名古屋大学博士学位論文 学位の種類:博士（医療技術学） (課程) 学位授与年月日　平成22年3月25日

La maladie d’Alzheimer est une maladie très complexe, aujourd’hui encore mal comprise et cette démence est devenue un réel problème de santé publique. La protéine précurseur de l’amyloïde (APP) et la protéine Tau sont deux acteurs majeurs impliqués dans la maladie. De nombreuses recherches se sont investies dans la compréhension du métabolisme, de l’action et de l’implication de ces deux protéines dans les mécanismes pathologiques de la maladie et d’autres maladies neurodégénératives. Elles sont notamment l’objet de la plupart des approches thérapeutiques passées et actuelles, et étudiées pour le diagnostic biologique de la maladie. Dans ce projet de thèse, notre objectif fut d’explorer le métabolisme des protéines APP et Tau au cours de la différenciation neuronale à l’aide d’outils biochimiques et de systèmes innovants d’immunodétection multiplex très sensibles (MSD®) dans plusieurs modèles de culture cellulaire de la maladie. L’objectif était d’obtenir une vision globale des processus physiopathologiques au travers d’analyses d’échantillons générés au cours de la différenciation neuronale de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) de patients Alzheimer comparées aux cellules souches embryonnaires humaines (hESC). Nous avons ainsi généré et caractérisé plusieurs lignées cellulaires d’IPSC d’une personne saine contrôle et de patients atteints des formes sporadiques et familiales de la maladie. Ce projet offre l’opportunité unique de combiner des approches innovantes pour tenter de comprendre comment les fragments et les peptides Ab sont générés, ainsi que les modifications de Tau en conditions normales et pathologiques. / Amyloid precursor protein (APP) and Tau protein are two main molecular actors of the Alzheimer’s disease (AD), which is of prime importance in Human Health. Intensive research is ongoing to understand these proteins’ metabolism, action and implication in the pathological mechanism of these affections. They are the target of most therapeutic approaches and are used for biological diagnosis. In the present PhD project, our objective was to investigate neuronal APP and Tau protein processing and metabolism using biochemical tools and innovative multiplex immunodetection system (MSD®) in diverse cell culture models of AD. The goal was to get a comprehensive view oh physiopathological processes based on the analysis of samples generated in neuronal differentiated human embryonic stem cell and induced pluripotent stem cells derived from AD-patients. We generated several cell lines from an healthy control individual, and AD patients showing sporadic and familial forms of the disease. This project offer the unique opportunity to combine state-to-the-art approaches to understand how the APP fragments and peptides are generated as well as the modifications of the Tau protein in normal and pathological situation.

Les ondes millimétriques (OMM), et en particulier la bande autour de 60 GHz, sont de plus en plus utilisées pour les télécommunications sans fil. Une précédentes études in vitro menée au laboratoire avait montré, par analyse de micro-puces, une diminution d’expression de l'ARN TRPV2 dans des cultures primaires de cellules de peau humaines exposés pendant 1, 6 ou 24 heures à 60,4 GHz avec une densité de puissance incidente moyenne de 1,8 mW / cm². Afin de déterminer si l'exposition aux OMM peut aussi affecter l'expression de TRPV2 au niveau protéique, nous avons effectué des immunocytochimies sur une lignée cellulaire pseudo-neuronale en cours de différenciation (PC12), exposée à 60,4 GHz pendant 24h avec une densité de puissance incidente moyenne de 10 mW/cm². De plus, l’impact des OMM sur l’expression de plusieurs autres marqueurs impliqués dans la nociception, la différenciation neuronale et le stress protéotoxique a aussi été étudié. En utilisant un système d'imagerie semi-haut débit, permettant l'étude de multiples paramètres, nous n’avons pas trouvé de différence dans l'expression protéique des récepteurs membranaires impliqués dans la nociception TRPV1, TRPV2 et P2X3, la protéine de choc thermique Hsp70, et le marqueur neuronal β3-tubuline. Cependant, une augmentation de la poussée neuritique, bien que non significative, a été observée dans les cellules exposées. Les contrôles ont montré que cette augmentation était liée à un effet thermique des OMM. En outre, l'analyse cellule par cellule a montré qu'il n'y avait aucune sous-population distincte de cellules présentant une sensibilité particulière. Enfin, des expositions à 5 mW / cm², suivies par une analyse par HPLC, ont également été effectuées afin d’étudier l'impact des OMM sur le métabolisme dopaminergique. Aucun effet de l'exposition n’a été observé sur la recapture de la dopamine. Seul un effet thermique non significatif a été trouvé sur l'accumulation du DOPAC extracellulaire. Globalement, ces résultats négatifs sont en accord avec les précédentes études in vitro qui ont évalué l'impact des ondes millimétriques sur l'expression génétique, et sont rassurantes sur le fait que l'exposition aiguë aux OMM ne peut pas perturber significativement la physiologie cellulaire. / Millimeter waves (MWW), in particular the 60-GHz band, are increasingly used for wireless communications. A previous in vitro study conducted by our group showed, using microarray analysis, a decrease in TRPV2 RNA expression in primary human skin cells exposed for 1, 6, or 24 h at 60.4 GHz with an average incident power density of 1.8 mW/cm². To investigate if MMW exposure can also affect TRPV2 expression at the protein level, we performed immunocytochemistry on a neuron-like differentiating cell line (PC12), exposed at 60.4 GHz during 24h with an average incident power density of 10 mW/cm². Moreover, the impact of MMW on several markers involved in nociception, neuronal differentiation and proteotoxic stress was also investigated. Using a semi-high throughput imaging system, allowing the study of multiple parameters, we did not find any difference in the protein expression of pain-related membrane receptors TRPV1, TRPV2, and P2X3, heat shock protein Hsp70, and neuronal marker β3-tubulin. However, an upward trend in neurite outgrowth, although not significant, was found in exposed cells. Controls showed that this increase was related to a thermal effect of MMW. Besides, cell-by-cell analysis showed that there is no distinct subpopulation of cells with particular sensitivity. Moreover, exposures at 5 mW/cm², followed by HPLC analysis, were also done to investigate the impact of MMW on dopaminergic metabolism. No impact of exposure on dopaminergic turnover was observed. Only an insignificant thermal effect was found on extracellular DOPAC accumulation. Altogether, those negative results are in line with previous in vitro studies which assessed the impact of MMW on genetic expression, and are reassuring in the fact that acute MMW exposure cannot dramatically disrupt cell physiology.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第19230号 / 医博第4029号 / 新制||医||1011(附属図書館) / 32229 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 渡邊 直樹, 教授 斎藤 通紀, 教授 村井 俊哉 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

Constant neuroregeneration in adult olfactory epithelium maintains olfactory function by basal stem cell proliferation and differentiation to replace lost olfactory sensory neurons (OSNs). Understanding the mechanisms regulating this process could reveal potential therapeutic targets for stimulating adult olfactory neurogenesis under pathological conditions and aging. Ciliary neurotrophic factor (CNTF) in astrocytes promotes forebrain neurogenesis but its function in the olfactory system is unknown. Here, we show in mouse olfactory epithelium that CNTF is expressed in horizontal basal cells, olfactory ensheathing cells (OECs) and a small subpopulation of OSNs. CNTF receptor alpha was expressed in Mash1-positive globose basal cells (GBCs) and OECs. Thus, CNTF may affect GBCs in a paracrine manner. CNTF−/− mice did not display altered GBC proliferation or olfactory function, suggesting that CNTF is not involved in basal olfactory renewal or that they developed compensatory mechanisms. Therefore, we tested the effect of increased CNTF in wild type mice. Intranasal instillation of a focal adhesion kinase (FAK) inhibitor, FAK14, upregulated CNTF expression. FAK14 also promoted GBC proliferation, neuronal differentiation and basal stem cell self-renewal but had no effective in CNTF−/− mice, suggesting that FAK inhibition promotes olfactory neuroregeneration through CNTF, making them potential targets to treat sensorineural anosmia due to OSN loss.

