgicas na superfície do músculo longitudinal também foi significativamente reduzida (controle: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0,003), embora a análise western-blot não indicasse redução na expressão de ChAT no DM. grupo. A isoforma Nav1.6 foi detectada em diferentes neurônios mioentéricos e a DM tendeu a mudar o padrão de imunomarcação para neurônios de tamanho maior (297,4 ± 10 vs. 372,5 ± 8,4 µm2), mas esse efeito não foi significativo (p=0,3). Os dados de RT-qPCR não sugeriram uma alteração dos transcritos para ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 ou Nav1.7. Nossos dados confirmam a visão de que o DM crônico leva à redução das fibras colinérgicas excitatórias e da densidade neuronal. No entanto, mudanças no perfil de expressão do canal de sódio, que poderiam levar à disfunção neuronal, não foram detectadas. / Diabetes mellitus (DM) may lead to gastrointestinal motility disorders that may become clinically relevant in some patients. Rodent models of DM indicate morpho-functional abnormalities of the enteric nervous system in this disease. In this work, we have evaluated whether experimental DM can lead to changes in excitatory cholinergic efference, neuronal density and voltage-gate sodium channels (Nav) expression in the myenteric plexus of ileum. Streptozotocin-induced hiperglycemia in female rats was allowed to develop during eight weeks. Triple immunofluorescence labeling experiments revealed that the density of neurons per area of ileum in DM was significantly reduced when compared to the control. It were observed average reductions of 52.2% of total neurons (p=0.0001); 50.0% of cholinergic (p=0.0068) and 54.8% of nitrergic neurons (p=0.0042). Significant reductions of neurons per area of ganglion were also observed (28.2% of total, p=0.0002; 27.7% of cholinergic, p=0,0002 and 32.1% of nitrergic neurons, p=0.0016). The cholinergic fibers density at the surface of longitudinal muscle was also significantly reduced (control: 41 ± 2, DM: 24 ± 3%; p=0.003), although western-blot analysis did not indicate a reduction in the expression of ChAT in DM group. The Nav1.6 isoform was detected in different myenteric neurons and DM tended to shift the immunolabeling pattern towards neurons of bigger size (297.4 ± 10 vs. 372.5 ± 8.4 m2), but this effect was not significant (p=0.3). RT-qPCR data did not suggest an alteration of transcripts for ChAT, nNOS, Nav1.3, Nav1.6 or Nav1.7. Our data support the view that chronic DM leads to reduction in excitatory cholinergic fibers and neuronal density. However, changes in sodium channel expression profiling, which could lead to neuronal dysfunction, were not detected. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais