L’expression synaptique de la sous-unité α5 des récepteurs GABAA (α5-RGABAA) a été montrée dans les interneurones (INs) inhibiteurs de la zone CA1 de l’hippocampe. Cependant, les types de synapses qui expriment cette α5-RGABAA et son rôle fonctionnel n’ont pas encore été déterminés. En utilisant une association d’enregistrements de "patch-clamp" en configuration cellule entière, d’optogénétique et de la technique d’immunohistochimie, nous avons étudié l’expression synaptique de la α5-RGABAA et ses modifications dans un modèle animal d’épilepsie du lobe temporal (ELT). Nos données montrent que la α5-RGABAA est exprimée aux synapses inhibitrices formées par le réseau de cellules qui expriment la calrétinine (CR+) sur différents types d’INs du stratum oriens-alveus (O/A) de l’hippocampe. De plus, nous avons observé un déclin précoce de la α5-RGABAA dans les INs de l’O/A pendant l’ELT ce qui pourrait contribuer à la désinhibition et à l’hyperexcitabilité de ces INs et aurait donc des conséquences sur l’activité du réseau entier.

Comme son titre l’indique, ce mémoire porte sur la modélisation de l’activation des neurones excitateurs du cerveau, plus particulièrement dans l’hippocampe. L’étude de cette zone est particulièrement importante car elle joue un rôle de premier plan dans les processus de mémorisation et d’apprentissage. À partir d’un cerveau de rat tranché en fines lamelles, quelques synapses (avec leur environnement) ont été reconstruites en trois dimensions. Puis, grâce au logiciel de simulation par éléments finis COMSOL, il a été possible de vérifier l’impact de différents facteurs (pré et postsynaptiques) sur l’activation des récepteurs AMPA et NMDA. Ce qui différencie les présentes simulations, c’est le souci de créer un environnement le plus réaliste possible, principalement en ce qui a trait à la géométrie, à la température ainsi qu’au phénomène de «spillover».