Neuronal differentiation encompasses an elaborate developmental program which until recently was difficult to study in vitro. The advent of several cell lines able to differentiate in culture proved to be the turning point for gaining an understanding of molecular neuroscience. In particular the olfactory epithelium provides an attractive tool with which to investigate fundamental questions relating to neuronal differentiation, as it displays a unique capacity to regenerate and to retain a neurogenetic potential from its genesis and throughout adult life. The coordinated regulation of gene expression is fundamental to the control of neuronal differentiation. In order to reveal active processes at the molecular level and to dissect key components of molecular pathways, differential gene expression studies provide a foundation for the elucidation of dynamic molecular mechanisms. This thesis identified genes involved in neuronal differentiation by utilising a clonal olfactory receptor neuronal cell line (OLF442). Gene expression levels were identified using differential display and oligonucleotide array technology before and after serum deprivation. Differential display revealed two kinases whose expression levels were elevated during the differentiation of OLF442, identified as focal adhesion kinase (FAK) related non-kinase (FRNK) and mammalian ste20 like (MST)2 kinase. Furthermore, analysis of the oligonucleotide array data confirmed the expression of genes involved in altering presentation of extracellular matrix molecules, in mediating cytoskeletal rearrangements, and in ceasing the cell cycle, supporting the use of OLF442 as a model for studying differentiation. The differentiation of OLF442 results from the synchronisation of multiple transduction cascades and cellular responses as evidenced by the microarray data. A protein that can synchronise such signalling is the non-receptor protein tyrosine kinase, FAK. Thus the finding of the endogenous FAK inhibitor FRNK by differential display was intriguing as there was no difference in the expression level of FAK induced by differentiation, contrasting that of FRNK. This induced FRNK expression was derived autonomously as it was not responsive to the caspase-3 inhibitor, DEVD-CHO. This is particularly pertinent since the primary role of FRNK is to act as an inhibitor of FAK by competing with its substrates and reducing the phosphorylation of both FAK and its associated proteins. Differential display also revealed the upregulation of another kinase, which had 90% homology with rat MST2 kinase within the 3' UTR. Both mouse MST2 kinase (sequence submitted to GenBank, accession number AY058922) and the closely related family member MST1 kinase were sequenced and cloned. Moreover, evidence to support an autonomously expressed carboxyl-terminal domain of MST2 kinase is presented in Chapter 3 and provides a unique way in which MST2 may regulate its own activity. To further understand the role of MST in neuronal differentiation, a series of stable OLF442 transfections (with mutant and wild-type MST constructs) were carried out. MST was localised with cytoplasmic structures that may represent actin stress fibres, indicating a potential cytoskeletal role during neuronal differentiation. This indicated that MST1 may play a role in the morphological processes involved in neuronal differentiation. The identification of two kinases by differential display provided the motivation to understand the cellular context of OLF442 and to determine the phosphorylation status of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling cascades. Differentiation of OLF442 induced high-level phosphorylation of a putative B-Raf isoform, MEK2 and ERK1/2. Interestingly, there was a switch between preferential phosphorylation of MEK1 in undifferentiated OLF442 to preferential phosphorylation of MEK2 following differentiation. SAPK/JNK was also phosphorylated, as was the transcription factor c-Jun, which is a common substrate of both the ERK and SAPK/JNK signalling modules. The mapping of the cellular context of differentiating OLF442 has identified a promising model of a novel MAPK module. This consists of FAK signalling through Rap1 to ERK providing sustained activation, which is buffered or terminated by the expression of the endogenous FAK inhibitor FRNK. Furthermore, MST kinase could potentially play a role in regulating the cytoskeletal re-arrangements that are necessary for neuronal differentiation. MST kinase may signal transiently via the SAPK pathway to provide concomitant activation of c-Jun that is required for neuronal differentiation. An understanding of the gene expression pattern of the normal neuronal differentiation program allows a greater understanding of potential developmental aberrations. This could provide an opportunity for therapies to be conceived, while understanding the complexity of neuronal determination could also provide opportunities for stem cell transplantation.

Induced pluripotent stem (iPS) cells generated from patients hold great promise for studying diseases that affect the central nervous system, as differentiation into the neuronal lineage creates a limitless supply of affected cells for disease study. Rett syndrome (RTT) is a neurodevelopmental autism spectrum disorder primarily caused by mutations in the methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) gene. Due to the inaccessibility of patient neurons, most of what is known about underlying phenotypes has been described using mouse models. iPS cells provide a potential solution, but reprogramming of patient cells is hampered by low efficiency, and early methods of identifying iPS cells involve transgenic techniques that are not translatable to human patient samples. The first part of this thesis describes the generation and characterization of a pluripotency reporter to address this issue. The EOS lentiviral reporter allows real-time observation of pluripotency changes during reprogramming, and is a useful tool for more efficient isolation of reprogrammed cell lines. Further, the EOS selection system can be used in a disease context to reproducibly mark and maintain disease-specific iPS cell lines for future use in disease modelling. Though iPS cells have been used to study RTT in vitro, extensive assessments of neuron function and electrophysiology have not yet been performed. In the second part of this thesis, iPS cell lines generated from a RTT mouse model were tested for their ability to model disease in vitro. Directed differentiation of multiple Mecp2-deficient and wild-type iPS cell lines to glutamatergic neurons revealed neurons that lack Mecp2 have a smaller soma size, diminished sodium currents, and are less excitable, firing fewer, prolonged action potentials that are smaller in magnitude. This deficiency in intrinsic excitability was accompanied by a dysfunction at excitatory glutamatergic synapses, which together recapitulate changes previously observed in the Mecp2-deficient mouse brain. Having accumulated counts and recordings from hundreds of neurons with consistent responses among lines, the iPS cell system is a representative model of the neuronal and synaptic defects in RTT. These results illustrate the requirement of MeCP2 in normal neuronal function, and suggest altered neuronal homeostasis or aberrant network circuitry may underlie RTT pathogenesis.

Η πρωτεΐνη ΒΜ88 είναι νευροειδική πρωτεΐνη με ευρεία κατανομή σε κύτταρα του κεντρικού και περιφερικού νευρικού συστήματος των θηλαστικών. O βιοχημικός χαρακτηρισμός του μορίου έδειξε ότι πρόκειται για διαμεμβρανική πρωτεΐνη που εντοπίζεται κυρίως στις μεμβράνες ενδοκυττάριων οργανιδίων (μιτοχόνδρια, ενδοπλασματικό δίκτυο) ενώ το μεγαλύτερο τμήμα του μορίου της προσανατολίζεται προς το κυτταρόπλασμα. Στο ενήλικο κεντρικό νευρικό σύστημα η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται σε νευρώνες ενώ δεν ανιχνεύεται σε γλοιοκύτταρα. Αναπτυξιακά, η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 ανιχνεύεται κατά την έναρξη της νευρογένεσης στον εγκέφαλο του αρουραίου ενώ τα επίπεδα της έκφρασή της αυξάνονται µε την ηλικία και παραµένουν υψηλά στο ενήλικο ζώο. Λειτουργικά πειράματα in vitro υπερέκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 συσχετίζουν την πρωτεΐνη ΒΜ88 με την έξοδο των κυττάρων από τον κυτταρικό κύκλο και την έναρξη της διαδικασίας διαφοροποίησής τους προς νευρωνικό φαινότυπο. Τα παραπάνω δεδομένα μας ώθησαν να μελετήσουμε την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη διαδικασία της νευρογένεσης και της διαφοροποίησης των νευρώνων in vivo, έτσι ώστε να διερευνήσουμε το ρόλο της κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό επιλέξαμε ως σύστημα μελέτης τον αναπτυσσόμενο φλοιό του τελεγκεφάλου των τρωκτικών. Αρχικά χαρτογραφήθηκε η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στο φλοιό του αναπτυσσόμενου τελεγκεφάλου κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18 και πραγματοποιήθηκαν πειράματα διπλού ανοσοφθορισμού με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι μαρτύρων του κυτταρικού πολλαπλασιασμού όπως είναι η κυκλίνη D1 (μάρτυρας της φάσης G2/M του κυτταρικού κύκλου) και το ανάλογο της θυμιδίνης BrdU (που ενσωματώνεται κατά τη φάση της αντιγραφής του DNA - φάση S του κυτταρικού κύκλου). Τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες, όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα προγονικά κύτταρα του αναπτυσσόμενου φλοιού του αρουραίου και του ποντικού. Κατόπιν, διερευνήσαμε αν η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται κατά την περίοδο της νευρογένεσης ειδικά, σε προγονικά κύτταρα της γενεαλογίας των νευρώνων ή αν εκφράζεται και σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας του τελεγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν διπλές και τριπλές ανοσοϊστοχημικές χρώσεις με αντισώματα έναντι της πρωτεΐνης ΒΜ88 και έναντι νευρωνικών ή γλοιΐκών μαρτύρων, σε συνδυασμό με αντισώματα έναντι μαρτύρων κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Παρατηρήθηκε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 εκφράζεται αποκλειστικά και μόνο σε κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας και όχι σε πολλαπλασιαζόμενα ή διαφοροποιημένα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας. Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν από το γεγονός ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 προσδιορίστηκε και σε νευροεπιθηλιακά κύτταρα του τύπου «ακτινωτής γλοίας» που σύμφωνα με την τρέχουσα αντίληψη, αποτελούν την πλειοψηφία του πληθυσμού των πρόδρομων νευρογενετικών κυττάρων του φλοιού κατά την εμβρυϊκή ηλικία Ε14-Ε18. Αργότερα μόνο, τα κύτταρα αυτά θα αποτελέσουν προδρόμους της γλοιϊκής γενεαλογίας, και συγκεκριμένα μετά τη 18η εμβρυϊκή ημέρα και κατά τις πρώτες ημέρες μετά τη γέννηση. Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν συνδυαστικά πειράματα σήμανσης των πρόδρομων κυττάρων του εγκεφάλου με δύο διαφορετικούς μάρτυρες της φάσης S του κυτταρικού κύκλου, με τα οποία έγινε εφικτή η παρακολούθηση in vivo, και για το διάστημα 12 και 24 ωρών, του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της διαφοροποίησης μιας ομάδας πρόδρομων νευρικών κυττάρων. Τα πειράματα αυτά οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σχετίζεται με τις ασύμμετρες κυτταρικές διαιρέσεις, η εμφάνιση των οποίων σηματοδοτεί την έναρξη της νευρογένεσης στο φλοιό και την εμφάνιση των πρώτων μεταμιτωτικών νευρώνων. Έτσι, φαίνεται ότι η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 στα πρόδρομα νευρογενετικά κύτταρα προκαλεί την έξοδό τους από τον κυτταρικό κύκλο. Η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 μελετήθηκε και στον εγκέφαλο του ενήλικου αρουραίου όπου εντοπίστηκε, εκτός από τους ώριμους νευρώνες, και στα πρόδρομα κύτταρα του πρόσθιου μεταναστευτικού τόξου (RMS) όπου λαμβάνει χώρα η δευτερογενής νευρογένεση. Το αποτέλεσμα αυτό έρχεται σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις μας και συνδέουν επιπλέον την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 με τη διαδικασία της νευρογένεσης στον ενήλικο εγκέφαλο. Τέλος, μελετήσαμε τόσο την έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 στον αναπτυσσόμενο εγκεφαλικό φλοιό ποντικών που φέρουν τη μετάλλαξη Small eye (ποντίκια Sey/Sey). Στα ποντίκια αυτά δεν είναι λειτουργικό το γονίδιο Pax6 που είναι υπεύθυνο για την επαγωγή της νευρογένεσης στο ραχιαίο μέρος του τελεγκεφάλου. Έτσι, ο αριθμός των νευρώνων που παράγονται στο φλοιό αυτών των μεταλλαγμένων ποντικών είναι ελαττωμένος στο μισό από αυτόν που συναντάμε στα ποντίκια φυσικού τύπου. Όπως αναμενόταν, παρατηρήθηκε ότι τόσο η έκφραση της πρωτεΐνης ΒΜ88 όσο και τα επίπεδα μεταγραφής του γονιδίου ΒΜ88 είναι μειωμένα στα ποντίκια Sey/Sey. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της εργασίας μας έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 χαρακτηρίζει τη γενεαλογία των νευρώνων από τα πρόδρομα εμβρυϊκά κύτταρα μέχρι τους ώριμους νευρώνες και επομένως αποτελεί ένα νέο μάρτυρα της νευρωνικής γενεαλογίας. Επιπλέον, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη ΒΜ88 συγκεντρώνει τις απαραίτητες ιδιότητες που χαρακτηρίζουν ένα «νευρογενετικό παράγοντα». Συγκεκριμένα: α) εκφράζεται τόσο στους διαφοροποιημένους νευρώνες όσο και σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα της νευρωνικής γενεαλογίας, β) δεν εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα της γλοιϊκής γενεαλογίας, γ) εκφράζεται σε πρόδρομα κύτταρα νευρώνων κατά τη διάρκεια της νευρογένεσης στο ενήλικο άτομο και τέλος δ) η έκφρασή της μειώνεται σε ζώα που φέρουν μεταλλάξεις οι οποίες έχουν ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ελαττωματικής νευρογένεσης. Η κατανομή της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά την ανάπτυξη του εγκεφάλου καθώς και ο εντοπισμός της σε βλαστικά κύτταρα του ενήλικου εγκεφάλου, η συσχέτιση της έκφρασης του μορίου με τις ασύμμετρες νευρογενετικές κυτταρικές διαιρέσεις καθώς και η χαρακτηριστική αύξηση των επιπέδων έκφρασης της πρωτεΐνης ΒΜ88 κατά τη μετάβαση των προγονικών κυττάρων σε διαφοροποιημένους νευρώνες, όλα συνηγορούν για τη συμμετοχή του μορίου στις διαδικασίες της εξόδου από τον κυτταρικό κύκλο και τη διαφοροποίηση των νευρώνων in vivo. Οι παρατηρήσεις αυτές, όχι μόνον είναι συμβατές με προηγούμενα πειραματικά δεδομένα όσον αφορά τον προσδιορισμό του ρόλου της πρωτεΐνης σε in vitro βιολογικά συστήματα, αλλά δημιουργεί ενδιαφέρουσες προοπτικές για την αξιοποίηση της πρωτεΐνης ΒΜ88 σε θεραπευτικές προσεγγίσεις για την αντιμετώπιση νευροεκφυλιστικών ασθενειών ή/και τραυματισμών του εγκεφάλου. / BM88 is a neuron-specific protein widely expressed in the cells of the mammalian central and peripheral nervous system. Its biochemical characterization revealed that is an integral membrane protein, located at the membranes of intra-cellular organelles (mitochondria, endoplasmic reticulum) with the bulk of the protein facing towards the cytoplasm. In the adult central nervous system BM88 is expressed in neurons but it is not detected in glial cells. During development, BM8 is initially expressed at the onset of neurogenesis in the rat brain, its levels rise along age and remain high in the adult. In vitro experiments of BM88 protein over-expression suggest that BM88 is implicated in cell cycle exit and the initiation of differentiation into a neuronal phenotype. These findings lead us to study the expression of BM88 during neurogenesis and neuronal differentiation in vivo in purpose to investigate its role in brain development. For this reason, we have chosen as a model of study the developing cortex of rodent telencephalon. Initially, we investigated the distribution of BM88 protein in the developing cortex. To this end, we performed double-labeling experiments in sections from the developing rat brain at embryonic days E14 and E18 using antibodies to BM88 and markers of the cell cycle such as cyclin D1 (G2/M phase marker) and BrdU, a thymidine analogue that is incorporated during DNA replication (S phase marker). The findings from these experiments revealed that BM88 protein is expressed in the differentiated neurons as well as in actively proliferating progenitor cells of the developing cortex of rat and mouse. We next sought to investigate whether BM88 is expressed during neurogenesis specifically in the progenitor cells of the neuronal lineage or in the progenitor cells of the glial lineage of the telencephalon as well. For this reason we performed double and triple-labeling experiments with antibodies to BM88 and to markers of the neuronal or glial lineages, in combination with markers of the cell cycle. We observed that BM88 protein is expressed exclusively in the neuronal progenitors and never in the proliferating or differentiated cells of the glial lineage. The above results were supported also by the fact that BM88 protein was detected in neuroepithelial “radial glial” cells that are cells recently reported to be the majority of neuronal progenitors of the cortex during the embryonic days E14-E18. These cells will turn into glial progenitors only after the embryonic day E18 and during early postnatal days. Moreover, we developed an experimental protocol that allowed us to mark the progenitor cells of the brain with two different markers of the S phase of the cell cycle. Thus, we could observe in vivo, during a period of 12 and 24 hours, the migration and differentiation of a group of neural progenitor cells. The results from this experiment lead us to the conclusion that the expression of BM8 protein is associated with the asymmetric cell divisions that mark the onset of neurogenesis in the cortex and the appearance of the first post-mitotic neurons. Thus, it appears that the expression of BM88 protein in the neuronal progenitor cells causes their exit from the cell cycle. BM88 protein expression was also detected in the adult rat brain, not only in the mature neurons but also in the precursor cells of the rostral migratory stream (RMS), where the secondary neurogenesis occurs. This result is in accordance with our previous observations and support additionally that there is a correlation between BM88 