La potentialisation synaptique dans les neurones d'hippocampes repose sur l'activation du récepteur NMDA (NMDAR) et l'influx de Ca²⁺. Des changements dans le Ca²⁺ cytosolique sont détectés par des effecteurs tels que la calpaïne et la protéine kinase II Ca²⁺/calmoduline-dépendante (CaMKII), transformant ces informations en signaux qui induisent une potentialisation synaptique. Une fois activée par l'influx de Ca²⁺, la calpaïne clive de nombreuses protéines cytosoliques, récepteurs et protéines d'échafaudage, remodelant ainsi la structure synaptique, ainsi que l'activité et/ou la dynamique de nombreuses protéines. Le rôle de la calpaïne au cours du processus de plasticité synaptique a été documenté, mais le mécanisme moléculaire est loin d'être clair. Dans cette étude, nous avons examiné le lien possible entre la calpaïne et CaMKII dans la médiation de la potentialisation à long terme (LTP). Nous avons utilisé des inhibiteurs pharmacologiques de la calpaïne pour interférer avec son activation lors de la potentialisation synaptique induite chimiquement dans des cultures dissociées d'hippocampe de rat. Nous avons d'abord confirmé que l'activité de la calpaïne est essentielle pour l'induction de la LTP dans les cultures neuronales dissociées. Nous montrons que l'activité de la calpaïne est essentielle pour de nombreux processus moléculaires importants pour la LTP. L'inhibition de l'activité de la calpaïne a bloqué la phosphorylation de ERK et l'insertion des récepteurs synaptiques AMPA; deux processus régulés par CaMKII impliqués dans la potentialisation synaptique. De plus, nous montrons que la calpaïne est essentielle pour l'autophosphorylation de CaMKII en utilisant un anticorps contre pCaMKII (Thr286). En mesurant le temps de vie par fluorescence (FLIM) avec un capteur basé sur le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) (Camui) de l'activation de CaMKII, nous montrons que l'inhibition de la calpaïne empêche le changement dépendant de l'activité de la conformation de l'holoenzyme CaMKII et donc l'activation de la kinase. Nous avons aussi utilisé l'imagerie time-lapse et avons découvert que la translocation CaMKII post-synaptique dépendante de l'activité est diminuée par les inhibiteurs de la calpaïne. De plus, nous avons mesuré les taux de diffusion de CaMKII par SPT-PALM en utilisant CaMKII-meos2 et les résultats indiquent que l'inhibition de la calpaïne empêche la diminution dépendante de l'activité de la mobilité de l'holoenzyme. Nos résultats montrent clairement que les inhibiteurs de la calpaïne affectent la dynamique de CaMKII. Cela suggère que la calpaïne affecte directement CaMKII ou agit en amont de CaMKII. En effectuant des expériences dans des cellules HEK qui n'ont pas de CaMKII endogène, nous avons démontré que la calpaïne n'affecte pas directement CaMKII. Nous avons émis l'hypothèse que la calpaïne joue un rôle dans le processus de plasticité en amont de CaMKII. Nous avons étudié l'influx Ca²⁺ dépendant de l'activité en utilisant l'imagerie GCaMP6 et nos résultats indiquent que l'activité de la calpaïne est essentielle pour cette l'augmentation de Ca²⁺. En disséquant davantage la voie de signalisation, utilisant différents protocoles de stimulation (dépolarisation synaptique ou globale), nous montrons que la calpaïne affecte l'afflux de Ca²⁺ dépendant de NMDA et non l'influx de Ca²⁺ dépendant de la dépolarisation. Ainsi, notre étude montre que la calpaïne joue un rôle essentiel dans la LTP d'une manière dépendante du NMDAR et que l'inhibition de la calpaïne interfère dans les premières étapes de la signalisation médiée par le Ca²⁺ conduisant à l'induction du LTP. En discutant de ces résultats, nous fournissons des résultats préliminaires qui peuvent nous éclairer au niveau de l'impact de l'inhibition pharmacologique de la calpaïne sur la fonction des récepteurs NMDA. / Synaptic potentiation in hippocampal neurons relies on NMDA receptor (NMDAR) activation and Ca²⁺ influx. Changes in cytosolic Ca²⁺ are detected by effectors such as calpain and Ca²⁺/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII), transforming this information into signals inducing synaptic potentiation. Once activated by Ca²⁺ influx, calpain cleaves many cytosolic proteins, receptors, and scaffolding proteins, thereby remodeling the synaptic structure, as well as the activity and/or dynamics of many proteins. The role of calpain during the synaptic plasticity process has been documented, but the molecular mechanism is far from clear. In this study, we examined the possible link between calpain and CaMKII in the mediation of Long Term Potentiation (LTP). We used pharmacological inhibitors of calpain to interfere with its activation during chemically induced synaptic potentiation in rat hippocampal dissociated cultures. We first confirmed that calpain activity is essential for LTP induction in dissociated neuronal cultures. We show that calpain activity is essential for many molecular processes important for LTP. Inhibition of calpain activity blocked ERK phosphorylation and insertion of synaptic AMPA receptors - two CaMKII-regulated processes involved in synaptic potentiation. Further, we show that calpain is essential for CaMKII autophosphorylation by using an antibody against pCaMKII (Thr286). By performing Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based sensor (Camui) of CaMKII activation, we show that calpain inhibition prevents activity-dependent change in the conformation of the CaMKII holoenzyme and thus the activation of the kinase. We further used time-lapse imaging and found that activity-dependent post-synaptic CaMKII translocation is decreased by calpain inhibitors. Furthermore, we measured diffusion rates of CaMKII by SPT-PALM using CaMKII-meos2 and the results indicate that calpain inhibition prevents the activity-dependent decrease in the mobility of the holoenzyme. Our results clearly show that calpain inhibitors affect CaMKII dynamics. This suggests that either calpain affects CaMKII directly or is upstream to CaMKII. By performing experiments in HEK cells that do not have endogenous CaMKII, we demonstrated that calpain does not affect CaMKII directly. We hypothesized that calpain plays a role in the plasticity process at an upstream level to CaMKII. We investigated activity-dependent Ca²⁺ influx using GCaMP6 imaging and our results indicate that calpain activity is essential for this increase in Ca²⁺. Further dissecting the pathway, using different stimulation protocols (synaptic or global depolarisation), we show that calpain affects NMDA-dependent Ca²⁺ influx and not the depolarisation dependent Ca²⁺ influx. Thus, our study shows that calpain plays an essential role in LTP in an NMDAR dependent manner and that inhibiting calpain interferes in the early steps of Ca²⁺- mediated signaling leading to LTP induction. In discussing these results, we provide preliminary results that may shed light on the impact of pharmacological inhibition of calpain on NMDA receptor function.

La membrane cellulaire est un environnement très dynamique où diffusent plusieurs familles de protéines. Pour assurer la communication entre neurones, certains récepteurs membranaires diffusant librement doivent être stabilisés aux jonctions de communication neuronales: les synapses. Des changements dans le comportement diffusif de ces récepteurs induisent des variations de leurs populations à la synapse. La capacité d'observer ces protéines diffuser individuellement est donc importante pour mieux comprendre certains mécanismes cellulaires associés au fonctionnement du système nerveux. Alors que les fluorophores organiques (Alexa, Atto, ...) et génétiquement encodées (GFP, RFP, ...) photoblanchissent rapidement, les nanocristaux semi-conducteurs fluorescents (points quantiques: QDs) sont photo-stables, ce qui permet de suivre les protéines marquées sur de plus longues périodes. Même si la structure cristalline du QD dépasse rarement les 10nm de diamètre, la taille de la sonde fonctionnalisée, une fois équipée d'un enrobage hydrophile et de protéines d'hameçonnage, est d'environ 30 nm, limitant leur accessibilité dans la fente synaptique (environ 20 nm). De plus, la multivalence des versions commerciales des QDs fonctionnalisés pose problème, en leur permettant de lier plusieurs récepteurs à la fois. Dans ce mémoire, nous présentons donc différentes approches pour la biofonctionnalisation de petit QDs monovalents, ainsi que les principales stratégies pour marquer des récepteurs synaptiques uniques à partir de QDs. De plus, nous présentons une étude de la diffusion de récepteurs synaptiques diffusant à l'intérieur et à l'extérieur de synapses et comparons les résultats en fonction des 2 types de sondes utilisés : QDs enrobés d'anticorps et QDs enrobés de streptavidine. Ces travaux devraient contribuer à l'optimisation d'une approche pour suivre les dynamiques des récepteurs synaptiques dans des modèles de plasticité synaptique.