expression and the process of neurogenesis in the adult brain. Finally, we investigated the expression of BM88 protein as well as the transcriptional levels of BM88 gene in the developing cortex of Small eye mutant mice (Sey/Sey mice). These mice lack the functional Pax6 gene that is responsible for the induction of neurogenesis in the dorsal telencephalon. Thus, the number of neurons that are produced in the cortex of the mutant mice is reduced by half in comparison to that of the wild type mice. As expected we observed reducer levels of expression both of BM88 protein and BM88 transcripts in the Sey/Sey mice. To conclude, the results of our study demonstrate that BM88 protein marks the lineage of neurons, all along from the stage of embryonic precursor cells to the stage of mature neurons, and for this reason is a new marker of the neuronal lineage. Furthermore, we showed that BM88 protei has all the characteristics that can identify a molecule as a “neurogenic factor”. More specifically: a) it is expressed both in differentiated neurons and in actively proliferating cells of the neuronal lineage, b) it is absent in the precursors of the glial lineage, c) it is present in the adult neuronal precursors, and finally d its expression is reduced in mutants with neurogenic defects. The expression pattern of BM88 protein during brain development, its presence in stem cells in the adult brain, its association with the asymmetric divisions of neurons as well as the characteristic high levels of BM88 protein expression during the neuronal transition from the progenitor stage to the differentiated stage, all together coincides to the implication of BM88 in the exit from the cell cycle and in the differentiation of neurons in vivo. These observations not only agree with previous experimental data, but also create new perspectives for the use of BM88 protein in therapeutic approaches in order to control the neurodegenerative diseases or/and brain damages.

Induced pluripotent stem (iPS) cells generated from patients hold great promise for studying diseases that affect the central nervous system, as differentiation into the neuronal lineage creates a limitless supply of affected cells for disease study. Rett syndrome (RTT) is a neurodevelopmental autism spectrum disorder primarily caused by mutations in the methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) gene. Due to the inaccessibility of patient neurons, most of what is known about underlying phenotypes has been described using mouse models. iPS cells provide a potential solution, but reprogramming of patient cells is hampered by low efficiency, and early methods of identifying iPS cells involve transgenic techniques that are not translatable to human patient samples. The first part of this thesis describes the generation and characterization of a pluripotency reporter to address this issue. The EOS lentiviral reporter allows real-time observation of pluripotency changes during reprogramming, and is a useful tool for more efficient isolation of reprogrammed cell lines. Further, the EOS selection system can be used in a disease context to reproducibly mark and maintain disease-specific iPS cell lines for future use in disease modelling. Though iPS cells have been used to study RTT in vitro, extensive assessments of neuron function and electrophysiology have not yet been performed. In the second part of this thesis, iPS cell lines generated from a RTT mouse model were tested for their ability to model disease in vitro. Directed differentiation of multiple Mecp2-deficient and wild-type iPS cell lines to glutamatergic neurons revealed neurons that lack Mecp2 have a smaller soma size, diminished sodium currents, and are less excitable, firing fewer, prolonged action potentials that are smaller in magnitude. This deficiency in intrinsic excitability was accompanied by a dysfunction at excitatory glutamatergic synapses, which together recapitulate changes previously observed in the Mecp2-deficient mouse brain. Having accumulated counts and recordings from hundreds of neurons with consistent responses among lines, the iPS cell system is a representative model of the neuronal and synaptic defects in RTT. These results illustrate the requirement of MeCP2 in normal neuronal function, and suggest altered neuronal homeostasis or aberrant network circuitry may underlie RTT pathogenesis.

Basische Helix-Loop-Helix (bHLH)-Proteine bilden eine diverse Gruppe evolutionär gut konservierter Transkriptionsfaktoren. Viele transaktivierende bHLH-Proteine werden zelltyp- oder gewebespezifisch exprimiert und fungieren als wichtige Schlüsselregulatoren zellulärer Determinations- und Differenzierungsprozesse. Die eng verwandten neuronalen bHLH-Gene Neurod1, Neurod2 und Neurod6 werden in differenzierenden Pyramidenneuronen des sich entwickelnden zerebralen Kortex exprimiert und stehen schon lange im Verdacht, deren Reifung zu steuern. In der Vergangenheit wurde jedes der drei Gene in Mäusen inaktiviert. Untersuchungen an den einfach-defizienten Tieren konnten jedoch keine wichtigen Funktionen in embryonalen Pyramidenneuronen identifizieren. Da die Aminosäuresequenzen und die Expressionsmuster der Faktoren sehr ähnlich sind, wurde angenommen, dass sie sich redundante Funktionalität teilen. Um dies zu überprüfen, habe ich Neurod2/6-doppel-defiziente Tiere gezüchtet und unter besonderer Berücksichtigung der Differenzierung von Pyramidenneuronen und der Konnektivität des zerebralen Kortex analysiert: Die Experimente zeigen, dass Neurod2 und Neurod6 tatsächlich mehrere bisher unbekannte gemeinsame Funktionen haben, wobei jeder Faktor für den Verlust des jeweils anderen kompensieren kann. Zumindest eines der beiden Gene ist notwendig für (1) die Kontrolle der radialen Migration eines Teils der Pyramidenneurone, (2) die frühe Regionalisierung des zerebralen Kortex und (3) die Bildung kortikaler Projektionen vom Neokortex zum Striatum, zum Thalamus und zur kontralateralen Hemisphäre. Callosale Axone bilden in Neurod2/6-doppel-defizienten Mäusen Faserbündel die tangential in den medialen Kortex einwachsen, aber noch vor Erreichen des ipsilateralen Cingulums und vor dem Kontakt mit der Mittellinie stoppen und defaszikulieren. Es resultiert eine neue Variante der callosalen Agenesie, die nahelegt, dass es bisher nicht identifizierte Wachstumssignale im medialen Kortex gibt. Die Expression von Neurod1, welche sich normalerweise auf die Subventrikularzone beschränkt, persistiert in radial migrierenden Pyramidenneuronen der Intermediärzone und der Kortikalplatte von Neurod2/6-doppel-defizienten Mäusen. Diese ektopische Neurod1-Expression kann dort den Verlust von Neurod2 und Neurod6 kompensieren. In einem weiteren Schritt habe ich konditionale Neurod1/2/6-tripel-defiziente Mäuse gezüchtet. In diesen Tieren wird das Neurod1-Gen durch selektive genetische Rekombination in all jenen Zellen, die über Neurod6-Promoteraktivität verfügen, irreversibel entfernt: Wie erwartet, teilt sich Neurod1 weitere gemeinsame Funktionen mit Neurod2 und Neurod6. Zumindest eines der drei Gene ist notwendig für die Differenzierung hippokampaler Pyramidenzellen und die Hemmung des programmierten Zelltods der unreifen Neuronen des Cornu Ammonis. Während die gemeinsame Inaktivierung von Neurod1/2/6 zur Aplasie des Hippocampus führt, überlebt ein Großteil der neokortikalen Pyramidenzellen. Die terminale neuronale Differenzierung ist jedoch auch im Neokortex gestört und die neokortikale Konnektivität sehr stark reduziert. Diese Arbeit zeigt, dass die Transkriptionsfaktoren der NeuroD-Familie gemeinsam die Differenzierung, das Überleben, die Migration und das axonale Wachstum von pyramidalen Neuronen des sich entwickelnden zerebralen Kortex steuern. Während der Embryonalentwicklung ergeben sich folgende, teils überschneidende Funktionen der NeuroD-Gene: Die Differenzierung und das Überleben von hippocampalen Körnerzellen ist abhängig von Neurod1. Die frühen Schritte der Differenzierung von hippocampalen Pyramidenneuronen und deren Überleben sind eine Funktion von wahlweise Neurod1, Neurod2 oder Neurod6. Spätere neuronale Differenzierungsschritte, die Regionalisierung des Neokortex und das gezielte Wachstum wichtiger neokortikaler Faserzüge basieren auf Funktionen von Neurod2 oder Neurod6, aber nicht von Neurod1. Der postnatale Umbau des somatosensorischen Kortex und die funktionale Integration thalamischer Afferenzen wurden bereits als strikt Neurod2-abhängig beschrieben.